ATPを介した深部組織内の天然細菌の生体内生物発光イメージング

Nature Communications volume 14、記事番号: 2331 (2023) この記事を引用

2649 アクセス

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

既存の生物発光イメージング法のほとんどは、生体内で遺伝子操作された細菌の位置を視覚化することしかできず、一般に天然細菌のイメージングは​​不可能です。 今回我々は、細菌特異的なATP結合カセット糖輸送体を利用して、細菌の固有の炭素源上でルシフェラーゼとルシフェリンをヒッチハイクすることによってそれらを内部に取り込む。 通常、合成された生物発光プローブはグルコースポリマー (GP)、ルシフェラーゼ、Cy5、ICG 修飾シリコン ナノ粒子で作られ、その基板は GP と D-ルシフェリン修飾シリコン ナノ粒子で作られます。 インビトロでプローブをほとんど内部に取り込まないトランスポーターに変異を持つ細菌（つまり、取り込み率約 2%）と比較して、さまざまな細菌は約 50% という高い取り込み率でプローブを強力に飲み込む可能性があります。 特に、開発された戦略により、細菌性眼内炎患者から収集された10種の病原体を含むヒト硝子体の体外生物発光イメージングが可能になります。 このプラットフォームを使用することで、マウスの細菌性腎炎と非細菌性腎炎および大腸炎をさらに区別できるようになりますが、対応する化学発光マウスではこれらを区別できません。

微生物は健康と病気において多くの重要な役割を果たしています1、2、3、4、5、6。 インビボでの細菌の活動は、宿主生物体内での細菌の位置に大きく影響されます。 コンピュータ断層撮影 (CT) や磁気共鳴画像法 (MRI) などの既存の臨床画像法は、体内の細菌感染の非侵襲的な画像化を提供できます。 しかし、選択性が比較的低いため、細菌感染によって引き起こされる炎症と、がんや自己免疫疾患などの他の原因によって引き起こされる炎症を区別することができません7、8、9、10。 最近、光学イメージング技術により、分子レベルで局所的、定性的、定量的な細菌情報が得られるようになりました 11、12、13、14。 最も広く使用されている光学イメージング法として、蛍光イメージングにはリアルタイムの光励起が必要ですが、生体組織のバックグラウンド自家蛍光が発生し、シグナル対バックグラウンド比が比較的低下する可能性があります15、16、17。

生物発光イメージング (BLI) は、外部光照射が不要であるため、バックグラウンドが低く、感度が高いなど、蛍光イメージングに比べていくつかの利点があります 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28。 現在まで、細菌検出用の生物発光システムは基本的に 2 つのタイプに分類できます。(1) 内因性 BLI システム。これには、ルシフェラーゼを発現する細菌の遺伝子操作が含まれます 29、30、31、32、33。 (2) 外因性 BLI システムでは、細菌の溶解によって生成される細菌アデノシン三リン酸 (ATP) の存在下で、外因性ルシフェラーゼによって触媒される外因性ルシフェリンまたはケージド ルシフェリン基質の酸化によって自己発光が生じます 34。 BLI の大きな進歩にも関わらず、細菌イメージングには次のような本質的な欠点があります。「第一に、内因性 BLI システムは細菌の遺伝子改変が必要です。第二に、外因性 BLI システムは細菌を消費するために細菌細胞を破壊する必要があります。」細胞内ATP」であるため、生きた細菌を画像化することができません29、30、31、32、33、34。

生物発光を用いて in vivo のさまざまな天然細菌を視覚化する理論的には有望だが方法論的には未開発の方法は、生物発光レポーターを細菌細胞に選択的に送達し、細菌内の ATP を直接消費することである。 興味深いことに、「トロイの木馬」抗生物質戦略は、細菌の鉄トランスポーターを介してシデロフォア結合抗生物質を細菌の細胞質に送達する可能性があります 35,36,37,38,39,40,41。 我々の以前の研究では、補足表142、43、44、45に要約されているように、グルコースポリマー（GP）修飾ナノプローブが細菌特異的なABCトランスポーター経路を介してさまざまな細菌に内部移行できることを実証しました。 しかし、生物発光指標を細菌に選択的に送達するための「トロイの木馬」戦略の使用は、私たちの知る限り、これまでに報告されていません。

技術的なギャップを埋めるために、我々は、α(1-4)-グルコシド結合したグルコースポリマー(ブドウ糖当量4.0)上でヒッチハイクすることにより、ATP結合カセット(ABC)糖輸送体を介してルシ​​フェラーゼとルシフェリンを多様な天然細菌に選択的に送達することに着手した。 ~7.0) 結合ナノ粒子。 図1は、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方が、合成された生物発光プローブ（すなわち、グルコースポリマー（GP）、ルシフェラーゼ、Cy5およびICG修飾シリコンナノ粒子（GP-Si-BP））とその基質を積極的に飲み込む可能性があることを概略的に示しています。 (GP および D-ルシフェリン修飾シリコン ナノ粒子 (GP-Si-Luc))。 GP (例、ポリ[4-O-(α-D-グルコピラノシル)-D-グルコピラノース]) は遍在する炭素源として機能し、ABC 糖トランスポーターを介して細菌細胞に強力に取り込まれます9,42,46。 大腸菌 (E. coli) の ABC 糖トランスポーターを例に挙げると、これには LamB、MalE、MalF、MalG、MalK の 5 つのサブユニットがあります。 これらのサブユニットのうち、LamB は典型的な外膜拡散ポリンであり、MalE はα(1-4)-グルコシド結合した GP 分子を認識できます 47,48,49,50,51,52,53。 この取り込み機構を利用することにより、シリコンナノ粒子、金ナノ粒子、カーボンドットなどの小さなサイズ（例えば、〜5nm）のGP修飾ナノ粒子が選択的かつ強力に細菌細胞に取り込まれることが最近証明されている43、44、45。 同様に、ここでは、さまざまな細菌が偽装された「食物」、つまり GP-Si-BP および GP-Si-Luc を食べることを示します。 細菌細胞に取り込まれた後、GP-Si-Luc のルシフェリンは細菌内の ATP によって直接活性化され、続いて GP-Si-BP のルシフェラーゼによって触媒される酸化が起こります。 ルシフェラーゼと Cy5 間の生物発光共鳴エネルギー移動 (BRET) と Cy5 と ICG 間の蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) を統合するエネルギー移動リレーをさらに採用することで、開発されたトロイの木馬 BLI プローブは、細菌内の細菌の近赤外線 (NIR) イメージングを可能にします。深部組織。 さらに、ICG を充填すると、NIR 照射下で光熱による細菌の死滅が可能になります。 我々は、提示されたトロイの木馬 BLI 戦略により、細菌性眼内炎患者の硝子体における 10 種の細菌の ex vivo 生物発光イメージングが可能であることを実証します。 また、提示されたトロイの木馬 BLI 戦略により、マウスの細菌性腎炎および大腸炎の概念実証モデルにおいて、選択的かつ高感度のイメージングだけでなく、深部組織の病原体の光熱療法も可能になることを実証します。

ナノプローブは、GP、Cy5、ICG、ルシフェラーゼ修飾シリコン ナノ粒子 (SiNP) (GP-Si-BP) および GP、D-ルシフェリン修飾 SiNP (GP-Si-Luc) でできています。

補足図1は、GP-Si-BPおよびGP-Si-Lucの合成経路を段階的に示したものである。 簡単に説明すると、最初にシッフ塩基反応を通じて GP 共役 SiNP (GP-SiNP) を合成しました。シッフ塩基は、GP (0.56 mM、100 μL) のアルデヒド基とアミノ基の反応に基づいて形成されました。 SiNP の表面 (0.08 mM、200 μL)。 次に、静電吸着を利用して、Cy5 (0.56 mM、2 μL) と ICG (0.56 mM、12 μL) の色素分子を GP-SiNP に吸着させました。 N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩 (EDC)/N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 活性化縮合反応を介してホタル ルシフェラーゼ (0.06 mM、100 µL) とさらに結合させることで、最終的に生物発光プローブを取得しました。 GP-Si-BPの。 同様に、EDC/NHS 縮合反応に基づいて GP-SiNP を D-ルシフェリン (0.30 mM、100 μL) と結合させることにより、GP-Si-Luc の生物発光基質を合成しました。 報告されたプロトコルに従って計算した、GP-Si-BP の化学収率は 76.1%、GP-Si-Luc の化学収率は 78.8% でした 54。 SiNP にロードされた GP、Cy5、ICG、ルシフェラーゼ、D-ルシフェリンの量は、対応する校正吸収曲線によって厳密に定量化されました (補足図 2)。 一般に、GP-SiNP に吸着された Cy5 の実際の量は約 0.0044 mM で、GP-SiNP に吸着された ICG の実際の量は約 0.026 mM でした。 等価の線量を得るには、Cy5 と ICG の検出された吸光度をグループ間で同じに保つ必要があります。

