細胞外小胞の保存と容易な保存のための有望な技術としてのナノファイバー形成

Scientific Reports volume 12、記事番号: 22012 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細胞外小胞（EV）は、細胞由来の膜に包まれた粒子であり、将来の幅広い治療用途の可能性を秘めています。しかし、EV はほとんどの場合直接注射によって投与されており、注射部位からの急速なクリアランスにより効果が妨げられる可能性があります。本研究は、中サイズの細胞外小胞（mEV）を高速溶解エレクトロスピニングされたポリビニルピロリドンベースのナノファイバーに組み込み、得られるナノファイバー製剤の保存依存性の構造と活性の関係を調査することを目的としました。エレクトロスピニングプロセスには、ポリビニルピロリドンベースの前駆体水溶液が選択されました。エレクトロスピニングされたサンプル中の EV の存在は、透過型電子顕微鏡、フローサイトメトリー、および共焦点レーザー走査顕微鏡によって確認されました。結果は、サンプルの繊維構造が 12 週間の保存期間の終わりまで保存されたことを示しています。さらに、保存温度 (4 °C または室温) に関係なく、ナノファイバーおよびナノファイバー関連 EV は実験期間を通じて存在しました。 EV を安定した固体ポリマー送達ベースに組み込むと、EV の安定性が維持される可能性があります。一方、ポリマーの特性に応じて、それらの目標を定めた制御された放出を達成することができます。

細胞外小胞（EV）は、サイズと生合成が異なる脂質二重層で区切られた小さな小胞で、多小胞体/角形体または細胞膜から自然に放出され、体液に入ります1。生理活性物質の天然の生体適合性担体としての細胞恒常性、細胞間コミュニケーション、免疫応答におけるそれらの生理学的役割に加えて、最近では薬物送達手段としてのそれらの使用に関心が向けられています2,3。 EV により、小胞にカプセル化された薬物の効率的な内部移行が可能になります 4,5。 EV はレシピエント細胞に取り込まれるため、一次治療薬または薬物送達媒体としての応用が可能になります。

間葉系幹細胞由来の EV (MSC-EV) は、組織再生において有望な可能性を示しています。しかし、それらの治療可能性は、急速な減少と短い半減期によって制限されています6。単離された EV への薬物の外因性取り込みのためのさまざまなアプローチが記載されており、単純なインキュベーション、親油性分子、または凍結融解の繰り返しやサポニンによる透過処理、押出成形、超音波処理、エレクトロポレーションなどの疎水化化合物のアクティブローディング技術に至るまで、さまざまなアプローチが報告されています。 EV にカプセル化された分子は、タンパク質、mRNA、miRNA などの機能的に活性な生物学的物質であり、周囲の標的細胞や血管やリンパ管を介して離れた臓器にシグナルを伝達することができます8。生物製剤の構造の複雑さは、特に安定性に関して、製剤と送達にさらなる課題を引き起こす可能性があります。標的組織に到達するために、EV は静脈内、腹腔内、経口、鼻腔内、皮下などのさまざまな経路で投与できます。しかし、EV はほとんどの場合直接注射として投与されており、注射部位からの急速な流出により効果が阻害される可能性があります9。非標的臓器におけるEVの毒性作用を最小限に抑え、意図した治療効果を最大化するには、単離されたEVを、その放出を制御できる生体材料に組み込む必要があります。

EV は細胞培養の馴化培地から分離できます。馴化培地の保存に関して、国際細胞外小胞協会（MISEV2018）は、-80 °C での表面 10 への EV の付着を防ぐために、シリコン処理した容器内で -80 °C のリン酸緩衝生理食塩水中で EV を保存することを推奨しています。

最近では、HEPES、ヒト血清アルブミン、トレハロースを含む PBS 11。ただし、この保管条件の使用は、コストと輸送上の課題によって制限される場合があります。

したがって、EV の保存安定性を向上させるには代替ソリューションが必要です12。いくつかの以前の研究 13,14 に基づいて、ナノファイバーに EV を埋め込むことが、EV の安定性の問題を克服する良い解決策である可能性があると結論付けることができます。細胞はエレクトロスピニング後も生存し続けることが示されており、得られた細胞充填ファイバーはさまざまな治療用途に使用できます。 Trindade et al.15 は、EV の負荷を迅速に評価できるようにするために、急速に溶解する足場を開発しました。彼らは、単一流体エレクトロスピニングで生物材料を処理する場合、溶媒の選択が特に重要であることを発見しました。トリフルオロエタノールは生体サンプルに対して穏やかな溶媒であるため、エタノールの代わりに使用されました16。エレクトロスピニングは、高速でコスト効率が高く、拡張性があり、室温で複雑なナノ繊維構造を形成できる技術であり、敏感な活性物質の配合に適しています。

