高い

Nature Biotechnology (2023)この記事を引用

24k アクセス

5 引用

172 オルトメトリック

メトリクスの詳細

純粋な細菌培養は、マイクロバイオーム研究における詳細な実験的および機構的研究には依然として不可欠であり、複雑な微生物生態系から個々の細菌を単離する従来の方法は、労働集約的であり、スケールアップが難しく、表現型と遺伝子型の統合が欠けています。 ここでは、オンデマンドで分離株を迅速に生成するための、オープンソースのハイスループットロボットひずみ分離プラットフォームについて説明します。 私たちは、コロニー形態とゲノムデータを活用して、単離された微生物の多様性を最大化し、特定の属の的を絞った選択を可能にする機械学習アプローチを開発します。 このプラットフォームを 20 人のヒトの糞便サンプルに適用すると、豊富なすべての分類群の >80% に相当する合計 26,997 個の分離株を含む個別化された腸内マイクロバイオーム バイオバンクが得られます。 視覚的に捕捉された 100,000 個を超えるコロニーの空間解析により、重要な微生物相互作用を示唆するルミノコッカス科、バクテロイダ科、コリオバクテリア科、およびビフィズス菌科間の共増殖パターンが明らかになりました。 これらのバイオバンクからの 1,197 個の高品質ゲノムの比較分析により、興味深い個体内および個体間の系統進化、選択、および水平遺伝子伝達が示されています。 このカルチュロミクスの枠組みは、多くの新興マイクロバイオーム研究のための高解像度ゲノミクスデータを使用した画像ベースの表現型の収集と定量分析を体系化する新しい研究の取り組みを可能にするはずです。

メタゲノミクスは、土壌群集から腸内マイクロバイオームに至るまでの多様な微生物生態系の構成を幅広く調査する機能を提供します。 しかし、微生物は、生息地における機能的役割や、発生する無数の種間プロセスを機械的に分析するために、単離および培養する必要がある。 「強引な」ランダムなコロニーの選択に依存する従来の栽培方法は、退屈で労働集約的です1、2、3、4。 96 ウェルまたは 384 ウェルを使用する段階希釈ベースの分離方法はリソースを大量に消費し、集団から同じ優勢株を繰り返し分離することになります5。 マイクロ流体システムはナノリットル反応器内での増殖を可能にしますが、クローン分離株を抽出するのは困難です6,7。 典型的なマイクロバイオームには、尾の長い豊富な分布8を示す数百から数千の固有の種が含まれる可能性があることを考えると（つまり、少数が優勢で、ほとんどが希少である）、体系的な培養学を通じて包括的な株コレクションを作成することは、依然として重要かつ未解決の課題です。

微生物は、特定の培地で増殖する能力や生成する代謝産物など、多様な表現型に基づいて区別できます9、10、11、12。 増殖ベースの選択により、たとえば、さまざまな栄養素や抗生物質を含む増殖培地を使用して、希少種の分離を強化できます1、2、13。 質量分析スペクトルは種を区別するために使用できます 14,15 が、このアプローチはスループットが低く、手動処理が必要です。 イメージングによるセルソーティングは、多次元画像に基づいて真核細胞を分離するために開発されましたが、この方法は高度な機器を必要とし、細菌に対しては実装されていません 16。 人工知能 (AI) と、多次元イメージングと生物学的データの微妙な特徴を識別するように訓練された深層学習モデルの最近の進歩により、表現型とゲノムのデータ ストリームを組み合わせた機械学習 (ML) が、次世代の微生物培養学を変革する準備が整っています。

ここでは、オンデマンドで培養バイオバンクを迅速かつハイスループットに生成できる、ML 誘導ロボットによる菌株分離およびジェノタイピング プラットフォームについて説明します。 このシステムは、インテリジェントなイメージングベースのアルゴリズムを使用して、ランダム選択法と比較して文化学の分類学的多様性を高めます。 我々は、20人のヒト参加者向けにパーソナライズされた分離株バイオバンクを嫌気的に生成することにより、このシステムの有用性を実証しました。これにより、394の16Sアンプリコン配列バリアント（ASV）にわたる、1,197の高品質ドラフトゲノムを含む合計26,997の分離株が得られました。 各分離株のゲノム情報と形態学的情報のペアを使用して、コロニー形態のみに基づいて分類学的同一性を予測できる ML モデルをトレーニングしました。 この ML モデルの適用により、目的の微生物の標的を絞った分離が向上しました。 寒天プレート上で増殖したすべてのコロニーの大規模画像解析により、興味深い種特異的な増殖パターンと種間相互作用が明らかになりました。 パーソナライズされたバイオバンクからの全ゲノム解析により、主要な腸門内のヒト特異的な株レベルの変動と水平遺伝子伝達（HGT）の特徴が明らかになりました。 さらに、マイクロバイオーム分野の独自かつ拡大するコミュニティリソースとして、自動培養学によって生成されたすべての分離株の検索可能な遺伝子型、形態学的および表現型データを含むオープンアクセスのウェブベースデータベース（http://microbiological-culturomics.com/）を開発しました。

コロニーピッキングは、細菌株をクローン的に分離するための古典的な微生物学の方法です。 プレート上でのコロニーの成長は、培地の組成 (利用可能な栄養素など)、大気条件 (酸素化レベルなど)、阻害分子の存在 (抗生物質など)、pH、湿度、影響などの多くの要因に依存します。近隣のコロニーに由来する他の拡散性代謝産物18、19、20。 異なるコロニー形態は、細胞の形状、剛性、運動性、成長動態、色素分子または細胞外マトリックスおよび界面活性剤の産生の影響を受ける株固有の生理学的差異に基づいて観察されます9、10、11、12。 これらのコロニーの形質は容易に定量化できますが、コロニーの分離中に記録されることはほとんどありません。 その結果、視覚的特徴を使用した選択的コロニーピッキングは一般に定性的で標準化されておらず、結果は実験と実験者の間で大きく異なる可能性があります。 これらの欠点に対処するために、我々は、コロニーの単離と機能分析のための形態学的データと遺伝子型データの両方を使用してカルチュロミクスを体系化する、Culturomics by Automated Microbiome Imaging and Isolation (CAMII) と呼ばれるプラットフォームを考案しました。

CAMII プラットフォームは、以下に説明する 4 つの主要な要素 (図 1a) で構成されます。(1) コロニーの形態データを収集するイメージング システムと AI 誘導コロニー選択アルゴリズム、(2) 高品質のコロニー ピッキング ロボット(3) 選択された分離株のゲノムデータを迅速に生成するための費用対効果の高いパイプライン、(4) 検索可能なコロニー形態、表現型、および遺伝子型情報を備えた物理的分離株バイオバンクおよびデジタル データベース。 したがって、このエンドツーエンドの培養学プラットフォームは、手作業を最小限に抑えて、多様な入力マイクロバイオームから分離コレクションを生成できます。 画像化および分離システム全体は、温度、湿度、酸素レベルのリアルタイム制御を提供する嫌気性チャンバーに収容された既製のコンポーネントを使用して構築されています（図1bおよび補足表1）。 CAMII ロボットは 1 時間あたり 2,000 コロニーの分離スループットを備え、1 回の実行で 12,000 コロニーを処理できます。これは、人間による手動コロニー分離よりも 20 倍を超える処理能力と迅速さです。 当社のゲノム解析能力がロボットによる単離スループットと確実に一致するようにするために、液体処理の自動化を利用して 16S rRNA シーケンシングまたは全ゲノムシーケンシング用のバーコード化ライブラリを生成する、低コストでハイスループットのシーケンシング パイプラインも開発しました (WGS、メソッド)。 このパイプラインの分離株あたりのコストは、Illumina HiSeq プラットフォームで 60 倍を超えるカバレッジで、コロニー単離とゲノム DNA (gDNA) 調製で 0.45 ドル、16S rRNA シーケンスで 0.46 ドル、WGS で 6.37 ドルであり、商用サービスよりも大幅に安価です (補足表 2)。

a、表現型および形態に基づく菌株の単離およびヒト腸内マイクロバイオームのデータ収集のフレームワーク。 ヒトの糞便サンプルをさまざまな抗生物質の選択の下で播種および培養し、形態学的に多様なコロニーを単離し、バイオバンクに保存し、ダウンストリームシークエンシングによって分析しました。 b、自動嫌気性微生物分離培養システム CAMII のセットアップ。 c、CAMII での形態誘導コロニー単離の図。 プレート上で増殖したコロニーは、透過照明および落射照明の下で画像化され、輪郭セグメンテーションおよび形態学的特徴抽出が行われます。 データは PCA によって分析され、形態学的に最も多様なコロニーのセットが特定され、統合されたコロニー ピッカーによって分離されます。 d、プレート上の多様なコロニー形態の図。 コロニーのサイズと形状の特徴は透過照明画像から抽出され、コロニーの色の特徴は落射照明画像から抽出されました。 e. 糞便サンプル H1t1 を 7 種類の抗生物質とともに培養し、家族レベルでの 16S 分析によって最もユニークで多様な細菌を生成する能力を評価しました。 シプロフロキサシン、トリメトプリムおよびバンコマイシンは、その後のコロニー単離のために選択されました。 f、3つのヒト糞便サンプルH1t4、H5t1、およびH6t1のランダム分離と比較した、表現型に基づく分離から得られた固有のASVの数。 分離は CAMII によって実行されました。 ランダム分離は、プレート上で検出されたすべてのコロニーのランダムなサブセットに対して実行され、表現型に基づく分離は、アルゴリズムによって形態学的に選択されたコロニーに対して実行されました（補足図1b）。 P 値は、曲線下の面積に対する両側対応のある t 検定によって計算されます。 曲線上のリボンは、アルゴリズムによって取得された一意の ASV の数の標準偏差を表します。