SiNP、GP-Si-BP、GP-Si-Luc の透過型電子顕微鏡 (TEM) 画像と高解像度 TEM 画像 (図 2a)、および対応するサイズ分布 (補足図 3) で明らかになったように、平均GP-Si-BPの直径は約2.8 nmであり、GP-Si-Lucの平均直径は約2.9 nmであり、どちらも裸のSiNPの直径（例えば、約2.2 nm）よりわずかに大きかった。 GP-Si-BP、GP-Si-Luc、および純粋なSiNPの流体力学的直径は、動的光散乱（DLS）によって測定すると、〜5.6 nm、〜4.1 nm、および〜3.1 nmでした（補足図4）。 DLS で測定した粒子サイズは TEM で測定したものよりわずかに大きくなっていますが、これは 2 つの測定条件下で同じサンプルの表面状態が異なるためと考えられます。 具体的には、以前のレポートで説明したように、TEM 特性評価のためにサンプル内の溶媒を厳密に除去する必要があるため、DLS で測定した直径よりも小さな直径が得られます。 さらに、SiNPs結合後のルシフェラーゼとルシフェリンの良好な安定性を体系的に実証しました（補足図5）。

a SiNP、GP-Si-BP、GP-Si-Luc の TEM 画像と高解像度 TEM 画像。 スケールバー、20 nm および 1 nm。 b PBS、0.06 mMのSi-BP、Si-Luc、GP-Si-Luc、GP-Si-BPで処理したMDR大腸菌またはMRSAの高角度環状暗視野走査TEM（HAADF-STEM）画像。 37℃で2.5時間。 インキュベーション後、処理した細菌を PBS 緩衝液で数回洗浄しました。 細菌細胞濃度は約 1.0 × 107 CFU です。 スケールバー、200 nm。 c 示されているように、さまざまな処理を行った MDR E. coli の生物発光シグナル。 インキュベーション後、処理した細菌を PBS バッファーで数回洗浄し、その後イメージング (IVIS Lumina III) を行いました。 すべてのイメージング実験を 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 統計分析は、一元配置分散分析を使用して実行されました。 データは平均値 +/- SD (n = 3) として表示されます。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 漫画はHouyu Wang教授によって作成されました。

GP-Si-BP および GP-Si-Luc が自然細菌に侵入できるかどうかを主に調べるために、臨床的に由来した 2 つの多剤耐性大腸菌 (MDR E. coli) および多剤耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) 細胞を以下の目的で単離しました。実験。 これらは、復旦大学上海眼耳鼻咽喉科病院で診断および治療を受けた角膜炎患者から得られたものです。 単離した菌株（約 1.0 × 107 CFU）を GP-Si-BPs（0.06 mM）、GP-Si-Luc（0.06 mM）とともに 37 °C で 2.5 時間インキュベートし、PBS バッファーで数回洗浄しました。 補足図6の走査型電子顕微鏡(SEM)画像は、処理されたMDR大腸菌およびMRSA細胞の表面および形態が未処理のものと同等であることを示した。 高角度環状暗視野走査型透過型電子顕微鏡（HAADF-STEM）画像の元素マッピング（図2b）に示されているように、炭素、窒素、酸素元素は各グループに出現しましたが、ケイ素元素は処理された細菌にのみ存在しました。 GP-Si-BP または GP-Si-Luc を使用します。 明らかに、観察されたシリコンシグナルは GP-Si-BP または GP-Si-Luc の SiNP に割り当てられており、GP-Si-BP または GP-Si-Luc の細菌細胞への内部移行を直接示しています。 最後に、処理した細菌の ex vivo BLI により、独特の発光が GP-Si-BPs+ GP-Si-Luc グループでのみ見つかり、他のグループより約 10 倍強かったことが明らかになりました（図 2c）。 この高い輝度は、ルシフェラーゼ媒介発光反応においてルシフェリンを活性化するのに必要なATPの量によるもので、細菌内部では外部よりも正確に約10倍高かった（補足図7）。 ATP含量はATPアッセイキットにより測定した。 興味深いことに、GP分子（Si-BP + Si-Luc）を修飾せずにプローブを添加すると、溶解した細菌で同等の生物発光シグナルが観察されました（図2c）。 また、GP-Si-BP + GP-Si-Luc とインキュベートする前に、細菌を DCC (ジシクロヘキシルカルボジイミド) の ATP 阻害剤で処理しました。 予想通り、明確な信号は現れませんでした（補足図8）。 これらの結果を総合すると、構築されたトロイの木馬 BLI プローブが実際に細菌に侵入し、生成された生物発光の明るさが細菌内の ATP 量に依存することが証明されました。

開発された生物発光プローブでは、コア SiNP が生物発光インジケーターをロードするベクターとして機能しました。 生物発光インジケーターには、ルシフェラーゼの自己発光源 (λem = 560 nm)、Cy5 (λex = 646 nm、λem = 664 nm) および ICG (λex = 780 nm、λem = 840 nm) の 2 つの有機色素が含まれています (図.3a)。 発光バンドと吸収バンドが十分に重複していることから、NIR発光は、ルシフェラーゼとCy5の間のBRETと、Cy5とICGの間のFRETを組み合わせた二重共鳴エネルギー移動リレープロセスに基づいて達成できます（図3b）。 図3cでさらに明らかなように、Cy5とICGの比率が1:6の場合、最高のエネルギー伝達効率を達成できます。 一般に、Cy5 と ICG 間の最適 FRET 効率は 32% と決定され、対応するフェルスター距離 (R0) は 1.03 nm と計算され、NIR 領域での効率的な発光が保証されます。 図3dに示すように、GP-Si-BP + GP-Si-Lucの生物発光強度はATP濃度の増加とともに直線的に増加し、GP-Si-BPのATP含有量依存性の様式を示唆しています。 D-ルシフェリン (150 μM) および ATP (10 μM) を添加して、GP-Si-BP (0.06 mM) の光安定性をさらにテストしました。 図3eに示すように、BLIシステムは比較的良好な生物発光安定性を示し、ルシフェリンとルシフェラーゼ間の酵素反応は外部エネルギー（光照射など）の影響を受けずに安定に維持されたため、120分後に正規化シグナルの84％を保持しました。 ）。 逆に、GP-Si-BP における ICG の正規化シグナルは、120 分間の 808 nm 連続照射下で 26% 急激に減少しました。これは、ICG への 808 nm の連続照射が、発光の減少に対する潜在的な漂白および消光効果の原因となったためです。 その後、GP-Si-BP の組織侵入深さを調べました。 実験的には、黒色の 96 ウェル プレート内で D-ルシフェリン (150 μM) および ATP (10 μM) と混合した GP-Si-BP (0.06 mM) をさまざまな厚さの鶏胸肉組織で覆い、生物発光シグナルを記録し、 808nm照射下での蛍光シグナル。 図3fで明らかなように、正規化された生物発光シグナルは、鶏の胸部組織の厚さが0〜35 mmの範囲で増加するにつれて減少しました。 通常、厚さが最大 ​​30 mm の場合でも、GP-Si-BP の正規化された生物発光強度は、ICG ベースの NIR 発光イメージング グループよりも依然として有意に高かった (p < 0.0001)。 同様に、補足図9に示すように、GP-Si-BPの組織浸透深さはGP-Ce6-SiNPの組織浸透深さよりも大幅に深かった。通常、厚さが5 mmの場合、GP-Ce6-SiNPの蛍光シグナルはは検出できませんでした。 GP-Si-BP の優れた浸透深さは、その後の深部組織での in vivo イメージング用途の基礎を築きます。 最後に、IR 熱画像カメラを使用して、GP-Si-BP の光熱能力を in vitro でテストしました。 図3g、hに示すように、GP-Si-BPs溶液（0.06mM）の温度は808nmレーザー照射下で5分間急速に61℃まで上昇し、GP-Siの光熱療法（PTT）の可能性を示唆しています。 -細菌に対する血圧。