私たちのプロジェクトでは、エレクトロスピニングされたナノ繊維配合物のベースとしてポリビニルピロリドン (PVP) が選択されました。 PVP は不活性、非毒性、生体適合性ポリマーであり、従来の製剤と新規の制御または標的送達システムの両方にとって多用途の賦形剤であり、結合剤、コーティング剤、懸濁剤、細孔形成剤、可溶化剤、安定剤などとして機能します。 . 分子量と濃度の異なる PVP は、さまざまな目的に応じてさまざまな製剤に使用されます。水溶性、親水性、水素結合形成能力により、医薬品有効成分の生物学的利用能と安定性を向上させ、製剤の物理化学的安定性を向上させ、薬物の放出速度を調整し、生体内での持続時間を延長することができます。リポソームの循環時間17,18。

mEV を含むナノ繊維サンプルは即時に溶解できるため、マトリックスの優れた水溶性特性が不可欠です。さらに、PVP は優れたエレクトロスピニング特性も備えているため、繊維形成プロセスに最適です 19,20,21,22。 EVの構造を維持するには等張溶液が必要ですが、溶液の表面張力が増加するため、安定した繊維形成プロセスがより困難になります。他にも医薬製剤に一般的に使用されるセルロース誘導体などの他の親水性生体適合性ポリマーがありますが、等張溶液からはもちろん、水溶液からの繊維形成も困難です23、24、25。しかし、セルロースナノファイバーは自然にナノ多孔質ネットワークを形成します。したがって、セルロースナノファイバーの細孔サイズに近いナノサイズのEVを捕捉できる可能性があります。さらに、水素結合、静電力、その他の特定の相互作用などのさまざまな化学相互作用により、分離効率が向上する可能性があります26。

単離および処理された治療用EVを最適に保存する方法についての理解が深まることで、EVベースのアプローチが、新しい種類の有望な治療薬および薬物担体としての多用途の可能性を最大限に発揮できるようになるでしょう。したがって、本研究は、前駆体水溶液から調製された生分解性の速溶解エレクトロスピニングされたPVPベースのナノファイバーへのEVの組み込みを調査し、得られたナノファイバー製剤の保存依存性の構造活性関係を調査することを目的としています。ナノ繊維製剤の特性評価には、形態、物理化学的特性、および保存安定性の評価が含まれます。

配合のベースとして、生分解性、生体適合性の高いエレクトロスピニング可能なポリマー、ポリビニルピロリドン (PVP、Kollidon K90、平均分子量、Mw ~ 1,500,000 g mol-1 (Merck Ltd、ブダペスト、ハンガリー) が選択されました。ポリソルベート 80 (Molar Chemicals Ltd.、ブダペスト) 、ハンガリー）は、溶液の表面張力を低下させ、等張前駆体溶液の繊維形成能力を高めるために使用されました. 塩化ナトリウム（Molar Chemicals、ハンガリー、ブダペスト）は、PVP ベースの前駆体溶液の等張化に使用されました。溶液の調製には、薬局方グレードの蒸留水をさらに精製せずに使用しました。