CAMIIプラットフォームの重要なユニークな機能は、細菌コロニーの形態学的データを収集して学習するイメージングシステムです（図1c）。 具体的には、コロニーの高さ、半径、円形度を示す透過照明画像と、色やしわなどの複雑な形態学的特徴を示す落射照明画像を CAMII 上でキャプチャして、多次元で定量化可能な形態学的データセットを生成します。 さまざまな形態学的特徴に沿ってコロニーをセグメント化するカスタムコロニー分析パイプラインを開発しました（方法;補足表3および補足図1）。 面積、周長、平均半径はコロニーのサイズを反映し、円形度、凸面、慣性はコロニーの形状を明らかにします。 赤、緑、青（RGB）チャネルのピクセル強度とその分散は、コロニー全体の濃度グラデーションと色を強調表示します（図1d）。 次に、形態学的に異なるコロニーは系統発生的に多様である可能性が高く、これをコロニーの分離を改善するために使用できる可能性があると推論しました。 したがって、我々は、捕捉された特徴に基づいて多次元ユークリッド空間にコロニーを埋め込み、形態学的に最も明確なコロニーを表すこの空間内で最大限に離れた点を選択することにより、より多様な分離株を分離するための画像誘導型「スマートピッキング」戦略を開発した（補足図1;補足図1;方法）。 培養および検査できる細菌の多様性をさらに高めるために、CAMII はさまざまな抗生物質サプリメントを使用して、最もユニークで多様な微生物のサブセットを強化しています 1,13 (補足図 2a、b)。 たとえば、健康なヒトの腸内微生物叢サンプル（H1t1）では、異なる作用機序を持つ 3 つの抗生物質（シプロフロキサシン、Cip、トリメトプリム、Tmp、バンコマイシン、Van）が最も異なる濃縮培養を誘発しました（図 1e および補足図 2c）。 。

画像誘導コロニー単離の能力と忠実度を体系的に評価するために、3 人のボランティアからの腸内マイクロバイオームサンプルに CAMII を適用しました (H1t4、H5t1、および H6t1; 補足表 4)。 プレーティングされたコロニーからの形態学的データを主成分分析（PCA）によって分析し、最も有益な視覚的特徴を評価しました（図1cおよび補足図1c;方法）。 興味深いことに、コロニー密度とサイズは最も支配的な特徴であり（それぞれ主成分1と2）、合わせて形態学的分散の72.0％を占めました（補足図3）。 次に、CAMII ロボットを使用して 6,144 個のコロニーを分離しました。そのうちのおよそ半分は mGAM プレートからランダムに採取され、残りの半分は画像誘導による「スマート ピッキング」戦略と抗生物質選択を使用して採取されました。 分離株を 384 ウェルで増殖させ、分類を同定するために 16S rRNA 配列決定を行いました。 次に、固有の 16S V4 配列が、おおよその種レベルの同一性を提供する ASV (100% 同一性カットオフ) にクラスター化されました 21。 注目すべきことに、表現型データによって情報を得たコロニー分離では、3 つすべてのマイクロバイオームサンプルのランダム分離と比較して、実質的により多様な ASV セットが得られました (図 1f)。 たとえば、30 個の固有の ASV を取得するには、ランダム選択では 410 ± 218 個のコロニーが必要であるのに対し、イメージング選択戦略を使用すると 85 ± 11 個のコロニーのみを単離する必要があります。 注目すべきことに、この強化された分離効率はピッキング全体を通じて維持され、望ましい分離深さの範囲で私たちの戦略を使用することに持続的な利点があることを意味し（補足図4a）、生成された分離株コレクションは基礎となる入力微生物の多様性をよりよく表しており、シャノンの公平性によって測定されるように、組成は実質的により均一です（補足図4b）。 分離株の系統解析により、CAMIIに最適化されたコロニーピッキングにより、取得された微生物の多様性が大幅に改善されることが示されました（補足図5）。 この利点は、分離株の数が増加するにつれて、固有の ASV を見つけることが漸近的に困難になることを考慮すると特に明らかです。 まとめると、これらの結果は、CAMII プラットフォームにおける AI 誘導のデータ駆動型分離フレームワークが、カルチュロミクスの効率を大幅に向上させ、特に希少種を分離する労力を軽減できることを実証しました。

異なる人々のマイクロバイオームは類似した一連の細菌種を共有している可能性がありますが、これらの種に属する菌株は個人に非常に固有であり、同じ宿主に長年にわたって共定着する可能性があります 22,23。 我々は、20人の健康な人向けにパーソナライズされた腸分離株コレクションを生成するためのCAMIIの有用性を紹介しようとしました（補足表4および補足図6a、b）。 合計102,071個のコロニーが視覚的に分析され、26,997個のコロニーが選択され、16S rRNAシーケンスによって分類学的に同定され（図2a）、健康な共生腸内微生物叢の広範な多様性をカバーする394個の固有のASVが得られました（図2b、cおよび補足表5） ）。

a, 20 の個別化された腸分離バイオバンクの統計。 b、この研究では26,997の腸内微生物叢分離株によってカバーされた394のASVの系統樹。 16S V4 配列に基づいて近隣結合系統樹を構築しました。 枝の色は細菌門を区別し、外側の円は 20 のバイオバンクにおける分離された ASV の蔓延を示します。 c、上位 20 の家族レベルの分類における分離株の数。 d、元の糞便サンプル中の個別バイオバンクからの分離株によって表される ASV の蓄積された相対存在量。 バーはコレクション全体の任意の個人からの分離株を示し、赤い線は同じ人に由来する分離株を示します。 e、元の糞便サンプル中の豊富なASVの相対的な存在量とバイオバンク内の存在の有無に関するヒートマップ。 平均相対存在量 > 0.1% の ASV が表示され、左側のサイドバーはその家族レベルの分類を表します。 パーソナライズされたバイオバンクで見つかった ASV は、右側のヒートマップで黒いバーとして表示され、どのバイオバンクでも見つからなかった未培養の ASV が強調表示されます。 f、元の糞便サンプル中の平均相対存在量と、ASV のコレクション全体における分離株数の相関関係。 培養が困難な、つまり分離菌数が少ない、非常に豊富な ASV が強調表示されます。 g, 上位に豊富に存在する ASV の平均相対存在量ですが、コレクション全体で分離株が 2 つ以下です。 バーの色は家族レベルの分類を表します。

この分離株コレクションの包括性を評価するために、バルク 16S rRNA シーケンスによって、対応する糞便サンプル中の分離された ASV の存在量を計算しました（図 2d）。 注目すべきことに、各個体について、存在量ベースで 80.9 ± 9.4% の ASV が分離株コレクション全体で少なくとも 1 回存在します。 各個人に由来する分離株は、その個人内の総細菌性 ASV 量の平均 45.6 ± 21.6% を構成しました (図 2d)。 さらに、分離株コレクションと大量の糞便サンプルを比較すると、非常に豊富で蔓延しているASVのほとんどがコレクション内で少なくとも1回分離されていることが示されました（補足図6c-e）。 さらに、各パーソナライズされた分離株コレクションは、同等のマイクロバイオームプロファイルとシャノンの多様性指数を備えた大量の糞便サンプルを模倣しています（補足図6f、g）。

全体として、我々は、CAMII を使用して、リンクされた形態学的、表現型、分類学的および WGS データの豊富なセットを備えた、394 の ASV にわたる 26,997 の分離株を含む深層ヒト腸分離株コレクションを構築することを実証しました。 研究コミュニティにとっての有用性を高めるために、ゲノム、表現型、画像を含むすべての CAMII 対応バイオバンク データを保管する検索可能なオンライン リソース (http://microological-culturomics.com) をさらに開発しました。 私たちは、このポータルが遺伝子型から表現型へのさらなる分析を促進し、他の環境からのより多くの分離株コレクションの共有につながることを想定しています。