Cy5、ICG、ルシフェラーゼの生物発光の紫外可視吸収および発光スペクトル。 破線と実線はそれぞれ吸収スペクトルと発光スペクトルを示します。 b 開発された戦略にBRETとFRETを統合したエネルギー伝達リレーのメカニズムを示すスキーム。 c Cy5対ICGの比率が異なるGP-Si-BPの蛍光スペクトル。 d ATP濃度の関数としてのGP-Si-BP + GP-Si-Lucの生物発光シグナル（平均±SD、n = 3）。 e、f 時間分解（e）および鶏胸肉組織の厚さ依存（f）生物発光および蛍光（励起：780 nm）画像および生物発光および蛍光シグナル変化の定量的比較のための対応する正規化シグナル。 (e) の正規化信号は、5 分で検出された発光強度に対する任意の時点で検出された発光強度の比として定義されます。 (f) の正規化信号は、任意の組織の厚さで検出された発光強度と 0 mm で検出された発光強度の比として定義されます。 生物発光は、GP-Si-BP (0.06 mM)、D-ルシフェリン (150 μM)、および ATP (10 μM) の混合物によって生成されます。 データは平均値 +/- SD (n = 3) として表示されます。 g 808 nm レーザー照射下での PBS、GP-Si-BP の光熱加熱画像。 h 808 nmレーザー照射下でのPBS、GP-Si-BPの光熱加熱曲線。 すべてのイメージング実験を 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 統計分析は、一元配置分散分析を使用して実行されました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

結合 GP の量とインキュベーション時間を最適化するために、フローサイトメトリー分析を使用して細菌による GP-Si-BP の取り込み効率を体系的に調査しました。 補足図10で明らかなように、細菌を0.56 mM GP 濃度を 2.5 時間含む GP-Si-BP。 GP 濃度とインキュベーション時間をさらに増加し​​ても、取り込み速度は大幅には増加しませんでした。これは、この環境下で飽和状態が達成されたことを示しています。 同様の傾向が GP-Si-Luc でも観察されました。 したがって、以下の実験では、0.56 mM GPおよび2.5時間のインキュベーションを採用した。

次に、GP-Si-BPs と GP-Si-Luc がさまざまな天然細菌を標的にできるかどうかを実証しました。 この目的を達成するために、我々は 2 つのグラム陰性菌、つまり臨床由来の MDR 大腸菌、ネズミチフス菌 (STm) と 2 つのグラム陽性菌、つまり臨床由来の MRSA および黄色ブドウ球菌 (S. aureus) を選択しました。 図4aおよび補足図11aの共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像で明らかになったように、MRSA、MDRでは明確な赤色蛍光シグナル（ICGに割り当て、λex = 780 nm、λem = 800〜840 nm）を観察できました。 GP-Si-BP (0.06 mM) との 2.5 時間のインキュベーション後の大腸菌、黄色ブドウ球菌および STm。 対応するフローサイトメトリーにより、GP-Si-BP の取り込み効率がそれぞれ MRSA で 52.7%、MDR 大腸菌で 49.6%、黄色ブドウ球菌で 53.5%、STm で 47.1% であることが定量的に明らかになりました。 同様に、MRSA、MDR 大腸菌、黄色ブドウ球菌、および STm で 2.5 時間インキュベートした後、強い緑色蛍光シグナル (D-ルシフェリン、最初の列、λex = 328 nm、λem = 530 ～ 560 nm) を検出できました。 GP-Si-Luc (0.06 mM) (図 4b および補足図 11b)。 また、GP-Si-Luc の比較的高い取り込み効率は、MRSA (48.1%)、MDR E. coli (45.7%)、黄色ブドウ球菌 (47.2%)、および STm (48.9%) でそれぞれ測定されました。 予想どおり、GP-Si-BPs (0.06 mM) および GP-Si-Luc (0.06 mM) で処理した MRSA、MDR E. coli、S. aureus、および STm では緑色と赤色のシグナルが両方とも観察できます (GP-Si) -BP + GP-Si-Luc）を2.5時間（図4cおよび補足図11c）。 それどころか、GP分子（つまり、Si-Luc、Si-BP、またはSi-Luc + Si-BP）を修飾せずにナノ薬剤で処理した細菌では、検出可能な蛍光シグナルを観察することはできません（補足図12および図12）。 13)。 これらの結果は主に、GP リガンドの細菌標的能力を確認しました。

a 0.06 mM GP-Si-BP とインキュベートした後の MRSA または MDR 大腸菌の共焦点蛍光画像および取り込み速度の対応するフローサイトメトリー分析。 b 0.06 mM GP-Si-Luc とインキュベートした後の MRSA または MDR 大腸菌の共焦点蛍光画像および取り込み速度の対応するフローサイトメトリー分析。 c 0.06 mM GP-Si-Luc + GP-Si-BP とインキュベートした後の MRSA または MDR 大腸菌の共焦点蛍光画像。 d、e 0.06 mM GP-Si-BPs（d）またはGP-Si-Luc（e）とインキュベートした後のΔlamBおよびΔmalEの細菌変異体の共焦点蛍光画像。 細菌細胞濃度は約 107 CFU です。 スケールバー、25μm。 f 0.06 mM GP-Si-Luc + GP-Si-BP とインキュベートした後の、さまざまな濃度の MRSA または MDR 大腸菌を含む PBS 緩衝液の生物発光画像。 g エンテロコッカス・フェカリス（1）、肺炎桿菌（2）、肺炎球菌（3）、髄膜炎菌（4）、インフルエンザ菌（5）、化膿性連鎖球菌（6）、バンコマイシン（Van）を含むヒト硝子体の生体外生物発光イメージング-細菌性眼内炎患者から採取された耐性腸球菌（7）、多剤耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）（8）、モラクセラ・カタルハリス（9）、またはサルモネラ・パラチフスA（10）。 健康なボランティアからの細菌を含まない硝子体 (0) を対照として設定しました。 すべてのイメージング実験を 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。

GP-Si-BPおよびGP-Si-LucがABC糖輸送体を介して細菌を標的とするかどうかをさらに実証するために、我々は2種類の細菌変異体、すなわち、delta-lamBの欠失変異体（ΔlamB）とdelta-malEの欠失変異体を構築した。 (ΔmalE)、続いて GP-Si-BP または GP-Si-Luc とインキュベートします。 サンガー配列決定データ（補足説明）と PCR データ（補足図 14）は、ΔlamB および ΔmalE の構築が成功したことを検証しました。 予想通り、GP-Si-BP（図4d）またはGP-Si-Luc（図4e）で処理したΔlamBまたはΔmalEでは蛍光シグナルは観察されませんでした。 フローサイトメトリーの結果は、CLSM画像と一致しました（補足図15）。 さらに、さまざまな糖（GP、グルコース、マルトトリオースなど）がABC糖トランスポーターによるGP-Si-BPの取り込みに影響を与えるかどうかをさらに調査しました。 補足図16で明らかなように、GP-Si-BPの取り込みは、グルコースではなく過剰なGPまたはマルトトリオースによって阻害されました。 以前に報告されているように、ABC 糖輸送体はマルトースだけでなく、マルトデキストリン、アミロース、デンプンなどの (1-4)-グルコシド結合した直鎖状グルコースポリマーや (1-4)-グルコシド結合したシクロデキストリンの輸送も可能にしました 57。 58. これらの結果を総合すると、トロイの木馬 BLI プローブの細菌への取り込み機構が実際に ABC 糖トランスポーター経路を介していることが証明されました。