HEK293T-palmGFP 細胞株は、Charles Lai および Xandra Breakefield のご厚意により提供されました。 HEK293T-palmGFP 細胞を、10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS)、1000 U/L ペニシリン、1000 U/L ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、および 1 g/L グルコースを含む DMEM 中で培養しました。細胞は、5% (v/v) CO2 の加湿雰囲気中で 37 °C に維持されました。細胞培養物のマイコプラズマ感染状態をモニタリングした。 FBS 除去の 24 時間後に、8 つの 182.5 cm2 処理表面フラスコ (VWR、米国) から馴化培地を収集しました。継代数は 16 ～ 22 の範囲で、細胞培養は 80 ～ 90% のコンフルエンスに達し、分離あたり 179 × 106 ± 69.3 × 106 細胞を表しました。 EV の分離中、細胞生存率はトリパンブルー染色と TO-PRO-3 およびアネキシン V で染色するフローサイトメトリーによって測定されました。EV の分離中、馴化培地は 300 g、4 °C で 10 分間遠心分離され、濾過されました。 5 μm セルストレーナー (Millipore、米国) を使用して。大きなサイズの Ev は、2000 g、4 °C、30 分間で除去されました。 mEV は、12,500 g、4 °C、40 分間で上清から分離されました。 mEV ペレットを NaCl-HEPES (10 mM、12,500 g、4 ℃、40 分) で 1 回洗浄しました。 mEV ペレットを 100 μL NaCl-HEPES (10 mM) に再懸濁しました。 50 μL (1.6 × 109 ± 6.7 × 108 粒子) を使用して mEV 含有 PVP ナノファイバー (PVP-mEV) を形成し、42 μL (1.3 × 109 ± 5.6 × 108 粒子) を使用して遊離 mEV コントロールサンプルを生成し、8 μL を使用して mEV 画分を特徴付けました。 mEV の存在は、透過型電子顕微鏡 (TEM)、フローサイトメトリー、ナノ粒子追跡分析 (NTA)、タンパク質および脂質の定量によって確認されました。遠心分離ステップの詳細なパラメーターを表 S1 にまとめます。

Evs の形態は透過型電子顕微鏡 (TEM) によって検査されました。サンプルは、Théry らの研究に基づいて若干の変更を加えて調製されました 27。簡単に説明すると、2 ～ 3 μL のサンプルをホルムバールでコーティングされたグリッド (Sigma、米国) 上に置き、室温 (RT) で 10 分間インキュベートしました。残留溶液を除去し、２％グルタルアルデヒドで１０分間固定した。グリッドを 5 分間 3 回洗浄し、シュウ酸ウラニルでコントラストを高めました。サンプルをさらに対比し、4% (w/v) 酢酸ウラニルと 2% (w/v) メチルセルロースの混合物に埋め込みました。サンプルは JEOL 1011 TEM (日本電子株式会社、東京、日本) でテストされました。

mEV のサイズ分布、中央値サイズ、および粒子濃度は、NTA を使用して決定されました。測定は、ZetaVIEW ソフトウェアを使用して ZetaView PMX-120 (Particle Metrix GmbH、メーアブッシュ、ドイツ) で実行されました。測定のパラメータは補足表2にまとめられています。純粋なPVPファイバーの溶解後に検出された粒子の数が大幅に増加したため、NTAはPVPファイバーに埋め込まれたmEVの特性評価には適していませんでした（図S1）。

タンパク質濃度は、3 ～ 4 回の凍結融解サイクルと超音波処理 (10 分間、4 °C) によって EV サンプルを調製した Micro BCA アッセイ (ThermoFisher、米国) を使用して測定しました。脂質含量は、Visnovitz et al., 201928 によって最適化されたスルホホスホバニリン脂質アッセイによって測定されました。

mEV は、GFP、AnnexinV、CD81、および CD63 の検出に基づいて、CytoFLEX S フローサイトメーター (Beckman Coulter、米国) によって特性評価されました。 mEV を、蛍光色素結合アネキシン V または抗体を含むアネキシン結合緩衝液 (AxBB、10 mM HEPES、0.14 M NaCl、2.5 mM CaCl2) で希釈しました。以下の試薬を使用しました: AnnexinV-AF647 (1:200、Sony Biotechnology、米国)、モノクローナル抗ヒト CD81-PerCP-Cy5.5 (1:200、アイソタイプ: マウス IgG1、クローン: 5A6、Sony Biotechnology、米国) 、モノクローナル抗ヒト CD63-PerCP-Cy5.5 (1:200、アイソタイプ: マウス IgG1、クローン: H5C6、Sony Biotechnology、USA)、モノクローナルマウス IgG1-PerCP-Cy5.5 (1:200、クローン: MOPC21、ソニーバイオテクノロジー社、米国）。 15 分間のインキュベーション後、サンプルを中程度の流速 (30 μL/分) で 1 分間分析しました。ｍＥＶの存在は、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（０．１％、ＭｏｌａｒＣｈｅｍｉｃａｌｓＫｆｔ．、ブダペスト、ハンガリー）溶解によって確認された。生データは FlowJo-V10 ソフトウェアで処理されました。この実験で使用したすべての抗体を表 S3 に示します。