これまでの研究では、さまざまな環境に由来する多くの微生物を実験室で培養するのが難しいことが観察されています 24,25。 したがって、私たちは体系的に生成した分離株バイオバンクを活用して、ヒト腸内マイクロバイオームの培養性を評価し、実験環境での分離が依然として困難な細菌性ASVを特定しました。 20 個の個別分離株コレクションすべてにわたって、バルク糞便中に豊富な ASV (平均相対存在量 > 0.1%) がバイオバンクで見つかるかどうかを確認しました。 特に、未培養の腸内細菌のかなりの部分はルミノコッカス科およびラクノスピラ科に属しており（図2eおよび補足表6）、これも以前に「培養不可能」であると記録されています24。 各ASVについて、総分離株コレクションで生成された分離株の数と大量の糞便中の平均存在量を比較しました（図2f）。これは正の相関があるように見えました。 それでも、フェカリバクテリウムASV-58、プレバテラASV-470およびASV-324、オシリバクターASV-215、クロストリジウムXIVa ASV-287を含む、豊富だが培養が難しい一連の細菌を同定しました（図2g）。 興味深いことに、我々が 1 つの分離株を取得し、WGS を実行したフェカリバクテリウム ASV-58 は、Candidatus cibiobacter qucibialis のメタゲノム構築ゲノム (MAG) に対して、ゲノム全体の平均ヌクレオチド同一性 (ANI) >98% で一致しました。 私たちのコレクションにあるこの菌株は、ヒトの腸内に最も豊富に存在する非培養種として以前に報告されており 25、他のフェカリバクテリウム菌株と同様に、炎症性腸疾患 (IBD) 患者では高度に減少しています 26。

さらに、バイオバンク内の分離株を WGS による既存のデータベース 1,3,22,25 と比較し、参照コレクション (BIO-ML、CGR、および HMP) では栽培されていないが、SGB の MAG にのみ関連付けられている 11 種を追加で特定しました。コレクション (補足図 7 および補足表 7)。 たとえば、Faecalibacterium ASV-58 以外に、我々は別の豊富な種 Faecalibacterium sp. を単離しました。 ASV-76 は、大量の糞便中に平均して 3% を超える相対存在量を示し、培養可能な腸内マイクロバイオームのコレクションをさらに拡大します。 まとめると、これらの結果は、現在の培地と増殖条件に基づいて、培養分離株と残りの欠落している多様性を強調し、これらの「暗黒物質」腸内マイクロバイオームに焦点を当てた将来の培養学研究の指針となる方向性を提供します（補足表6）。

マイクロバイオームサンプルから目的の細菌を集中的に培養することは、メカニズムの研究にとって非常に重要です。 残念ながら、私たちはほとんどの細菌種を特定の方法で選択的に培養する能力がありません。 したがって、多数のコロニーを選択し、統計的確率に依存することが、目的の細菌を取得するための唯一の実用的な解決策となります。 ただし、この戦略は、手動で何千ものコロニーを選択する必要があるため、多くの場合、リソースをあまりにも消費します。 CAMII は、分類学的アイデンティティとコロニー形態の関連付けに基づいた、ML に基づく自動コロニー選択方法を提供するため、理論的には標的分離を強化できます。 これをテストするために、我々は深部腸分離株コレクションを体系的に調査して、形態学的データと遺伝子型データの間の関係を分析しました。 興味深いことに、異なる属のコロニーは多様な形態学的パターンを示しました（図3a、b）。 たとえば、ドレア、バクテロイデス、およびコリンセラのコロニーは一般に大きくて密ですが、異なる円形度 (コリンセラ > バクテロイデス > ドレア) を示し、それらの増殖特性の違いを反映しています。 一方、フェカリバクテリウムのコロニーは、培養能が低いという我々の以前の結果と一致して、小さくて色が薄い。 さらに、コロニーの形態は、系統発生に従って著しくクラスター化されています（図3cのPERMANOVAテストによるP = 0.008）。 たとえば、クロストリジウム属のほとんどの属は、形態学に基づいた序列によって互いに近くなっています（図3c）。 したがって、コロニーの形態には、分類学的アイデンティティに関連付けられる可能性のある大量の情報が含まれている可能性があります。

a、さまざまな細菌属にわたる形態学的特徴の平均 Z スコアのヒートマップ。 多様な形態パターンを示すさまざまな属は、階層的クラスタリングによってさまざまなグループに分類され、右側の色付きの点はそれらのクラスレベルの分類を表します。 b, コロニー画像の例。 透過照明画像は左側にあり、落射照明画像は右側にあります。 c、コロニーの形態学的特徴に基づいた属のPCA配列。 色はクラスレベルの分類を示します。 d、ランダムフォレスト分類器による形態学的特徴に基づく細菌属予測のパフォーマンス。 括弧内の数字は、各属の分離株の数を表します。 モデルのトレーニングと評価は 20 回ブートストラップされ、箱ひげ図はパフォーマンスの分散を示しています (n = 20)。 青い線は null モデルのパフォーマンスを表します。 箱ひげ図要素の定義 - 中心線、中央値。 ボックス制限、第 25 四分位数の上限と下位。 ひげ、1.5×四分位範囲。 e. モデルベースのターゲット分離のパフォーマンス。 バーは 20 回ブートストラップされた個別固有のモデルによる予測精度の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表します。 P 値は、n = 20 のランダムに初期化されたモデルのブートストラップからの精度に関する両側スチューデント t 検定によって計算されました。

我々は、プレート上のコロニーの形態学的情報を組み込むだけで、コロニーの分類学的同一性を独自に予測できるかどうかを評価しました。 ランダムに選択された分離株のサブセット（全体の 70%、方法）からの形態学および分類学のデータを使用して、ランダム フォレスト分類モデルをトレーニングしました。 モデルのパフォーマンスは、残りの 30% の分離株について評価されました。 注目すべきことに、私たちのモデルは、トレーニングデータセットに100以上の分離株が含まれるほとんどの属で約70％の精度を達成しました（図3d）。 属レベルでの再現率はより幅広くばらつきがあり、より洗練されたモデルを使用して追加のユニークなコロニーの特徴を学習する機会が開かれていることを強調しています 27,28,29。 Eggerthella などの一部の属は精度と再現率が高く、高度に保存されたユニークなコロニー形態が分類学的予測に特に活用できることを示しています。 同じASVからの分離株を分析した場合、コロニーの形態は、同じ人物内の分離株では高度に保存されているが、異なる人からの分離株間でははるかにばらつきがあることがわかりました（補足図8）。 通常、異なる人が同じ種の異なる株を保有していることを考えると、私たちの結果は、コロニーの形態に株レベルの高度な変動があることを示唆しました。

AI に基づいたコロニーの特徴が標的微生物の分離を改善できるかどうかを評価するために、次にバイオバンクでランダム フォレスト モデルをトレーニングし、3 人の異なる人々 (H12、H13、H14) からデータを分離しました。 このモデルを使用して、同じ糞便サンプルに由来する新しいプレートからビフィズス菌、パラバクテロイデス、およびエッガーテラのコロニーを予測し、その後コロニーを CAMII によって単離し、16S rRNA を配列して分類学的同一性を確認しました（方法）。 注目すべきことに、形態ガイドに基づくピッキングにより、これらの標的属の単離効率が平均で最大8倍も大幅に向上し（図3e）、ピッキングの精度が大幅に向上し、目的の微生物を見つけるために多くのコロニーをスクリーニングする必要性が軽減されました。 これらの結果は、表現型を遺伝子型に関連付け、視覚的なコロニーの特徴だけから分類学的予測を実証する当社のバイオバンク データセットの価値を強調しており、これにより標的微生物の分離が大幅に強化されます。

細菌コロニーは、栄養素をめぐる競合や必須代謝産物の相互摂取などの種の相互作用を通じて、隣接する細菌の増殖に影響を与える可能性があります。 以前の研究では、隣接する細胞が予測可能な方法でコロニーのサイズに重大な影響を与える可能性があることが示唆されています19。 CAMII はコロニーの速度論的増殖を継続的に追跡できるため、寒天プレート上で腸分離株間の共増殖の関連性を体系的に調べました。 糞便サンプル（H1t5;補足表4）を毎日播種して画像化し、その後6日目にすべてのコロニーを分離し、それらの分類学的同一性を16Sシーケンスで決定しました（図4a）。 各ASVについて、寒天プレート上のコロニーの累積面積は、元の糞便サンプル中のコロニーの存在量と相関しており（補足図9）、これは、インビトロ条件が一般に腸内と同程度の増殖を促進することを示しています。 興味深いことに、フェカリバクテリウム属に属するコロニーは初期の成長が遅く、近くに成長する他のコロニーが存在する場合にのみ出現し始めました（図4b;方法）。 この観察は、フェカリバクテリウムと他の種の間に共生または相利相互作用が働いている可能性があることを示唆しています。

a、6日間の増殖中のサンプルプレートの画像と、16Sシーケンスによるプレート上のコロニーの同一性。 b、各属の6日目と比較した、さまざまな時点で検出可能なコロニーの割合。 色は科レベルの分類を示します。 c、2つの代表的なASVのコロニーサイズと近くのコロニー数の相関。 相関関係の完全なリストを補足表 8 に示します。 P 値は、近くにコロニーが 1 つ以上、または近くに 4 つ以上のコロニーがあるコロニーの面積に対する片側マン・ホイットニー U 検定によって計算されます (n = 101 対 82)。 ASV-6 と 17 に対し、ASV-39 では 9）。 箱ひげ図要素の定義: 中心線: 中央値。 ボックス制限: 第 25 四分位数の上限と下限。 ひげ: 1.5× 四分位範囲。 d、属間のペアワイズ成長促進および抑制ネットワーク。 方向性の成長促進効果は赤い鋭い矢印で示され、方向性の成長阻害効果は青い鈍い矢印で示されます。 ノードは細菌の属を表し、ファミリーごとに色分けされています。 ノード サイズはこの解析で使用される分離株の数に比例し、エッジ幅は相互作用の重要度に比例します。