最後に、我々は、GP-Si-BP および GP-Si-Luc が哺乳動物細胞よりも細菌に対して優れた特異性を示すことを実証しました。 通常、MDR 大腸菌または MRSA をスパイクしたヒト血液サンプルは、GP-Si-BP (0.06 mM)、GP-Si-Luc (0.06 mM)、または GP-Si-BP + GP-Si-Luc (0.06 mM) とインキュベートされました。 ) 2.5 時間放置した後、PBS 緩衝液で洗浄しました。 補足図17に示すように、緑色および赤色の蛍光シグナルは、ヒトの血液細胞ではなく細菌細胞でのみ観察されました。 これらの結果は、哺乳動物細胞にはABC糖トランスポーターが存在しないため、GP-Si-BPまたはGP-Si-Lucが哺乳動物細胞にほとんど取り込まれないことを実証した。

検出限界を決定するために、トロイの木馬 BLI プローブとインキュベートした PBS 緩衝液中の MRSA および MDR 大腸菌の濃度シリーズを画像化しました (図 4f)。 通常、細菌は約 106 CFU という低濃度でも検出可能なシグナルを生成しました。 これに基づいて、提示されたトロイの木馬 BLI 戦略により、細菌性眼内炎患者から採取された硝子体中の 10 種類の病原体の ex vivo 生物発光イメージングが可能であることをさらに実証しました。イメージングされた病原体は、エンテロコッカス フェカリス、肺炎桿菌、肺炎球菌、ナイセリアでした。図4gに示すように、髄膜炎菌、インフルエンザ菌、化膿性連鎖球菌、バンコマイシン（Van）耐性腸球菌、多剤耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、モラクセラ・カタラーリス、パラチフスA型サルモネラ属。 これらの病原体は、同じく復丹大学上海眼耳鼻咽喉科病院から提供された細菌培養によって確認された。 これらの結果は、臨床細菌診断におけるトロイの木馬 BLI 戦略の可能性を示唆しています。

次に、深部組織の天然細菌の生物発光イメージングに関する提案された戦略の実現可能性を証明しました。 この目的を達成するために、我々はまず、マウスにおける黄色ブドウ球菌誘発性腎炎の概念実証モデルを構築した（補足図１８ａ）。 イメージング中の感染部位の実際の黄色ブドウ球菌濃度は約 1.0 × 108 CFU でした。 我々は、最も強い生物発光シグナルがGP-Si-BP + GP-Si-Lucグループにおいてのみ感染部位に現れることを発見した（図5a）。 定量的には、GP-Si-BPs + GP-Si-Luc グループのシグナル強度は、GP-Si-BPs + Si-Luc グループのシグナル強度よりも約 3 倍強かった。 採取した腎臓組織の ex vivo イメージングでも同様の結果を観察することができました (補足図 19)。 さらに、開発されたトロイの木馬戦略によって、腎臓内の約 1.0 × 106 CFU の黄色ブドウ球菌を識別することができ（図 5b）、そのような感度は多くの in vivo シナリオで十分であるはずです。 他の腎炎よりも細菌性腎炎に対して開発されたトロイの木馬BLI戦略の選択的イメージングを実証するために、次にマウスのグリセリン起因性大腸炎を構築しました（補足図18b）。 予想通り、GP-Si-BP + GP-Si-Luc で治療した黄色ブドウ球菌腎炎担持マウスの生物発光シグナルは、GP-Si-BP + GP-Si-Luc で治療したコントロールおよびグリセリン腎炎担持マウスよりも有意に明るいことがわかりました。 GP-Si-Luc (p < 0.001) (図 5c)。 さらに比較するために、ルミノールの別の自己発光試薬を使用して、黄色ブドウ球菌腎炎担持マウス（補足図18c）またはグリセリン腎炎担持マウス（補足図18d）を画像化しました。 以前に報告されたように、ルミノールはミエロペルオキシダーゼ (MPO) によって触媒されて発光する可能性があります 59,60。 黄色ブドウ球菌腎炎の選択的画像において開発されたトロイの木馬BLI戦略とは区別され、ルミノールは黄色ブドウ球菌腎炎担持マウスとグリセリン腎炎担持マウスの両方で強い発光シグナルを生成することができた（図5d）。 これらの結果を総合すると、開発されたトロイの木馬 BLI 戦略が細菌性腎炎とその他の腎炎を区別できることが実証されました。 開発された戦略の高い選択性と調整可能な感度は、トロイの木馬 BLI プローブの細菌細胞への選択的な内部移行によるものと考えられます。 さらに、黄色ブドウ球菌腎炎のイメージングにおいて、以前に報告された GP および Ce6 修飾 SiNPs (GP-Ce6-SiNPs) システム (Ce6 の単純励起)39、トロイの木馬 BLI システム、および ICG ベースの NIR 発光イメージングを体系的に比較しました (補足図20)。 GP-Ce6-SiNPs システムと ICG ベースの NIR 発光イメージングでは、GP リガンドの特異的な細菌ホーミング能力により、腎臓における細菌によるナノ薬剤の取り込みの検出が可能でしたが、トロイの木馬 BLI 戦略は、S/N 比が 3.75 倍高いことが特徴でした。 GP-Ce6-SiNPs システムによって得られた信号と、ICG ベースの NIR 発光イメージングによって得られた信号対雑音比の 3.46 倍の高い信号対雑音比です。 まとめると、トロイの木馬 BLI システムの高コントラスト イメージングにより、黄色ブドウ球菌腎炎の検出には Ce6 や ICG ベースの発光イメージングではなくトロイの木馬 BLI を使用しました。

a 示されているさまざまな治療を受けたマウスの黄色ブドウ球菌（約 1.0 × 108 CFU）誘発性腎炎の生物発光イメージング。 感染マウスに GP-Si-BPs + PBS、GP-Si-BPs + Si-Luc、GP-Si-BPs + GP-Si-Luc、Si-BPs、GP-Si-Luc および Si-BPs + を注射しました。それぞれ同じ用量のSi-Luc（平均±SD、n = 3）。 b 示されているさまざまな治療を受けたマウスの黄色ブドウ球菌（〜1.0×106 CFU）誘発性腎炎の生物発光イメージング。 感染マウスに GP-Si-BPs + PBS、GP-Si-BPs + Si-Luc、GP-Si-BPs + GP-Si-Luc、Si-BPs、GP-Si-Luc および Si-BPs + を注射しました。それぞれ同じ用量のSi-Luc（平均±SD、n = 3）。 c トロイの木馬 BLI プローブを使用した、健康なマウス (コントロール)、グリセリン腎炎担持マウス、および黄色ブドウ球菌腎炎担持マウスの生物発光イメージング (平均 ± SD、n = 3)。 d ルミノール（282 mM、200 μL）の腹腔内投与による健康マウス（コントロール）、グリセリン腎炎担持マウスおよび黄色ブドウ球菌腎炎担持マウスの発光イメージング（平均±SD、n = 3）。 すべてのイメージング実験を 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 統計分析は、一元配置分散分析を使用して実行されました。 エラーバーは、3 つの独立した測定から得られた標準偏差を表します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