ニートおよびｍＥＶをロードした１５％（ｗ／ｗ）ＰＶＰポリマー前駆体水溶液をＮａＣｌで等張にし、繊維形成プロセスに使用した。等張溶液の導電率および表面張力の増加による繊維形成能力を改善するために、ポリソルベート 80 を 1% (w/w) で添加しました。

実験室サイズのエレクトロスピニング装置 (SpinSplit Ltd.、ブダペスト、ハンガリー) を使用して、繊維状サンプルを調製しました。プラスチック注射器（ハンガリー、ブダペストのメルク社のルアーロック注射器）に入れた均質な前駆体溶液を、テフロンチューブを備えた従来のエミッター（２２Ｇ）に接続した。シリンジポンプは、前駆体溶液の連続流量を提供しました。ファイバー形成プロセス中の印加電圧は 22 ～ 23 kV、エミッターとコレクターの距離は 20 cm、流量は 0.08 μL/秒でした。エレクトロスピニング実験は、温度 22 ± 1 °C、湿度 40 ± 5% のよく調整された部屋で実行されました。

エレクトロスピニングされたサンプルの形態学的分析は、金でスパッタリングした後、JEOL JSM-6380LA タイプの走査型電子顕微鏡 (SEM) (日本電子株式会社、東京、日本) を使用して実行されました。測定は加速電圧15 kV、サンプル距離10 mmで実施しました。アルミニウム箔上に形成されたサンプルを両面カーボン接着剤で銅インゴットに貼り付け、金メッキ後に複数の倍率で検査しました。繊維直径は ImageJ ソフトウェア (米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国) で測定し、平均繊維直径は 3500 倍の倍率でランダムに選択された 100 本の異なる個々の繊維に基づいて計算されました。

4℃または室温に保った遊離mEVおよびPVP-mEVの安定性を、フローサイトメーターを用いて週に2回、12週間モニタリングした。スパチュラを使用してＰＶＰ−ｍＥＶナノチューブをアルミニウム箔の表面から除去し、化学天秤を使用してエッペンドルフチューブ内の質量を測定した。 PVP-mEV ナノチューブを AxBB に溶解しました (33.9 ± 3.7 μL AxBB/1 mg PVP-mEV)。ブランクのPVPナノファイバーを対照として使用した。 PVP、PVP-mEV、および遊離 mEV サンプルを、抗体または AnnexinV 含有 AxBB 溶液で 10 倍に希釈しました。アネキシン V-AF647 (1:200、Sony Biotechnology、米国)、モノクローナル抗ヒト CD81-PerCP-Cy5.5 (1:200、アイソタイプ: マウス IgG1、クローン: 5A6、Sony Biotechnology、米国)、モノクローナルマウス IgG1- PerCP-Cy5.5 (1:200、クローン: MOPC21、Sony Biotechnology、USA) を使用しました。 15 分間のインキュベーション後、サンプルを 5 倍に希釈し、CytoFLEX S フローサイトメーター (Beckman Coulter、米国) を用いて中流速 (30 μL/分) で 1 分間測定しました。計数ビーズを 20 倍希釈で使用し (Count Check Beads-High、2.436 × 105 ビーズ/mL、Sysmex、ドイツ)、次の方程式に基づいて mEV 数を決定しました。

mEV の完全性は、TritonX-100 (0.1%) による溶解によってチェックされました。 FlowJo-V10 ソフトウェアを使用して生データを分析しました。この実験で使用したすべての抗体を表 S3 に示します。