CAMII によって可能になった種の相互作用をより体系的に研究するために、私たちはコロニーの形態、分類学的同一性、およびコロニーの近隣データを一緒に分析しました。 私たちは、視覚的に捕捉された 102,071 個のコロニー (26,997 個が分離) から形態データと物理座標を集計し、コロニーの成長が隣接する細胞によって影響を受けるかどうかを評価しました。 驚くべきことに、我々は、種間の相互作用を反映している可能性のある多くの興味深い共成長パターンを観察しました（補足表8）。 例えば、Phocaeicola vulgatus ASV-6 のコロニーサイズは隣接する細胞の数と負の相関があり、腸内で P. vulgatus と他の細菌との間に競合または拮抗作用によって媒介される一般的な負の相互作用があるというシナリオと一致しています 30 (図 2)。 4c）。 一方、コロニー動態の初期増殖の遅さに関連する種の1つであるFaecalibacterium prausnitzii ASV-39（図4b）は、ポジティブな種の相互作用を反映して、より多くの隣接コロニーを持つより大きなコロニーを成長させました（図4c）。

次に、近くのコロニーの分類学的情報を組み込み、特定の属のコロニーのサイズが他の属によってどのように影響を受けるかを調べました。 簡単に言うと、属の各ペアについて、ある属のコロニー サイズを、近隣に存在するコロニーが存在しない他の属と比較しました (方法)。 注目すべきことに、フェカリバクテリウム属とクロストリジウムIVという2つの属からの分離株が同定され、分離株がビフィズス菌、フォカエイコラ、バクテロイデスに近づくとより大きなサイズに成長することがわかりました（図4d）。 フェカリバクテリウムおよびクロストリジウム IV は、腸内で主要な酪酸生成細菌であると報告されており、ビフィズス菌およびバクテロイデス種との共培養増殖から恩恵を受ける可能性があります 31,32,33 が、これは我々の発見と一致しています。 一方、Phocaeicola 分離株は隣接する Faecalibacterium 分離株と比べて小さいことが観察され（図 4d）、共増殖相互作用は片側のみに有益である可能性があることを示しています。 さらに、隣接菌の同一性を考慮せずに隣接する分離菌数を調べた以前の相関分析と一致して、フォカエイコラ属とバクテロイデス属の増殖が他の複数の属によって阻害される可能性があることが観察され、これらの陽性の根底にあるメカニズムをよりよく理解するためのさらなる研究が示唆されています。腸内微生物叢間の負の相互作用。 まとめると、我々の結果は、CAMIIが種間相互作用によって支配されるコロニーの共増殖パターンを明らかにできることを強調しており、これは、気難しい種のin vitroでの増殖を刺激する増殖促進微生物とその拡散性代謝産物の同定に役立つ可能性がある。

ヒト内の腸内細菌の株レベルのゲノム規模の多様性をマッピングすることは、腸内定着の動態と、各ヒト宿主に特有の細菌の選択と適応の原動力を理解するために重要です1、2、34。 CAMII システムの主な利点は、多数の分離株を分離して WGS を実行し、個人間および個人内のゲノム変異の調査に役立つことです。 そのため、20人のマイクロバイオームバイオバンクから最もユニークで蔓延しているASVをカバーする分離株を選択し、WGSを実行して1,197の高品質のドラフトゲノムが得られました（補足図10および補足表9）。 ゲノムアセンブリをさらに分析して、分離株の正確な種レベルの分類を決定しました（方法）。

我々はまず、分離株コレクション全体にわたる個人間の系統レベルのゲノム変異を調査しました（方法）。 以前の報告1,35と一致して、同じ個人内のほとんどの分離株のゲノム変異はほとんどありませんでした（つまり、102未満のSNP）が、人々の間の分離株にはゲノム全体のSNPが103〜105個異なっていました（図5a）。 興味深いことに、同じ種のいくつかの系統発生的に異なる分離株（つまり、104を超えるSNP）が同じ人の体内に共存することが観察されました（図5a）。 たとえば、P. vulgatus の 2 つの異なる株が H4 個体から分離され、B. ユニフォームミスの 2 つの異なる株が H2 個体で見つかりました（補足図 11）。

a, 14 の分離株が豊富な種についての、同じまたは異なる個体からの分離株間のゲノムワイド SNP の数。 種名の後の数字は、個体間（赤）と個体内（青）のペアの数を表します。 箱ひげ図要素の定義: 中心線: 中央値。 ボックス制限: 第 25 四分位数の上限と下限。 ひげ: 1.5× 四分位範囲。 b、ゲノム全体のSNPの数と、個々のH1の分離株に富む種の元の糞便サンプル中の相対存在量との間の相関。 ドットのサイズはこの分析で使用された分離株の数を表し、色は 1 つの遺伝子型のみに存在する SNP の割合を表します。 c、H1 からの 409 の分離株に基づく 2 kb + HGT 周波数のネットワーク。 ノードは細菌の種を表し、ファミリーごとに色分けされています。 ノード サイズは H1 コレクション内の分離株の数に比例し、エッジの不透明度は 2 つの接続された種間の HGT 頻度に比例します。 エッジの色はさまざまなタイプの HGT、つまり門間、門内、科間、または科内の HGT を表し、ノードの輪郭の色は種のグラム染色を表します。

次に、H1個体に由来する408個の分離ゲノムを分析することにより、一人の人の株レベルの多様性を評価しようとしました（補足図10;方法）。 腸内に豊富に存在する種はより多くの細胞分裂を行うと予想されるため、腸内定着期間がほぼ同じであると仮定すると、それらの種はゲノム全体でより多くのSNPを蓄積する可能性があると仮説を立てました。 実際、各分類群内のゲノム規模の SNP の数は、一般に、元のマイクロバイオームにおけるその存在量と相関しています (図 5b)。 B. fragilis は葉の SNP の割合がより高い (56.0%) (つまり、1 つの遺伝子型のみに存在する) ことを示しますが、P. goldsteinii (20.5%)、B. stercoris (22.4%)、B. stercoris などの他の種ははるかに低い割合を示します。 . キシラニソルベンズ (25.6%)、これは個体群の差異によるボトルネックと種レベルでの選択的掃引を示唆しています。 遺伝子レベルでも、我々は収斂適応進化の証拠を観察した。 たとえば、異なる P. dorei 分離株系統間で、細菌のトルエン代謝を調節する 2 成分キナーゼセンサーをコードする遺伝子 TodS の 2 つのコード変異体を同定しました (補足図 12)。 トルエンやその他の芳香族炭化水素は食品中に含まれており、食品を汚染して腸内の進化を促進する可能性のある工業原料としても使用されています37。

人の腸内マイクロバイオーム進化のもう 1 つの主要な推進力は HGT です。 したがって、我々は、全ゲノム配列決定されたすべてのH1分離株を使用して、長さが2 kbを超える共有DNA要素のHGTネットワークを再構築しました（方法）。 最近の報告 38,39 と一致して、我々は、HGT イベントが分離株の系統発生と強く関連していることを観察しました。つまり、ほとんどの HGT イベントは同じ門内で発生しましたが、異なる科間および異なる種間でも非常に蔓延していました (図 5c および補足表10)。 興味深いことに、同じグラム染色の分離株間で HGT が主に濃縮されており、グラム陰性種の方がグラム陽性種よりも HGT がより多く存在することが観察されました (ピアソンのカイ二乗検定による P = 0.0005)。 この結果は最近の発見 39 と一致しており、異なる細胞壁構造が HGT において重要な役割を果たしている可能性があることを示唆しています。 注目すべきことに、グラム陽性種とグラム陰性種の間の HGT も私たちのデータセットで観察されており、HGT に対する細胞壁構造の影響を研究し、これらの HGT 要素をマイクロバイオーム編集ツールに組み込むという今後の研究のきっかけとなっています。 次に、これらの HGT が最近発生したかどうかを調べるために、すべての種のペア間の平均 HGT 頻度を計算しました (方法)。 我々は、HGT が 2 種間で最近発生した場合、HGT はごく一部の分離株とのみ関連し、その結果、種間の頻度が低くなる一方、HGT がより早期に発生し、成長利益をもたらした場合、HGT は濃縮され、後の世代に垂直に継承されるだろうと仮説を立てました。発生し、高周波が発生します。 興味深いことに、ほとんどの HGT エレメントが分離株全体に頻繁に存在することがわかりました (頻度が 50% を超える HGT が 71.5%)、特にバクテロイ科種内のものでは (図 5c)、これは、それらが遠い過去に発生し、内部の強力な選択の下で濃縮されたことを示唆しています。腸内環境。