深部組織における天然細菌のイメージングにおける開発された戦略の一般性を確認するために、マウスにおけるSTm誘発性大腸炎の別の概念実証モデルを構築しました（補足図21a）。 イメージング中の感染部位の実際の STm 量は、約 1.0 × 109 CFU と決定されました。 図6aで明らかなように、GP-Si-BP + GP-Si-Lucグループでは他のグループよりもはるかに強い生物発光シグナルが観察されました（p < 0.0001）。 一貫した結果が、単離された腸組織の ex vivo イメージングで観察されました (図 6b)。 他の大腸炎よりも細菌性大腸炎に対する開発されたトロイの木馬BLI戦略の選択性を証明するために、マウス（雌、6〜8週齢、n = 3）でデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性大腸炎を構築しました（補足図21b）。 DSS 大腸炎担持マウスを、同一条件下で GP-Si-BP + GP-Si-Luc で処理しました。 実際、GP-Si-BPs + GP-Si-Luc で処理した STm グループの生物発光シグナルは、GP-Si-BPs + GP-Si-Luc で処理したコントロールおよび DSS グループよりも有意に強かった (p < 0.001) (図.6c）。 さらに比較するために、ルミノールを使用して STm 大腸炎保有マウス (補足図 21c) または DSS 大腸炎保有マウス (補足図 21d) を画像化しました。 予想通り、対照群の無視できるシグナルと比較して、ルミノールで処理したSTm大腸炎担持マウス（p < 0.0001）とルミノールで処理したDSS大腸炎担持マウス（p < 0.01）の両方で強い発光シグナルが観察されました（図6d）。 。 これらの結果を総合すると、開発されたトロイの木馬 BLI 戦略が細菌性大腸炎とその他の大腸炎を区別できることが実証されました。 また、開発されたトロイの木馬BLI戦略により、マウスのSTm大腸炎の長期的かつリアルタイムの画像が可能になることも実証しました（図6e）。 通常、GP-Si-Luc の投与後 1 時間でも明確なシグナルを観察できました。 この良好な特異性とともに観察された持続的な発光は、感染した腸組織内の細菌細胞へのトロイの木馬 BLI プローブの選択的蓄積に起因すると考えられます。 また、STm 大腸炎のイメージングにおいて、GP-Ce6-SiNPs システム（Ce6 の単純な励起）42、トロイの木馬 BLI 戦略、および ICG ベースの NIR 発光イメージングを系統的に比較しました（補足図 22）。 予想通り、Trojan BLI 戦略は、GP-Ce6-SiNPs システムで得られる信号対雑音比よりも 4.05 倍、ICG ベースの NIR 発光イメージングによって得られる信号対雑音比よりも 3.45 倍高い信号対雑音比を特徴としていました。 そのため、Trojan BLI システムの高コントラストイメージングにより、STm 大腸炎の検出に Ce6 または ICG ベースの発光イメージングの代わりに Trojan BLI を使用しました。

a 示されているさまざまな治療を受けたマウスの STm (約 1.0 × 109 CFU) 誘発性大腸炎の生物発光イメージング。 感染マウスに GP-Si-BPs + PBS、GP-Si-BPs + Si-Luc、GP-Si-BPs + GP-Si-Luc、Si-BPs、GP-Si-Luc および Si-BPs + を注射しました。それぞれ同じ用量のSi-Luc（平均±SD、n = 3）。 b 示されているように異なる治療を受けたSTm大腸炎担持マウスから単離された腸組織の対応するex vivo発光画像。 c トロイの木馬BLIプローブに基づく健康マウス（コントロール）、DSS大腸炎担持マウス、およびSTm大腸炎担持マウスの生物発光イメージング（平均±SD、n = 3）。 d ルミノール（282 mM、200 μL）の腹腔内投与による健康マウス（コントロール）、DSS大腸炎担持マウス、およびSTm大腸炎担持マウスの発光イメージング（平均±SD、n = 3）。 e トロイの木馬 BLI プローブに基づく、マウスの STm (約 1.0 × 109 CFU) 誘発大腸炎の微速度撮影生物発光イメージング。 すべてのイメージング実験を 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 統計分析は、一元配置分散分析を使用して実行されました。 エラーバーは、3 つの独立した測定から得られた標準偏差を表します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

細菌の生物発光イメージングに加えて、構築された GP-Si-BP は、GP-Si-BP 内の ICG に由来する光熱効果により細菌を不活性化する可能性も備えていました。 細菌（大腸菌、黄色ブドウ球菌など）のSEM画像で明らかなように（補足図23a）、細菌をGP-Si-BP（0.06 mM) を 2.5 時間照射した後、808 nm レーザー (1.0 W cm-2) を 5 分間照射しました。 我々は、臨床的に使用される抗生物質（例えば、バンコマイシン（Van）、アンピシリン（Ampi））との直接比較において、GP-Si-BPの優位性を強調する確かな証拠を示した（補足図23b）。 全体として、提示された戦略には、細菌を殺す上で抗生物質に比べて 2 つの明確な利点があります: (1) GP-Si-BP はグラム陽性菌だけでなくグラム陰性菌も殺すことができますが、バンコマイシンはグラム陽性菌にのみ効果があります（例、黄色ブドウ球菌、M.ルテウスおよびMRSA）; (2) 開発された戦略は、短時間の治療 (例: 2 時間 30 分) で優れた抗菌率 (例: >90%) を示しますが、バンコマイシンまたはアンピシリンは 15 μg mL-1 であっても抗菌率が劣っています。処理時間は最大 7 時間です (例えば、<65%) (補足図 23c および 23d)。 これらの結果は、抗生物質よりも細菌を殺すためのこのような治療の有用性を説得力を持って示しています。

開発された戦略の抗菌能力を in vivo で評価するために、マウスの細菌性腎炎の概念実証モデルでその光熱効果を調べました（補足図24）。 また、治療後に感染した腎臓組織を切除し、ホモジナイズし、プレート上でホモジネートを培養しました。 図7a、bで明らかなように、7日間の処理後にGP-Si-BP + 808 nmレーザーグループに散発的なコロニーが存在することがわかりました。 定量的に、黄色ブドウ球菌に対するレーザー照射下での GP-Si-BP の生体内抗菌率は 96.0% と計算されました。 寒天プレート実験と一致して、ヘマトキシリン-エオシン（H&E）染色データ（図7c）は、GP-Si-BP + 808 nmレーザーグループでのみ明確な組織構造と細胞壊死が見られないことを示しました。 PPT効果により高い抗菌率を実現しました。 IR 熱画像カメラを使用して、生体内光熱画像を記録しました。 図7dに示すように、急速な温度上昇はGP-Si-BP + 808 nmレーザーグループでのみ発生しました。 特に、このグループでは5分間の照射後に腎臓の温度が52℃まで上昇する可能性がありました。 一方、開発されたトロイの木馬 BLI 戦略により、マウスにおける抗菌効果の動的な視覚化も可能になりました。 実験的には、各照射後にマウスに同用量の GP-Si-Luc を腹腔内注射し、続いて生物発光イメージングを行って治療効果を評価しました。 図7eに示すように、生物発光シグナルは治療が進むにつれて徐々に減少しました。 予想通り、生物発光シグナルの変化傾向は、処理後の細菌数の変化傾向と一致しました。 定量分析により、細菌の濃度に依存する BLI シグナルが検出と治療の重要な指標であることがわかりました。 これらの治療データは総合すると、開発された戦略の適応可能な抗菌能力が生体内で証明された。

a、b 注射後 7 日目の照射 (808 nm レーザー照射、1.0 W cm-2、5 分間) の有無にかかわらず PBS または GP-Si-BP で治療した腎炎担持マウスの感染腎臓のホモジェネート固体 LB 寒天上で培養したもの (a)、および対応する細菌コロニー形成の定量化 (平均 ± SD、n = 3 の生物学的に独立したサンプル) (b)。 c 示されているさまざまな治療を受けたマウスの黄色ブドウ球菌に感染した腎臓組織の対応する組織学的画像。 スケールバー、25μm。 d、照射の有無にかかわらず（808 nmレーザー、1.0 W cm-2、5分間）PBSまたはGP-Si-BPで治療した黄色ブドウ球菌腎炎担持マウスの7日後の代表的な光熱画像。注射。 e トロイの木馬BLIプローブを使用した、さまざまな治療時点での黄色ブドウ球菌腎炎担持マウスの生物発光イメージング、および定量的比較による生物発光強度の経時的変化と細菌数の経時的変化の間の対応関係。 各照射後、イメージングのために同用量の GP-Si-Luc をマウスに腹腔内注射して、治療効果を評価しました (平均 ± SD)。 すべてのイメージング実験を 3 回繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 統計分析は、一元配置分散分析を使用して実行されました。 エラーバーは、3 つの独立した測定から得られた標準偏差を表します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