4 °C または RT に保たれた PVP-mEV サンプルの安定性を、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して週に 4 回、12 週間モニタリングしました。 PVP-mEV ナノチューブは、24 × 32 mm のカバースリップ (VWR、米国) で入手できました。カバーガラスを Leica TCS SP8 共焦点レーザー走査顕微鏡 (Leica、ドイツ) で検査しました。顕微鏡を逆に配置することで、ナノチューブに関連する mEV の存在を高解像度で検出することができました (底部と上部に浸漬油を使用しました)。サンプルは同じ設定でテストされました: 63 × 対物レンズ、0.9% レーザー (488 nm) 出力、屈折率: 1.516、16 ライン平均、3064 × 3064 解像度。 GFP 蛍光シグナルは、300 V PMT の可視光を使用するハイブリッド検出器によって検出されました。

値は平均値±標準誤差として表示されます。統計分析と数値は、GraphPad Prism 7.00 (USA) ソフトウェアを使用して作成されました。データを比較するために、二元配置 ANOVA と Tukey の事後検定が使用されました。 0.05 未満の p 値は統計的に有意であると認められました。

mEV は、HEK293T-palmGFP 細胞の馴化培地から分離されました。細胞生存率は 93.3 ± 0.9% (トリパンブルー染色あり) でした。フローサイトメトリー測定に基づくと、アポトーシス細胞 (AnnexinV+) と二次壊死細胞 (AnnexinV+、TO-PRO-3+) の割合は、それぞれ 3.9 ± 2.0% と 5.8 ± 2.1% でした (図 1A)。 mEV のサイズ分布は NTA によって決定され (図 1B)、それに基づいてそれらのサイズの中央値は 332.4 ± 25.7 nm でした (図 1C)。粒子数は 1.7 × 106 ± 2.2 × 105/105 細胞でした (図 1D)。 mEV のタンパク質/脂質比は 3.0 ± 2.5 でした (図 1E)。フローサイトメトリー測定に基づくと、mEV は GFP、AnnexinV、CD81、および CD63 陽性であり、Triton X-100 溶解に対して感受性がありました (図 1F)。

HEK293T-palmGFP 由来の遊離 mEV の特性評価。細胞の生存率はフローサイトメトリーによって分析されました (A)。ナノ粒子追跡分析 (NTA) により、mEV のサイズ分布 (B)、中央サイズ (C)、および粒子濃度 (D) を決定しました。タンパク質と脂質の含有量に基づいて小胞を定量しました (E)。 GFP、外部化されたホスファチジルセリン (アネキシン V で染色)、CD81 および CD63 の存在がフローサイトメトリーによって検出されました (F)。 (AB: 抗体による抗原特異的染色、Tx: Triton X-100、IC: アイソタイプコントロール) (図は、GraphPad Prism 7.00 for Windows、GraphPad Software、San Diego、California USA、http://www.graphpad を使用して作成されました。 com）。

エレクトロスピニングされたサンプルの形態学的特徴付けは、SEM によって実行されました。この画像は、前駆体溶液へのベシクルの添加が繊維形成に悪影響を及ぼさないことを示しています（図 2A）。465 nm ± 62 nm の平均繊維直径 ± 標準偏差で、一見正規分布のように見える明確な繊維構造が得られました（図 2A）。 2B）。繊維の表面は滑らかで、溶液と繊維製造パラメータの両方が繊維製造に適切であることを示しています。

中サイズの細胞外小胞（mEV）を含むPVPベースの前駆体溶液から調製したエレクトロスピニングサンプルのSEM画像（倍率：2500×）（A）およびサンプルの繊維径分布（B）。

遊離 mEV および PVP-mEV サンプルは、フローサイトメトリー、共焦点レーザー走査顕微鏡、および TEM によって特性評価されました (図 3A ～ C)。遊離 mEV と比較して、PVP-mEV の GFP 蛍光強度中央値 (MFI) は減少し、Violet-SSC 値に基づくサイズ分布の標準偏差は増加しました。遊離 mEV は Triton X-100 溶解に対して感受性がありましたが、PVP-mEV の数は大きく変化しませんでした。 CD81 EV マーカーに関しては、遊離 mEV は PVP-mEV と比較して高い MFI 値を示しました。遊離 mEV は AnnexinV 陽性を示しました。対照的に、PVP-mEV は AnnexinV 陰性でした (図 3A)。