個人内 HGT の有病率と頻度が高いことを考慮して、次に、最も広範囲に存在する HGT エレメントのタンパク質コード配列に注釈を付けて、その潜在的な機能を調べました (方法)。 興味深いことに、異なる作用機序を持つ複数の抗生物質耐性遺伝子（ARG）および分泌系遺伝子を同定しました（補足図13）。 例えば、最も広く普及している上位 4 つの HGT 配列は、驚くべきことに、バクテロイダ科、ポルフィロモナダ科、オドリバクテリウム科、リケネラ科の少なくとも 13 種で見つかり、リボソームプロテクターや抗生物質排出ポンプ、III 型および IV 型分泌システムを含む複数の ARG を含んでいます。 。 HGT を介して共有される ARG と分泌系は、明らかな進化上の利点をもたらす可能性があります 40,41 が、未知の機能の遺伝子を持つさまざまな種にわたって多数の広範な要素があり（補足図 13）、腸内での長期残留を駆動する未解明のメカニズムを示唆しています。 。 総合すると、これらの結果は、ヒト内およびヒト間の分離株がゲノム多様性を有しており、CAMII対応の深部株バイオバンキングとゲノム解析を使用して体系的に特徴づけることができ、ヒト特有の腸内マイクロバイオームの定着、適応、生態を研究できることを強調しています。

腸内マイクロバイオームからの菌株分離はこれまで、重要な表現型の特徴が不十分に捕捉され、ゲノムデータとともに十分に文書化されていない場当たり的な方法で行われてきました。 ここでは、自動化、マシンビジョン、教師あり学習、ゲノミクスを活用して分離バイオバンクの生成を工業化するための CAMII プラットフォームについて説明しました。 低コストの 16S および全ゲノム シーケンスと組み合わせると、パイプラインから体系的に生成された表現型およびゲノム データは、微生物コロニーの形態、多様性、進化を研究するための豊富なリソースを形成します。 ショーケースの例として腸内微生物叢を使用すると、CAMII を利用した分離により、20 人の健康な個人から大規模な分離株バイオバンクが得られ、その存在量で合計ですべての微生物叢の >80% をカバーしました。 この分離株コレクションは、健康な腸内の微生物の多様性の大部分をカバーしており、これまでに報告されている中で最も広範な個別化分離株バイオバンクの 1 つです。 このリソースを使用して、コロニー形態の定量分析により分類を予測し、標的属の単離を強化し、微生物間の潜在的な相互作用を明らかにできることを実証しました。 人々内および人々間の分離株間のゲノムの違いを体系的に分析したところ、集団選択、適応、HGT の興味深いパターンが明らかになりました。

ここで示したデータの大部分は、ヒトの腸内マイクロバイオームに関連した菌株の単離と特性評価のために一般的な mGAM に富んだ培地に依存していました。 代替培地配合物、他の微量栄養素と多量栄養素、宿主または環境に関連する生化学的摂動（胆汁酸や生体異物化合物など）の探索により、形態学的変化や増殖プロフィールの変化が得られ、腸内マイクロバイオームの未解明の生理機能や特徴を知ることができる可能性があります。 CAMII データセットから得られた種間の相互作用をさらに使用して、マイクロバイオームの動態の要因を体系的にマッピングすることができます。 私たちは、これらの相互作用が、この研究や他の研究で観察された協力的な増殖を促進する未知の微生物由来の分子の同定に役立ち、難解な「暗黒物質」マイクロバイオームの培養を促進できる可能性があると想定しています。

CAMII システムは、市販の既製コンポーネントと、他の研究者が容易に複製できるオープンソース コードを使用します (コンポーネントのリストについては補足表 1 を参照)。 私たちは、検索可能なオンライン ポータルによって、時間の経過とともに増加する標準化された表現型およびゲノム データの共有が容易になると考えています。 CAMII ハードウェアをさらに拡張して質量分析測定を統合し、追加のコロニー特性プロファイルを取得し、種と代謝物の同定を向上させることができます。 搭載された自動顕微鏡検査では、さらに直交データ ストリームを導入して、さまざまなスペクトル チャネルにわたって微生物細胞をマイクロメートルの解像度で視覚化できます。 マシン ビジョンと ML アルゴリズムの改善により、さらに優れたひずみ予測が得られ、分離性能が向上する可能性があります。

個々の株は複雑な群集内での活動の単位であるため、より完全な株のコレクションが必要です。 このような包括的なバイオバンクを使用すると、群集全体の構成、種間相互作用、代謝能力を考慮したより全体的な状況を再構築することができ、マイクロバイオームの機能、動態、安定性の研究が向上します。 CAMII は人間の腸を超えて、ファージ、真菌、原生動物のさらなる分離と分析を含め、土壌、水生、農業環境などの他のマイクロバイオームにも役立ちます。 ロボット自動化システムは、アレイ化されたトランスポゾン挿入ノックアウトコレクション 42 や機能的ゲノミクス発現ライブラリー 43 などの体系的な株ライブラリーの生成に役立つだけでなく、遺伝子工学用の扱いやすい微生物シャーシのスクリーニングを改善することもできます 44。

この研究は、コロンビア大学医療センター治験審査委員会プロトコル AAAR0753 に基づいて承認され、実施されました。 研究の参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。

20 人の健康な人間のドナーから新鮮な糞便サンプルを収集し、排便後 3 時間以内に処理しました。 簡単に説明すると、便器標本収集システム (Fisher、02-544-208) を使用して糞便を収集しました。 逆さの滅菌 200 μl ピペット チップ (Rainin、RT-L200F) を使用して便標本から少量のサンプルを取り出し、すぐに滅菌クライオバイアル (Fisher、NC9347001) に入れました。 次いで、収集した糞便サンプルを嫌気チャンバー(Coy Laboratory)に移し、5mlの予め還元したPBS中で十分にボルテックスすることによって均質化した。 均質化したサンプルをさらに 40 μ フィルター (Fisher、22363547) に通して食事の残骸を除去し、グリセロール (最終濃度 20%) を含む複数の凍結バイアルに等分し、長期保存のために -80 °C の冷凍庫に移しました。

すべての腸内微生物叢は、嫌気チャンバー内の嫌気条件 (5% H2、10% CO2、および 85% N2) の下で、改良型岐阜嫌気培地培地 (mGAM; HyServe、05433) で増殖しました。 簡単に説明すると、mGAM 培地を含む 1.5% 寒天プレート (Thermo Fisher Scientific、242811) を蠕動ポンプ (New Era Pump Systems NE-9000) を使用して作成し、固有のバーコードでラベルを付けました。 シプロフロキサシン (10 μg ml-1)、トリメトプリム (50 μg ml-1)、またはバンコマイシン (50 μg ml-1) を添加したプレートの場合、プレート調製中に抗生物質を添加しました。 次に、すべてのプレートを嫌気チャンバーに移し、播種前に約 24 時間予備還元しました。 凍結した糞便サンプルを嫌気チャンバー内で解凍し、各培養条件で 103 CFU/ml に希釈しました。 最適な希釈は、サンプル固有の連続希釈実験によって決定されました。 次に、200 マイクロリットルの希釈糞便サンプルをプレート上に分注し、滅菌ガラスビーズを使用して広げました。 プレートをジップロックバッグに密封して乾燥を軽減し、37℃で5日間コロニーを増殖させながらインキュベートしました。

株のイメージングと分離は、カスタムの自動イメージングおよびコロニーピッキング システム (CAMII) を使用して実行されました。 5 日間の増殖後、寒天プレートを CAMII システムで自動的に画像化しました (図 1c)。 簡単に説明すると、まずプレートをカルーセルスタッカー上に置きました。 ロボットアームグリッパーは個々のプレートをバーコードスキャナーを通過させ、コロニーピッカー上の照明されたイメージングプラットフォームに運び、そこでHudson RapidPick制御ソフトウェアによる2つの照明条件（落射照明と透過照明）下でイメージングされました。 プレートラベルはキャプチャされた画像にリンクされており、画像化されたプレートはロボットアームによって自動的に再積み重ねられます。 イメージングプロセスの完了後、乾燥を避けるためにプレートをジップロックバッグに密封し、カスタムスクリプトを使用してさまざまなコロニーをセグメント化し、その後のプレート画像に基づいたピッキングのために形態学的にユニークなコロニーを特定しました（補足図1a）。 形態学的特徴には、面積、周長、平均半径、真円度、凸面性、慣性、グレー チャネル (透過照明画像) および RGB チャネル (落射照明画像) に沿った平均と分散が含まれます。 プレート上のすべてのコロニーの生画像も収集されます。

この研究で実行されたランダムピッキングでは、スクリプトによって検出されたすべてのコロニーから指定された数のコロニーのランダムなサブセットが生成され、これらのコロニーに対して自動分離が実行されました。 表現型に基づくピッキングでは、検出されたすべてのコロニーが最初にその形態に基づいて最適化された選択を受け、形態学的多様性が最大化された所定数のコロニーのサブセットが CAMII によって単離されました。 最適化されたコロニー選択の詳細なアルゴリズムは補足図1bにあり、プレート画像とコロニー形態の分析に使用されるスクリプトはhttps://github.com/hym0405/CAMIIでアクセスできます。