最終的に、我々は GP-Si-BP と GP-Si-Luc の毒性を体系的に調査しました。 補足図25で明らかなように、HEK-293T、mREC、HeLa、またはMCF-7細胞の形態は、GP-Si-BP + GP-Si-Luc（0.06 mM）とインキュベートした場合、ほとんど変化しませんでした。 また、メチルチアゾリルテトラゾリウム (MTT) アッセイを使用した場合、これらの細胞の細胞生存率は 80% 以上を維持しました。 これらの結果は、GP-Si-BP および GP-Si-Luc の弱い細胞毒性を示唆しています。 我々は、血液生化学と日常的な血液分析を使用して、試験用量での GP-Si-BP および GP-Si-Luc の系統的毒性を試験しました。 補足表2および3に示すように、PBSグループと比較して、GP-Si-BPsグループまたはGP-Si-Lucグループのすべての生化学指標は正常範囲内でした。 さらに、GP-Si-BP（0.06 mM）またはGP-Si-BP（0.06 mM）の静脈内注射の1日後にマウスから採取した主要臓器のH＆E（補足図26a）およびマッソントリクローム染色（補足図26b）も実行しました。 Ｌｕｃ（０．０６ｍＭ）。 総合すると、切除臓器の切片には明らかな組織病理学的異常は見つからず、GP-Si-BP または GP-Si-Luc の無視できない in vivo 毒性が示されました。 GP-Si-BPの静脈内注射後に健康なマウスから切除された主要臓器のex vivo蛍光イメージングでさらに明らかになったように（補足図27a）、明るい蛍光シグナルは、注射後2時間で他の臓器ではなく肝臓と腎臓で主に観察されました。注射後 48 時間で完全に消失します。 さらに、GP-Si-BPの注射後24時間後に健康なマウスから収集した尿サンプルで強い蛍光シグナルが観察されました（補足図27b）。 これらの結果は、構築されたプローブが体内から除去される可能性があることを示唆しました。

ここでは、ルシフェラーゼとルシフェリンをさまざまな天然細菌に選択的かつ確実に送達するトロイの木馬戦略を開発し、生体内での細菌の分布を生物発光で視覚化しました。 生物発光は、有望な非侵襲的自己発光イメージングモダリティとして、ルシフェラーゼによって触媒される対応するルシフェリンの発熱酸化による光子放出を指します18、19、20、21、22、23、24、25。 生物発光には大きな期待があるにもかかわらず、以下の制限があるため、共生細菌や病原性細菌のイメージングは​​ほとんど許可されていません。(1) 内因性生物発光は一部の特定の人工細菌によってのみ生成され、ほとんどの天然細菌には適用できません。 (2) 外因性生物発光の生成には細菌の溶解によって得られる細菌 ATP の関与が必要でした 29,30,31,32,33,34。 生体内でさまざまな天然細菌を生物発光で視覚化する簡単な方法は、生物発光レポーターを細菌細胞に選択的に送達し、細菌内の ATP を直接消費することかもしれませんが、固有の細菌原形質膜によって課せられる静電荷やサイズ障壁による技術的な課題が存在します。そして細胞壁。 興味深いことに、1980 年代に開発されたトロイの木馬抗生物質戦略は、細菌の鉄インポーターを介してシデロフォア結合抗生物質を細菌の細胞質に送達することができました 35,36,37,38,39,40,41。 これに触発されて、私たちはトロイの木馬 BLI 戦略を提案しました。

トロイの木馬の抗生物質戦略とは異なり、私たちの設計では、生物発光インジケーターが GP 修飾 SiNP にロードされ、ABC 糖トランスポーターを介して細菌に輸送されます。 注目すべきことに、SiNP はベクターとして、毒性が低いか毒性がないため、さまざまなバイオアプリケーションに広く使用されています 58,59,60,61,62,63,64。 以前に報告されたように、SiNP は生分解され、in vivo で明確な毒性を示すことなく腎臓から除去される可能性があります 65,66。 例えば、線虫、カイコ、さらにはヒト以外の霊長類動物モデル（カニクイザルなど）における毒性評価では、内部移行した SiNP が動物の形態、生理学、または自然免疫機能に影響を及ぼさないことが実証されており、動物の良性生体適合性が示唆されています。生体内の SiNP 67、68、69。 これに基づいて、小型 SiNP は 2011 年 1 月に食品医薬品局 (FDA) からファーストインヒト臨床試験の治験新薬承認を取得しました (つまり、NCT01266096、NCT02106598)70,71。 そのため、生物発光インジケーターを提供する媒体として SiNP を選択しました。 生物発光インジケーターには、ルシフェラーゼと 2 つの有機色素、Cy5 および ICG が含まれていました。 その結果、ルシフェラーゼと Cy5 間の BRET、および Cy5 と ICG 間の FRET を組み合わせた二重共鳴エネルギー移動リレー プロセスを使用して、NIR 放射を実現できます。 これにより、開発された戦略は、特定の臨床現場で深部組織の細菌を画像化できる可能性があります。 しかしながら、ルシフェラーゼ、Cy5、ICGの組み合わせは、サンプル調製や定量分析に比較的複雑な作業を必要とし、作業の効果が大幅に低下します。 次の研究では、より単純なシステムをテストします。

もう 1 つの側面では、過去 30 年にわたる先駆的な研究により、マルトデキストリン、アミロース、デンプンなどの細菌細胞の固有の炭素源や、(1-4)-グルコシド結合したシクロデキストリンが選択的に取り込まれるメカニズムが解明されました。細菌特異的なABC糖トランスポーターを介して細菌細胞に侵入します46、47、48、49、50、51、52、53。 しかし、これらの洞察は、生物発光カーゴを細菌細胞に送達することに成功するABCトランスポーターベースの戦略を生み出していない。 このギャップを埋めるために、細菌特異的なABC糖トランスポーターを活用し、ブドウ糖当量4.0～7.0のGP分子上にルシフェラーゼとルシフェリンをヒッチハイクすることで選択的に取り込みました。 合成されたトロイの木馬 BLI プローブは、グラム陽性菌 (例、黄色ブドウ球菌、臨床由来 MRSA) とグラム陰性菌 (例、STm、臨床由来 MDR 大腸菌) の両方に選択的に取り込まれ、高い取り込み率が向上しました。 50%まで。 私たちは、ヒトの細菌性眼内炎の生体外イメージングにおけるその能力を示しました。 私たちは、マウスの他の種類の腎炎および大腸炎よりも、マウスの細菌性腎炎および細菌性大腸炎に対する選択的なイメージを示しました。 さらに、我々は、開発された戦略により、抗生物質耐性菌のほぼ 95% を in vitro および in vivo で光熱死滅させることができることを実証しました。 私たちは、提案されたトロイの木馬 BLI 戦略が細菌細胞へのさまざまな物質の送達を触媒し、さまざまなイメージングまたは治療アプローチの開発を可能にする可能性があると期待しており、この研究で報告された細菌の生物発光イメージングは​​原理の最初の証明として機能します。

ヒトの血液サンプルを使用した研究プロトコールは東州大学の倫理委員会によって承認されました。 サンプルは書面によるインフォームドコンセントに従って提供されました。 著者らは、すべての人体血液実験が関連法および制度上のガイドラインに厳密に従って行われたことを宣言します。 臨床サンプルは、病院倫理委員会 (ENTIRB-2017-06-07-01) の承認を得て、復旦大学眼耳鼻咽喉病院アイバンクから提供されました。 すべての実験はヘルシンキ宣言に従い、中国の法律に従って実施されました。

C6H17NO3Siと1,8-ナフタルイミドの混合物に室温で7日間365nm照射すると、小型の蛍光SiNPが調製されました。 次に、得られた溶液を 3381 x g で 15 分間遠心分離し、透析 (MWCO、1000、Spectra/Pro) により未反応試薬を除去して精製しました。 SiNP の最終生成物は蒸発によって収集され、次の実験のために 4 oC で保存されました。 GP 修飾 SiNP (GP-SiNP) を得るために、SiNPs 溶液 (200 μL、0.08 mM) と GP 溶液 (100 μL、0.56 mM) の混合物を 70 °C で 6 時間継続的に撹拌し、続いて０．０１ｍｇのＮａＢＨ４を室温でさらに１２時間反応させた。 得られた溶液をNanosep遠心分離装置(分子量カットオフ、3kDa; Millipore)により5283×gで15分間遠心分離して精製し、未反応のGP分子を除去した。 Cy5およびICG分子をさらにロードするために、Cy5溶液(2μL、0.56mM)およびICG溶液(12μL、0.56mM)を上記で調製したGP-SiNPs溶液に添加し、室温で一晩撹拌した。 同様に、得られた溶液をNanosep遠心分離装置(分子量カットオフ、3 kDa; Millipore)により6010 x gで10分間の遠心分離により精製し、負荷されていないCy5およびICG分子を除去した。 その後、アミン含有ルシフェラーゼ溶液（０．１ｍＬ、０．０６ｍＭ）、ＥＤＣ溶液（２μＬ、１０ｍＭ）およびＮＨＳ溶液（１０μＬ、１７ｍＭ）を上記で調製した溶液に添加し、室温で一晩反応させた。 GP-Si-BP を取得します。 また、得られた溶液を、Ｎａｎｏｓｅｐ遠心分離装置（ＭＷカットオフ、１００ｋＤａ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、５２８３×ｇで１５分間遠心分離することにより精製した。 同様に、GP-Si-Luc も、D-ルシフェリン (0.1 mL、0.30 mM)、EDC 溶液 (2 μL、10 mM)、および NHS 溶液 (10 μL、17 mM) を GP-SiNPs 溶液に添加することによって合成しました。室温で一晩放置し、続いて同一の精製プロトコールを行った。