フリーの mEV と mEV をロードした PVP ファイバー (PVP-mEV) の比較。遊離 mEV と PVP-mEV は、GFP シグナル、TritonX-100 溶解、CD81、およびホスファチジルセリン (AnnexinV) マーカーに基づくフローサイトメトリーによって比較されました (A)。 mEV は GFP 蛍光に基づいて検出され、ナノファイバーは共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して可視光で検出されました (B)。 mEV の存在と形態は透過型電子顕微鏡 (TEM) によって確認されました (C)。 (AB: 抗体による抗原特異的染色、Tx: Triton X-100)。

mEVの存在は、共焦点レーザー走査顕微鏡法によって検出されました。どちらのサンプルでも、GFP の蛍光シグナルに基づいてその存在を検出することに成功しました。 PVP-mEV サンプルの場合、mEV はナノファイバーに結合した形で存在することがわかります (図 3B)。溶解後の遊離 mEV および PVP-mEV の形態を TEM によって特徴付けました。両方のサンプルで mEV を特定できました (図 3C)。

遊離 mEV サンプルと PVP-mEV サンプルの間で観察された違いは、PVP が水素結合を通じて脂質ベースのナノ粒子の表面に付着できるという事実によって説明できます 29。これは、ナノ粒子に安定性を提供し、凝集から保護できる高分子保護シェルを形成します 30。 PVP は電気的に中性であるため、タンパク質のリポソームへの結合を減少させることができます 31。リポソームと EV は多くの点で同様に動作するため、mEV の周囲に PVP シェルが形成される可能性があると考えられます。 PVP シェルの存在により、CD81 およびホスファチジルセリンの抗体および AnnexinV へのアクセス可能性が低下する可能性があります。 PVP は mEV の安定性を高めるため、TritonX-100 溶解に対する感受性が低くなります。

4 °C または室温で維持された PVP-mEV および遊離 mEV の安定性を 12 週間モニタリングしました。サンプルは、GFP、Violet-SSC、CD81 パラメーター、および粒子数に基づいてフローサイトメーターで 2 週間ごとに分析されました。遊離 mEV の GFP MFI および Violet-SSC 中央値は増加しました (図 4A、B)。並行して、CD81 の相対 MFI は、早くも 2 週目で大幅に減少しました。この傾向は、室温に保たれたサンプルでより顕著でした (図 4C)。温度に関係なく、計算された粒子数は 2 週間後に減少し、実験全体を通して低いままでした (図 4D)。 PVP ナノファイバーに結合した mEV は、Violet-SSC、GFP MFI、および粒子数の中央値に基づいて、12 週間安定したままでした (図 4A、B、D)。室温に保たれたサンプルのCD81相対MFIは6週間後に大幅に減少しましたが、4℃のサンプルは安定したままでした(図4C)。 CD81 アイソタイプコントロールの相対 MFI 値は、実験期間中低いままでした (図 S2)。中央値に加えて、分布曲線のロバストな変動係数（rCV）値も決定しました（図S3）。無料の mEV に関しては、3 つのパラメーターすべてでわずかな増加が見られました。 PVP-mEV の場合、RT サンプル中の CD81 マーカーの増加傾向が見られました。 PVP内とリポソームの表面で説明されている同様のH結合相互作用に基づいて、PVP繊維はナノ粒子に安定性を提供し、凝集から保護できる高分子保護シェルを形成できます（図4E）。さらに、PVP は電気的に中性であるため、タンパク質のリポソームへの結合を減少させることができます。リポソームと EV は多くの点で同様に動作するため、中型の EV の周囲に PVP シェルが形成できると考えられます。 PVP シェルの存在により、CD81 およびホスファチジルセリンの抗体および AnnexinV へのアクセス可能性が低下する可能性があります。 PVP は中型 EV の安定性を高めるため、TritonX-100 溶解に対する感受性が低くなります。

フローサイトメトリーによる遊離 mEV および mEV 負荷 PVP ファイバー (PVP-mEV) の安定性調査。 4 °C または RT に保たれた遊離 mEV および PVP-mEV の安定性を、フローサイトメトリーによって 2 週間ごとに 12 週間モニタリングしました。安定性は、mEV の膜結合 GFP シグナル (A)、小胞サイズ (B)、CD81 発現 (C) および粒子数 (D) と相関する Violet-SSC パラメーターに基づいて調査されました。 4 °C に保たれた遊離 mEV および PVP-mEV サンプルで観察された変化の仮説メカニズムの概略図をパネル (E) にまとめます。 nmEV-GFP = 3、nViolet-SSC = 3、nCD81 = 3、n粒子数 = 2 (図は、GraphPad Prism 7.00 for Windows、GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ、http://www.graphpad.com を使用して作成されました) 。