プレート画像を分析し、選択するコロニーのリストを生成した後、同様のロボットプロトコルを実行してこれらのコロニーを分離しました。 まず、ピッキングのためにプレートを再度積み重ね、マルチチャンネル培地ディスペンサーを使用して、2 枚のバーコード付き滅菌 384 ウェル光学プレート (Thermo Fisher Scientific、12-566-2; 複製「A」および'B')、その後コロニーピッカーに移動されました。 次に、寒天プレートをコロニーピッカーに移し、加熱滅菌針で個々のコロニーを採取し、複製した光学プレートに入れました。 すべての標的コロニーが選択されるか（寒天プレート）、またはすべてのウェルが接種されると（光学プレート）、プレートは自動的に切り替えられました。 コロニーを採取した後、接種した光学プレートをプレートシーラー (Brandel、9795) に移し、密封して再度積み重ねました。 次に、細菌培養のために光学プレートを 37 °C で約 5 日間インキュベートしました。 細菌の増殖後、「A」プレートを下流 gDNA 抽出に供し、30 μl の 40% グリセロールを「B」 プレートの各ウェルに添加し、長期保存のために -80 °C に移しました。

形態ガイドコロニー選択を実現するために、生の画像処理で抽出されたコロニーの形態的特徴が集中化され、単位分散に合わせてスケーリングされ、PCA によって埋め込まれました。 最適化されたコロニー選択アルゴリズムが埋め込まれた特徴にさらに適用され、最も形態学的多様性が高いコロニーのセットが検索されました（補足図1b）。

異なるASVが近くのコロニーにどのように反応するかを評価するために（図4c）、プレート上の分離株について近くのコロニーの数を計算し、「近くのコロニー」ペアをX-Y座標間の距離が30ピクセルプラス未満である2つのコロニーとして定義しましたそれらの半径の合計。 コロニー形態に対する抗生物質の潜在的な影響を回避するために、mGAM のみのプレートで増殖させたコロニーのみを形態分析に使用しました。

特定の属の成長が他の属によってどのような影響を受けるかを評価するために（図4d）、最初に上記のように「近くのコロニー」ペアを特定し、属Bに対する属Aの成長の影響を比較することによって定量化しました。近隣に属 A が存在する、つまり近くのコロニーとして存在する属 B のコロニー サイズと、近くにコロニーがない場合の属 B のコロニー サイズに対する影響サイズは、平均コロニー サイズの変化倍数として定義されました。近隣にコロニーが存在しない場合の属 A のコロニー サイズの平均値。P 値は、近隣に属 A が存在する場合と近隣にコロニーが存在しない場合のサイズ分布、および誤検出率 (FDR) に関するマン-ホイットニー U 検定によって計算されました。 ) 補正は、Bonferroni-Holm 法を使用して実行されました。 コロニー形態に対する抗生物質の潜在的な影響を回避するために、mGAM のみのプレートで増殖させたコロニーのみを形態分析に使用しました。

プレート上のコロニー形態が分類学的同一性の予測に役立つかどうかをテストするために、データが豊富な属のコロニー (20 個体全体で 100 以上の分離株) をモデルのトレーニングとテストに供しました。 抗生物質の混乱と近隣コロニーの潜在的な影響を考慮して、14 のコロニー形態学的特徴、抗生物質の状態と近隣コロニーの数、およびパフォーマンス (精度と再現率) を使用してランダムにサンプリングされた分離株の 70% でマルチラベル ランダム フォレスト モデルをトレーニングしました。モデルの残りの 30% の分離株について評価されました。 モデルのトレーニングと評価の手順は、バイアスを最小限に抑えるために異なるランダム化設定で 20 回ブートストラップされ、モデルのバックグラウンド パフォーマンスはヌル モデル (分離株の数に基づく予測) によって計算されました。 標的微生物分離を実行するために、上記のように個別に個体 H12、H13、および H14 からのデータ豊富な属のコロニー (同じ個体から 15 を超える分離株) でマルチラベル ランダム フォレスト モデルをトレーニングしました。 次に、同じ糞便サンプルをプレートに播き、細菌の増殖後にモデルを新しいプレートに適用して、プレート上のすべてのコロニーをスクリーニングし、標的となる属レベルの分類のコロニーを予測しました。 次に、プレートのすべてのコロニーを CAMII で単離し、16S V4 シークエンシングを行って分類を特定し、標的単離のパフォーマンスを評価しました。

増殖動態を毎日監視するために、糞便サンプル H1t5 を mGAM のみのプレートに播き、6 日間の増殖の間毎日プレートを画像化しました。 画像上でコロニーの検出とセグメンテーションが実行され、異なる日のコロニー形態の特徴がX-Y座標に基づいて照合されました（図4a）。 次いで、プレート上のすべてのコロニーを６日目にＣＡＭＩＩ上で単離し、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定による分類学的同定に供した。 属の初期増殖の差異を定量化するために、各日の各属の検出可能なコロニーの数（x-y座標で追跡）を6日目のコロニーの総数に対して正規化し、検出可能なコロニーの割合を計算しました（図4b）。毎日。

選択された分離株の gDNA は、以前の研究 45 から適応されたシリカビーズビートベースのプロトコールを使用して 384 ウェル形式で抽出されました。 まず、40 µl の 0.1 mm ジルコニア シリカ ビーズ (Biospec、11079101Z) と 120 µl の溶解溶液 (50 mM Tris-HCl、pH 7.5 および 0.2 mM EDTA) を 384 ウェルディープウェル プレート (Thermo Fisher Scientific) の各ウェルに添加しました。 、07-202-505）。 次に、分離菌の培養液 40 μl を各ウェルに加え、プレートを 4,500 g で 1 分間遠心分離し、シーリングマット (Axygen、AM-384-DW-SQ) で固定しました。 ビーズ拍動中の過熱を避けるために、プレートを 5 秒間ボルテックスし、拍動前に -20 °C で 10 分間インキュベートしました。 次に、プレートをビーズビーター (Biospec、1001) に固定し、5 分間ビーズビーティングを行った後、10 分間冷却しました。 ビーズ拍動サイクルを 1 回繰り返し、プレートを 4,500 g で 5 分間遠心分離して細胞破片をスピンダウンしました。 次に、10 μl の細胞溶解物を 384 ウェル PCR プレート (Bio-Rad、HSP3801) と 2 μl プロテイナーゼ K 溶液 (50 mM Tris-HCl、pH 7.5、および 1 μg μl-1 プロテイナーゼ K (Lucigen、MPRK092)) に移しました。 ) を Formulatrix Mantis を使用して追加しました。 最後に、細胞溶解物をサーマルサイクラーでプロテイナーゼ K 消化し (65 °C 30 分、95 °C 30 分、4 °C 無限)、長期保存のために -20 °C に移しました。 バルク糞便サンプルの gDNA 抽出は、96 ウェル形式で反応容量をスケールアップして同じプロトコールを使用して実行されました。

分離株分類学的同定のための V4 領域の 16S シーケンスは、デュアルインデックスシーケンスプライマーのセットを使用して 384 ウェルフォーマットで実行されました。 簡単に言うと、バーコード化された 16S V4 アンプリコン プライマーは、ユニバーサル 16S V4 プライマーに基づいて設計され、Integrated DNA Technologies によって合成されました。 次に、バーコード付きフォワードプライマー 16SV4f_5xx とリバースプライマー 16SV4r_7xx の各ユニークな組み合わせ 1 μl を、Labcyte Echo を使用して 384 ウェル PCR プレートに移し、ユニークなデュアルインデックスプライマープレートを作成しました。 次に、384 ウェル ピン レプリケーター (Scinomix、SCI-6010.OS) によって約 130 nl の gDNA をプライマー プレートに移し、Formulatrix Mantis を使用して 2 μl の NEBNext Q5 PCR マスター ミックス (NEB、M0543L) を各ウェルに添加しました。 。 次に、サンプルをサーマルサイクラーで 16S V4 増幅に供しました (98 °C 30 秒、40 サイクル: 98 °C 10 秒、55 °C 20 秒、65 °C 60 秒、65 °C 5 分、4 °C)無限）。 得られたアンプリコン ライブラリーを手動でプールし、E-Gel EX アガロース ゲル、2% (Thermo Fisher Scientific、G402002) でのゲル電気泳動に供しました。 予想される DNA バンド (約 390 bp) をゲルから切り出し、Wizard SV Gel および PCR Cleanup System (Promega、A9282) を使用してメーカーの指示に従って抽出し、PCR プライマーおよびアダプターダイマーを除去しました。 ゲル精製したライブラリーを Qubit dsDNA HS アッセイ (Thermo Fisher Scientific、Q32851) で定量し、Illumina MiSeq プラットフォーム (試薬キット: v2 300 サイクル、ペアエンド モード) で 8 pM ローディング濃度、20% PhiX スパイクインで配列決定しました。 (Illumina、FC-110-3001) をカスタム配列決定プライマーとともに、メーカーの指示に従って Miseq 試薬カートリッジ (100 μM ストックの 6 μl、ウェル 12: 16SV4_read1、ウェル 13: 16SV4_index1、ウェル 14: 16SV4_read2) にスパイクしました。 ライブラリーの調製と配列決定に使用したすべてのプライマーの配列を補足表 11 に示します。バルクサンプルの 16S V4 配列決定は、96 ウェル形式でスケールアップ反応容量を使用して同様のプロトコルを使用して実行されました。 さらに、SYBR Green I (最終濃度: 0.2x、Thermo Fisher Scientific、S7563) を PCR 反応に添加し、定量的な 16S V4 増幅を実行し、対数期 (通常 13 ～ 17 サイクル) で停止し、反応を進めました。最後の伸長ステップに進みます。