トロイの木馬 BLI プローブの形態とサイズは、200 kV の透過型電子顕微鏡 (TEM、Philips CM 200) を使用して特性評価されました。 トロイの木馬 BLI プローブの紫外可視吸収スペクトルは、750 紫外可視近赤外分光光度計 (Perkin-Elmer ラムダ) を使用して記録されました。 Trojan BLI プローブのフォトルミネッセンス スペクトルは、分光蛍光光度計 (HORIBA JOBIN YVON FLUORMAX-4) を使用して記録しました。 トロイの木馬 BLI プローブの生物発光スペクトルは、HITACHI 蛍光分光計 F-4700 機器を使用して記録されました。 トロイの木馬 BLI プローブの動的光散乱 (DLS) およびゼータ電位は、Delsa™ ナノサブミクロン粒径およびゼータ電位粒子分析装置 (Beckman Coulter, Inc) を使用して測定されました。 インビトロでの細菌の蛍光イメージングは​​、共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM、Leica、TCS-SP5 II) を使用して実行されました。 エクスビボおよびインビボの蛍光および生物発光画像は、インビボ光学イメージングシステム（IVIS Lumina III）によって取得されました。 IVIS Lumina III イメージング システムを使用して、さまざまな溶液中の GP-Si-BP の発光シグナルを調べました。 この目的を達成するために、黒色の 96 ウェル プレート内で、0.06 mM の GP-Si-BP をさまざまな濃度の ATP と混合しました。 完全に混合した後、プレートを直ちにイメージングシステムに入れ、発光シグナルを取得しました。 同様に、GP-Si-Luc の存在下で ATP 阻害剤である DCC とインキュベートした後、GP-Si-BP の減衰した発光を定量しました。

臨床由来の多剤耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) および多剤耐性大腸菌 (MDR 大腸菌) は角膜炎患者から分離され、復旦大学眼耳鼻咽喉科病院アイバンクから供給されました。病院倫理委員会 (ENTIRB-2017-06-07-01) の承認の下で。 大腸菌 (ATCC 11303) および黄色ブドウ球菌は、アメリカン タイプ カルチャー コレクション (ATCC) から購入しました。 Micrococcus luteus (BNCC 102589)、Pseudomonas aeraginosa (BNCC 125486)、および Salmonella typhimurium (BNCC 108207) は、BeNa Culture Collection (BNCC、上海、中国) から購入しました。 LB 培地は Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. から購入しました。細菌を培養するには、まず菌株の凍結乾燥粉末を LB 液体培地に溶解し、その菌液を LB 平板培地に塗布して培養しました。 37℃で12時間インキュベーター。 その後、プレートからシングルコロニーを取り出し、250 rpm、37℃のインキュベーター内のLB液体培地で培養しました。 指数関数的増殖期にある細菌細胞を収集しました。 細菌の濃度は、600 nm での光学密度 (OD) を測定することによって検出されました。 細菌コロニーの数は、コロニー計数装置（Czone 8）によって計数された。 実験はヘルシンキ宣言に従い、中国の法律に従って実施された。

精製および再懸濁した細菌懸濁液 (1.0 × 107 CFU) 20 μL を GP-Si-BPs (0.06 mM、200 μL)、GP-Si-Luc (0.06 mM、200 μL)、GP-Si- BP (0.06 mM、200 μL) + GP-Si-Luc (0.06 mM、200 μL)、Si-BP (0.06 mM、200 μL)、Si-Luc (0.06 mM、200 μL) および Si-BP (0.06 mM) 、２００μＬ）＋Ｓｉ−Ｌｕｃ（０．０６ｍＭ、２００μＬ）を３７℃の振盪インキュベーター（２５０ｒｐｍ）中で２．５時間培養した。 混合物をエッペンドルフ（ＥＰ）チューブ中で３３８１×ｇで５分間遠心分離することによって細菌を回収した。 得られた細菌を再懸濁し、PBSで3回洗浄した。 次に、洗浄した細菌溶液 10 μL をカバースリップで覆われた顕微鏡スライドに移し、30% の出力のダイオード レーザーを使用して共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM、Leica、TCSSP5 II) によって画像化しました。 すべての蛍光画像は、64 倍油浸対物レンズを使用した CLSM によって取得され、同じ光学条件下で撮影され、顕微鏡によって自動的に同じ明るさとコントラストが画像に適用されました。 ROI の処理と分析は、市販の画像分析ソフトウェア (Leica Application Suite Advanced Fluorescent Lite) によって実行されました。 さらに、細菌細胞内の GP-Si-BP の出現は TEM (Philips CM 200) によって確認されました。

すべての動物実験手順は、東州大学の動物管理委員会によって承認されたプロトコールに従って実行されました。 マウスの飼育条件は、換気装置と空気濾過システムによって調整された 25 °C、湿度 65% でした。 マウスで STm 誘発性大腸炎を構築するために、雌ヌードマウス (SPF グレード、6 ～ 8 週齢) を STm の経口投与前に 100 μL のストレプトマイシン溶液 (200 mg mL-1) で処理しました。 感染後 2 日目に、マウスに GP-Si-BP または Si-BP (0.06 mM、200 μL) を静脈内注射しました。 プローブ注射の 6 時間後、処理マウスに GP-Si-Luc または Si-Luc (0.06 mM、200 μL) を腹腔内注射し、続いて in vivo 光学イメージング システム (IVIS Lumina III、露出) を使用して BLI を行いました。時間 = 5 分、f/ストップ = 1、ビニング = 8、FOV = 21.8 cm)、基質の注入後 15 分で。 比較のために、感染マウスにルミノール (282 mM、200 μL) を腹腔内注射し、続いて in vivo 光学イメージング システム (IVIS Lumina III、露出時間 = 5 分、f/stop = 1、ビニング = 1) を使用して BLI を行いました。 8、FOV = 21.8 cm）、注射後 10 分。 腸組織の採取、均質化、CFU カウントによる培養を利用して、イメージング中に感染部位の実際の細菌数を決定しました。 イメージング中の感染部位の実際の STm 濃度は約 1.0 × 109 CFU でした。 提案された戦略の選択性をテストするために、マウス (メス、6 ～ 8 週齢、n = 3) で DSS 誘発性大腸炎を構築しました。 DSS 大腸炎担持マウスを、発光イメージング (IVIS Lumina III、露出時間 = 5 分、 f/stop = 1、ビニング = 8、FOV = 21.8 cm)、上記の STm 大腸炎担持マウスと同じ方法で。 マウスで黄色ブドウ球菌誘発性腎炎を構築するために、25 μL の黄色ブドウ球菌をヌードマウス (雌、6 ～ 8 週齢、n = 3) の腎臓に in situ 注射しました。 注射の12時間後、感染マウスに200μLの0.06 mM GP-Si-BPまたはSi-BPを静脈内注射した。 6 時間後、これらのマウスに GP-Si-Luc または Si-Luc (0.06 mM、200 μL) を腹腔内注射し、光学イメージング システム (IVIS Lumina III、露出時間 = 5 分、f) を使用して in vivo イメージングを行いました。 /ストップ = 1、ビニング = 8、FOV = 21.8 cm)、注射後 15 分。 イメージング中の感染部位の実際の黄色ブドウ球菌濃度は約 1.0 × 108 CFU であり、これは前述のように腎臓組織の採取、均質化、および CFU カウントによる培養を通じて決定されました。 また、他の腎炎よりも細菌性腎炎に対する提案された戦略の選択性をテストするために、マウス（雌、6〜8週齢、n = 3）でグリセリン起因性腎炎を構築しました。 グリセリン腎炎担持マウスを、発光イメージング (IVIS Lumina III、露出時間 = 5 分、 f/stop = 1、ビニング = 8、FOV = 21.8 cm)、上記の DSS 腎炎担持マウスと同じ方法で。