4℃または室温に保たれたPVP-mEV線維性サンプルの安定性を、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して4週間ごとに12週間モニタリングしました（0、4、8、および12週目）。 PVP ナノファイバーは可視光で検出され、EV は GFP 蛍光で検出されました。図 5 では、温度 (4 °C または RT) に関係なく、サンプルの繊維構造が 12 週間の保存期間の終わりまで目に見えるままであることがはっきりとわかります。ナノファイバーおよびナノファイバーに関連する GFP陽性の mEV は実験全体を通じて存在しました。

共焦点レーザー走査型顕微鏡による mEV 負荷 PVP ファイバー (PVP-mEV) の安定性の調査。 4 °C または RT に保たれた PVP-mEV の安定性を、共焦点レーザー走査型顕微鏡によって 4 週間ごとに 12 週間モニタリングしました。

EV の最も有望な保管条件は -80 °C です。ただし、この条件はコストと輸送上の課題によって制限される場合があります。代替の EV 保存技術は凍結乾燥ですが、コストが高く、再現性に疑問が生じます。エレクトロスピニングは、ベシクルの保存安定性を向上させるための優れた代替ソリューションを提供します。この高速でコスト効率が高く、拡張性の高い室温技術は、複雑なナノ繊維構造を形成し、技術プラットフォームを構築することができ、敏感な医薬品を製剤化するための実行可能なツールとなります。 EV をナノファイバーに埋め込むことで、小胞を固相で安定性を保って保存できるようになり、治療用途の研究に新たな地平が開かれます。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 [およびその補足情報ファイル] に含まれています。

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この研究は、センメルワイス科学イノベーション基金 (STIA-KF-2021) およびハンガリー国立心臓血管研究所プロジェクトの支援を受けました。このプロジェクトは、助成契約第 739593 号に基づく EU の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラムからも資金提供を受けています。

これらの著者、Krisztina Németh と Adrienn Kazsoki も同様に貢献しました。

センメルワイス大学遺伝細胞および免疫生物学学部、Nagyvárad Square 4、ブダペスト、1089、ハンガリー

クリスティナ・ネメス、タマス・ヴィスノヴィッツ、エディット・I・ブザス

ELKH-SE トランスレーショナル細胞外小胞研究グループ、ブダペスト、ハンガリー

クリスティナ・ネメス & 編集 I. ブザス

大学薬学部薬剤管理部門、センメルワイス大学、Hőgyes Endre Street 7-9、ブダペスト、1092、ハンガリー

エイドリアン・カッソキ & ロマーナ・ゼルコ

エトヴェシュ・ロラン大学、植物生理学および分子植物生物学科、パズマニ・ペテル・セターニ 1/C、ブダペスト、1117、ハンガリー

タマス・ヴィスノヴィッツ

ブダペスト工科経済大学 Műegyetem Rkp. 機械工学部高分子工学科 3、ブダペスト、1111、ハンガリー

バラーズ・ピンケ & ラスロー・メサロス

ELKH-BME 工科大学 Rkp. 複合科学技術研究グループ 3、ブダペスト、1111、ハンガリー

ラスロー・メサロス

HCEMM-SU 細胞外小胞研究グループ、ブダペスト、ハンガリー

イーディス・I・ブザス

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RZ および EIB - 概念化、KN、AK、TV、および BP - 方法論、KN、AK、および LM - 形式分析、調査 - KN および AK、執筆、原案作成 - KN および AK。執筆 - レビューと編集 - EIB、RZ、LM、視覚化 - AK、KN。監修—RZ、EIB

編集 I. Buzás または Romána Zelkó への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Németh, K.、Kazsoki, A.、Visnovitz, T. 他細胞外小胞の保存と容易な保存のための有望な技術としてのナノファイバー形成。 Sci Rep 12、22012 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-25916-6

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受信日: 2022 年 9 月 27 日

受理日: 2022 年 12 月 7 日

公開日: 2022 年 12 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25916-6

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