16S V4 アンプリコンの生のシーケンスリードは、USEARCH v11.0.667 によって分析されました (参考文献 46)。 具体的には、ペアエンド読み取りは、デフォルト設定の「-fastq_mergepairs」モードを使用してマージされました。 次に、マージされたリードに対して、オプション「-fastq_maxee 1.0 -fastq_minlen 240」を指定した「-fastq_filter」モードを使用して品質フィルタリングを行い、予想されるエラーベースが 1 つ未満で 240 bp を超えるリードのみを保持しました。 残りのリードは重複排除 (-fastx_uniques) され、100% の同一性で ASV (-unoise3) にクラスター化され、マージされたリードが ASV シーケンス (-otutab) に対して検索されて、ASV カウント テーブルが生成されました。 ASV の分類は、16S rRNA トレーニング セット 18 でトレーニングされたリボソーム データベース プロジェクト分類子 v2.13 を使用して割り当てられました (参考文献 47)。 バルクサンプル中の ASV の相対存在量は、マップされたリードの総数で正規化された ASV のリード数として定義されます。

ASV クラスタリング後、ASV カウント テーブルを解析して、各分離株の次の指標を計算しました: 総リード数、リード数が最も高い ASV、およびその ASV の純度。 リード数が不十分または純度が低い分離株（リード数 < 5 または純度 < 0.5）をフィルタリングし、残りの分離株の分類をリード数が最も高い ASV として定義しました。 分離株の系統発生を構築するために、MUSCLE v5 (参考文献 48) を使用して分離株の ASV 配列に対して多重配列アラインメントを実行し、続いてアラインメントされた ASV 配列を MEGA v11.0.11 (参考文献 49) で分析して、系統再構成のデフォルト設定。

16S V4 アンプリコン配列決定に使用したのと同じ gDNA を、分離株の全ゲノム配列決定に供しました。 ペアエンドライブラリーは、公開されている低容量 Nextera ライブラリー調製プロトコールに従って構築され 50、Illumina Nextseq 500/550 プラットフォーム (2 × 75 bp) および HiSeq プラットフォーム (2 × 150 bp) で配列決定されました。 次に、生の読み取りは次のパラメータを使用して Cutadapt v2.1 によって処理されました: '--minimum-length 25:25 -u 10 -u -5 -U 10 -U -5 -q 15 --max-n 0 --pair -filter=any' は、低品質のベースと Nextera アダプターを削除します。 カバレッジは分離株あたり 142 ± 286 万のペアエンド リードであり、de novo ゲノム アセンブルのパフォーマンスを向上させるために、SNPsaurus による一部の分離株に対して PacBio ロングリード シーケンスが実行されました。

品質フィルタリングに合格した Illumina リードと PacBio ロングリードは、分離株のドラフトゲノムを生成するデフォルト設定で Unicycler v0.4.4 (参考文献 51) によって組み立てられ、ドラフトゲノムの品質および種レベルの分類が QUAST v4.6.3 によって評価されました。 (参照 52)、CheckM v1.0.13 (参照 53)、および GTDB-Tk v0.2.2 (参照 54)。 3,271 個の分離株アセンブリすべてのうち、1,197 個が高品質ドラフト ゲノム (カバレッジ > 20x、N50 > 5,000 bp、完全性 > 80%、コンタミネーション < 5%) と定義され、下流のゲノム変異および HGT 解析に使用されました。 個人内および個人間の腸内細菌叢分離株の株レベルのゲノム変異を特定するために、各種の最も高い完全性と N50 を備えたドラフトアセンブリがリードアライメントの参照ゲノムとして選択され、処理された分離株の Illumina リードが各種の参照ゲノムとアライメントされました。 「--very-sensitive」設定のペアエンド モードでの Bowtie2 v2.3.4 (ref. 55) による同じ種。 結果として得られたリードアライメントは、ゲノム変異 (SNP および Indel) を呼び出すために「--ploidy 1」設定を使用して SAMtools v1.9 および BCFtools v1.9 (参考文献 56) によって処理されました。 次に、結果として得られた変異を品質フィルタリングにかけて「信頼できる」遺伝子型（5 つ以上のリードでカバーされ、半数性が 0.9 以上）を特定し、すべての分離株にわたって 90% 以上の「信頼できる」遺伝子型を持つ SNP 変異のみを下流解析に使用しました。 SNP ベースの系統発生を構築するために、SNP 部位の分離株の塩基プロファイルが連結され、デフォルト設定の MEGA v11.0.11 によって UPGMA ツリーが計算されました。

これまで培養されていなかったバイオバンクで分離された種を同定するために、この研究で得られたドラフトゲノムと MAG または公的に利用可能なデータベースからの分離ゲノムとの間の平均ヌクレオチド同一性が FastANI v1.0 (参考文献 57) によって計算されました。 >95% の ANI は同じ種であると考えられました。

H1分離株内の種間で発生するHGTを同定するために、高い配列同一性を持つゲノム領域のブロックを体系的にスクリーニングするために、「-evalue 0.1 -perc_identity 99」設定を備えたBLASTN v2.7.1（参考文献58）によって異なる種のすべてのゲノムペアを比較しました。 次に、候補 HGT の P 値を分離株間のゲノム全体の ANI に基づいて計算し、Benjamini-Hochberg 法によってさらに調整しました。 調整された P 値が 1 × 10−5 未満で長さが 2,000 bp を超える芽球ヒットは、異なる種の分離株間の HGT イベントとみなされました。 種間の HGT の頻度は、以前に発表された方法 39,59 を使用して定量化され、少なくとも 1 つの HGT を共有する種間ゲノムペアの数を種間ゲノムペアの総数で割ったものとして定義されました。 HGT エレメントの ARG と分泌システムに注釈を付けるために、HGT エレメントの配列はメタゲノム モードの Prokka v1.12 (参考文献 60) によって注釈が付けられ、得られた CDS は BLASTP v2.7.1 によって CARD データベース v3.1.4 (参考文献 61) に対して検索されました。 e 値 <1 × 10−5、アイデンティティ >20、クエリ カバレッジ >50 の ARG ヒットを識別します。 分泌システムは、EffectiveDB62 によってデフォルト設定で HGT 要素の CDS 上でも予測されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された配列決定データは、アクセッション番号 PRJNA745993 で NCBI BioProject データベース (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/) に提出されました (参考文献 63)。 形態学的特徴や生の画像など、分離株コレクションのその他の関連データは、http://microbiological-culturomics.com でアクセスできます。 ASV の分類は、リボソーム データベース プロジェクトによって提供された 16S rRNA トレーニング セット 18 に基づいて割り当てられました。 HGT エレメントの ARG 遺伝子と分泌システムの注釈は、それぞれ CARD データベース v3.1.4 と EffectsDB データベースに基づいていました。

この研究でプレート画像を分析するために使用されたスクリプトは、https://github.com/hym0405/CAMII ref からアクセスできます。 64.

ポイェット、M.ら。 長期にわたるマルチオミクス データと組み合わせたヒト腸内細菌分離株のライブラリーにより、機械的なマイクロバイオーム研究が可能になります。 ナット。 医学。 25、1442–1452 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

趙、SJら。 健康な人の腸内微生物叢内の適応進化。 細胞宿主微生物 25, 656 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ゾウ、YQら。 培養されたヒト腸内細菌からの 1,520 の参照ゲノムにより、機能的なマイクロバイオーム分析が可能になります。 ナット。 バイオテクノロジー。 37、179 (2019)

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ブラウン、HP et al. 「培養不可能な」ヒト微生物叢を培養すると、新しい分類群と広範な胞子形成が明らかになります。 ネイチャー 533, 543 (2016)

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

グッドマン、AL 他。 ノトバイオティックマウスで特徴付けおよび操作された、広範な個人のヒト腸内微生物叢培養コレクション。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 108、6252–6257 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヴィラ、MM 他腸内細菌による食事性炭水化物代謝の個人差が液滴マイクロ流体培養で明らか​​になりました。 mSystems 5、e00864-19 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ワッターソン、WJら。 抗生物質耐性腸内細菌を正確にスクリーニングするための液滴ベースのハイスループット培養。 eLife 9、e56998 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ji、BW、Sheth、RU、Dixit、PD、Tchourine、K.、Vitkup、D. 腸内細菌叢のマクロ生態学的動態。 ナット。 微生物。 5, 768 (2020)