黄色ブドウ球菌または大腸菌をそれぞれ PBS または GP-Si-BP とインキュベートし、808 nm レーザーを照射しました (808 nm レーザー:1.0 W cm-2、5 分間)。 処理後の細菌の形態は、SEM (FEI Quanta 200 F) を使用して特徴付けられました。 黄色ブドウ球菌、大腸菌、ルテウス菌、緑膿菌、MRSA、MDR 大腸菌をそれぞれ PBS、SiNP、Si-BP、GP-Si-BP で処理し、808 nm レーザーを照射しました。 -nm レーザー、1.0 W cm−2、5 分）。 インビトロでの抗菌率は、寒天プレート上の細菌コロニーに基づいて得られました。 抗菌率は式(1)に従って計算されました。 (1):

ここで、「Ncontrol」および「Nexperiment」は、それぞれ「PBS」の対照群および他の実験群（実験）における細菌数（CFU mL-1）を表します。

我々は、マウスの黄色ブドウ球菌誘発性腎炎を使用して、開発された戦略の抗菌能力を in vivo で評価しました。 モデルを構築するために、黄色ブドウ球菌 (25 μL、約 1.1 × 106 CFU) をマウス (雌、6 ～ 8 週齢、n = 3) の左腎臓に in situ 注射しました。 注射の６時間後、１日目、３日目、５日目、および７日目に、これらのマウスに２００μＬの０．０６ｍＭ ＧＰ－Ｓｉ－ＢＰまたはＰＢＳ緩衝液をそれぞれ静脈内注射した。 各薬物注射の6時間後、808nmレーザーを使用または使用せずに感染部位を照射しました（1.0W cm-2、5分）。 光熱療法の後、感染した腎臓組織を抽出し、ホモジナイズし、プレート上でホモジネートを培養しました。 対応する抗菌率は式(1)に基づいて計算されました。 (1)。 一方、処理後の感染腎臓組織は、次の H&E 染色のために 4% PFA 溶液で固定されました。

ヒト胎児腎臓 293 T 細胞 (HEK-293T 細胞)、ヒト子宮頸細胞 (HeLa 細胞)、ヒト乳がん細胞 (MCF-7 細胞)、およびマウス網膜内皮細胞 (mREC 細胞) を、高濃度のダルベッコ改変イーグル培地で培養しました。グルコース (H-DMEM) は、Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd (中国) から購入しました。 上記のすべての培地には、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS) および 1% の関連抗生物質 (100 μg mL-1 ストレプトマイシンおよび 100 U mL-1 ペニシリン) が補充されました。 すべての細胞株は、加湿雰囲気の 5% CO2 インキュベーター内で 37 °C で培養されました。

人間の血液サンプルは、書面によるインフォームドコンセントに従って健康なボランティアによって提供されました。 ヒトの血液サンプルを使用した研究プロトコールは東州大学の倫理委員会によって承認されました。 著者らは、すべての人体血液実験は関連する法律および制度上のガイドラインに厳密に従って行われたと述べています。 硝子体手術を受けている細菌性眼内炎患者 10 人を対象に、診断用毛様体扁平硝子体切除術 (PPV) 中に、汚染されていない非希釈硝子体液サンプル (0.1 ml) を 30 G の針が付いた注射器に採取しました。 収集後すぐに、サンプルを滅菌済みの微量遠心管に移し、イメージングに使用しました。 これらの臨床サンプルは、病院倫理委員会 (ENTIRB-2017-06-07-01) の承認の下、復旦大学眼耳鼻咽喉病院アイバンクからも提供されました。

統計的有意性検定には、一元配置分散分析または対応のある両側 t 検定を使用しました。 統計解析は、OriginまたはGraphPad Prismのソフトウェアを使用して実行されました。 エラーバーは、3 つの独立した測定から得られた標準偏差を表します。 蛍光強度の定量的評価には関心領域 (ROI) を使用し、市販の画像解析ソフトウェア (Leica Application Suite Advanced Fluorescent Lite 2.6.0、LAS AF Lite 2.6.0) によって計算しました。

実験のグループサイズは、再現性を確保し、標準偏差を決定するために十分な数が使用されるように、以前の経験と文献の先例に基づいて選択されました。 動物の数は少なくとも 3 匹でした。各サンプルについて 2 回の技術的反復を実行しました。 テクニカルレプリケート間に 20% 以上の差異があった場合は、さらに 2 回のテクニカルレプリケートを実行しました。 すべての実験は、実験グループごとに少なくとも 3 つの複製サンプルを使用して実行され、複製のすべての試みが成功したことを確認しました。 分析から除外されたデータはありません。 サンプルはランダムに実験グループに割り当てられました。 すべてのデータ収集と分析は、無作為化されたサンプルを用いて盲検化されたものから行われました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究結果を裏付けるデータは、論文およびその補足情報内で入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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Shuit-Tong Lee 教授（蘇州大学、中国）、Chunhai Fan 教授（上海交通大学、中国）、Fei Peng 博士（ハーバード大学、米国）の全般的な支援と貴重な提案に感謝します。 YHは、この研究で説明されている研究に対する中国国立自然科学財団[助成金番号21825402]、江蘇高等教育機関の優先学術プログラム開発(PAPD)によって資金提供されたプロジェクト、ヤオ・ヘ教授への江蘇省特任教授プログラムからの支援を明らかにしています。 ）、蘇州ナノ科学技術の111プロジェクトおよび共同イノベーションセンター（NANO-CIC）。 HYW は、この研究で説明されている研究に対する中国国立自然科学財団 [助成金番号 22074101] および中国江蘇省自然科学財団 [助成金番号 BK20191417] からの支援を開示しています。 JXHは、この研究で説明されている研究に対する中国国立自然科学財団[助成金番号81970766、82171102]、上海イノベーション開発プログラム[助成金番号2020-RGZN-02033]、および上海重点臨床研究プログラム[助成金番号SHDC2020CR3052B]からの支援を開示しています。 ]。 BS は、この研究で説明されている研究に対する中国国立自然科学財団 [助成金番号 22204116] および中国江蘇省自然科学財団 [助成金番号 BK20200851] からの支援を開示しています。 BBC は、この研究で説明されている研究に対する中国国家自然科学財団 [助成番号 22204117] および中国博士研究員科学財団 [助成番号 2021M692347] からの支援を明らかにしています。

これらの著者は同様に貢献しました: Qian Zhang、Bin Song、Yanan Xu。

蘇州ナノテクノロジーおよびバイオ医学重点実験室、機能性ナノおよびソフト材料研究所および蘇州ナノ科学技術協同イノベーションセンター (NANO-CIC)、蘇州大学、蘇州、215123、中国

Qian Zhang、Bin Song、Yanan Xu、Yunmin Yang、Jianping Lu、Jiali Ding、Haiting Cao、Binbin Chu、Houyu Wang、Yao He

中国、上海、復旦大学、上海眼耳鼻咽喉科病院眼科・視覚科学科

Jian Ji、Wenjun Cao、Jiaxu Kong

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QZ、BS、JXH、YNX、YMY、HYW、および YH が研究を考案し、設計しました。 QZ と BS はほとんどの実験を実行し、データを分析しました。 YMY、JJ、WJC、JPL、JLD、HTC、および BBC は追加の実験と特性評価を実行しました。 QZ、YNX、JXH、HYW、YHが原稿を執筆しました。

Jiaxu Hon、Houyu Wang、Yao He への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた他の匿名の査読者に感謝します。 査読レポートが利用可能です。

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転載と許可

Zhang、Q.、Song、B.、Xu、Y. 他。 ATP結合カセット糖輸送体を介した深部組織内の天然細菌の生体内生物発光イメージング。 Nat Commun 14、2331 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37827-9

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受信日: 2022 年 10 月 27 日

受理日: 2023 年 4 月 3 日

公開日: 2023 年 4 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37827-9

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