論文 CAS PubMed Google Scholar

Qamer, S.、Sandoe, JAT & Kerr, KG コロニー形態を利用して、臨床検体から混合培養されたさまざまな腸球菌株および種を区別します。 Ｊ．クリン． 微生物。 41、2644–2646 (2003)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Allegrucci, M. & Sauer, K. 肺炎球菌バイオフィルムから単離されたコロニー形態変異体の特徴付け。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 189、2030–2038 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cabeen, MT、Leiman, SA & Losick, R. コロニー形態スクリーニングにより、バイオフィルム形成における緑膿菌の窒素関連ホスホトランスフェラーゼ系の役割が明らかになりました。 モル。 微生物。 99、557–570 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マーティン・ロドリゲス、AJ 他シュワネラ藻類におけるコロニー形態とバイオフィルム形成の制御。 微生物。 バイオテクノロジー。 14、1183–1200 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rettedal, EA、Gumpert, H. & Sommer, MOA ヒト腸内細菌叢の培養ベースの多重表現型解析により、これまで培養されていなかった細菌の標的を絞った回収が可能になります。 ナット。 共通。 5、4714 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Strittmatter、N. et al. 高速蒸発イオン化質量分析法を使用した無傷の細菌の分析。 化学。 共通。 49、6188–6190 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Fang, JS & Dorrestein, PC 微生物コロニーを直接分析するための新たな質量分析技術。 カー。 意見。 微生物。 19、120–129 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

磯崎亜生ほかインテリジェントな画像活性化セルソーティングの実用的なガイド。 ナット。 プロトック。 14、2370–2415 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hosny, A.、Parmar, C.、Quackenbush, J.、Schwartz, LH & Aerts, HJWL 放射線医学における人工知能。 ナット。 Rev. Cancer 18、500–510 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cole, JA、Kohler, L.、Hedhli, J. & Luthey-Schulten, Z. 高密度の細菌コロニー内の空間分解された代謝協力性。 BMCシステム。 バイオル。 9、15 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Chacon, JM、Mobius, W. & Harcombe, WR コロニーサイズの変動の空間的および代謝的基礎。 ISME J. 12、669–680 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ratzke, C. & Gore, J. 環境の pH を変更したりそれに反応すると、細菌の相互作用が引き起こされる可能性があります。 PLoSバイオル。 16、e2004248 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Edgar, RC 16S リボソーム RNA OTU の 97% 同一性閾値を更新。 バイオインフォマティクス 34、2371–2375 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロイド・プライス、J. 他拡張されたヒト マイクロバイオーム プロジェクトにおける菌株、機能、ダイナミクス。 ネイチャー 550, 61 (2017)

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lozupone, CA、Stombaugh, JI、Gordon, JI、Jansson, JK & Knight, R. ヒトの腸内細菌叢の多様性、安定性、回復力。 Nature 489、220–230 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アルメイダ、A. et al. ヒトの腸内微生物叢の新しいゲノム青写真。 ネイチャー 568, 499 (2019)

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pasolli, E. et al. 年齢、地理、ライフスタイルにわたるメタゲノムからの 150,000 以上のゲノムによって、未調査の広範なヒト マイクロバイオームの多様性が明らかになりました。 セル 176、649 (2019)

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Franzosa、EA et al. 炎症性腸疾患における腸内微生物叢の構造と代謝活動。 ナット。 微生物。 4、293–305 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Huang, L. & Wu, T. 細菌コロニー分類のための新しいニューラル ネットワーク アプリケーション。 理論。 バイオル。 医学。 モデル。 15、22 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Qu、KY、Guo、F.、Liu、XR、Lin、Y.、Zou、Q. 微生物学における機械学習の応用。 フロント。 微生物。 10、827 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ワン・HD 他タイムラプスコヒーレントイメージングとディープラーニングを使用した生きた細菌の早期検出と分類。 光科学。 応用 9、118（2020）。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ベンチュレリ、OS 他。 合成ヒト腸内マイクロバイオームコミュニティにおける微生物相互作用の解読。 モル。 システム。 バイオル。 14、e8157 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim、H.、Jeong、Y.、Kang、SN、You、HJ、Ji、GE ビフィズス菌カテヌラタムとの共培養は、フェカリバクテリウム プラウスニツィイの増殖、腸内定着、酪酸生産を改善します: in vitro および in vivo 研究。 微生物 8, 788 (2020).

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リンドスタッド、LJ et al. ヒトの腸内細菌フェカリバクテリウム・プラウスニツィイは、ベータマンナン由来のオリゴ糖を交差摂食するための非常に効率的な保存システムを展開しています。 mBio 12、e0362820 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Louis, P.、Young, P.、Holtrop, G. & Flint, HJ ブチリル-CoA: アセテート CoA-トランスフェラーゼ遺伝子の分析によって明らかになったヒト結腸酪酸生産細菌の多様性。 環境。 微生物。 12、304–314 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ティアニー、BT et al. 腸内および口腔内のヒトマイクロバイオームの遺伝的内容の状況。 細胞宿主微生物 26, 283 (2019)

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チェン、L.ら。 ヒト腸内マイクロバイオームの長期的な遺伝的安定性と個人の特異性。 セル 184、2302 ～ 2315 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ラウ、PCKら。 トルエン分解を制御する細菌の塩基性領域ロイシンジッパーヒスチジンキナーゼ。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 94、1453–1458 (1997)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Defois, C. et al. インビトロシステムによって明らかなように、食品化学物質はヒトの腸内微生物叢の活動を妨害し、腸の恒常性に影響を与えます。 科学。 議員番号 8、11006 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Jeong, H.、Arif, B.、Caetano-Anolles, G.、Kim, KM & Nasir, A. 系統発生的再構築と調整によって推定されるヒト関連微生物における水平遺伝子伝達。 科学。 議員第9号、5953号（2019年）。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Groussin、M. et al. 工業化されたヒトマイクロバイオームにおける遺伝子の水平伝達速度の上昇。 セル 184、2053 (2021)

論文 CAS PubMed Google Scholar

Juhas, M.、Crook, DW & Hood, DW IV 型分泌システム: 細菌の水平遺伝子伝達と毒性のツール。 細胞微生物。 10、2377–2386 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウッズLCら。 遺伝子の水平伝播は、遺伝的変異の広がりに対する選択的制約を軽減することで適応を強化します。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 117、26868–26875 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goryshin, IY、Jendrisak, J.、Hoffman, LM、Meis, R. & Reznikoff, WS 放出された Tn5 転位複合体のエレクトロポレーションによる挿入トランスポゾン突然変異誘発。 ナット。 バイオテクノロジー。 18、97–100 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ムタリク、VKら。 細菌の機能的形質のハイスループット特性評価のためのデュアルバーコードショットガン発現ライブラリーシーケンス。 ナット。 共通。 10、308（2019）。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Ronda, C.、Chen, SP、Cabral, V.、Yaung, SJ & Wang, HH 哺乳動物の腸内微生物叢の in situ メタゲノム工学。 ナット。 方法 16、167–170 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ji、BW et al. 反復サンプリングを使用して、微生物叢の絶対存在量における時空間変動とノイズを定量化します。 ナット。 方法 16、731–736 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Edgar、RC 検索とクラスタリングは BLAST よりも桁違いに高速です。 バイオインフォマティクス 26、2460–2461 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang, Q.、Garrity, GM、Tiedje, JM & Cole, JR rRNA 配列を新しい細菌分類に迅速に割り当てるためのナイーブ ベイジアン分類器。 応用環境。 微生物。 73、5261–5267 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Edgar、RC MUSCLE: 高精度および高スループットの複数配列アライメント。 核酸研究所 32、1792–1797 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kumar, S.、Stecher, G.、Li, M.、Knyaz, C.、Taむら, K. MEGA X: コンピューティング プラットフォームにわたる分子進化遺伝学分析。 モル。 バイオル。 進化。 35、1547–1549 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バイム、M.ら。 メガベースサイズのゲノム向けの安価な多重ライブラリーの調製。 PLoS ONE 10、e0128036 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Wick, RR、Judd, LM、Gorrie, CL & Holt, KE Unicycler: 短いシーケンスリードと長いシーケンスリードから細菌のゲノムアセンブリを解決します。 PLoS コンピューティング。 バイオル。 13、e1005595 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Gurevich, A.、Saveliev, V.、Vyahhi, N.、Tesler, G. QUAST: ゲノムアセンブリの品質評価ツール。 バイオインフォマティクス 29、1072–1075 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parks, DH、Imelfort, M.、Skennerton, CT、Hugenholtz, P. & Tyson, GW CheckM: 分離株、単一細胞、およびメタゲノムから回収された微生物ゲノムの品質を評価します。 ゲノム研究所 25、1043–1055 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chaumeil, PA、Mussig, AJ、Hugenholtz, P. & Parks, DH GTDB-Tk: ゲノム分類データベースを使用してゲノムを分類するためのツールキット。 バイオインフォマティクス 36、1925–1927 (2019)。

PubMed PubMed Central Google Scholar

Langmead, B. & Salzberg, SL Bowtie 2 を使用した高速ギャップリード アラインメント。 方法 9、357–359 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、Ｈら。 配列アライメント/マップ形式と SAMtools。 バイオインフォマティクス 25、2078–2079 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Jain, C.、Rodriguez, RL、Phillippy, AM、Konstantinidis, KT & Aluru, S. 90,000 の原核生物ゲノムのハイスループット ANI 解析により、明確な種の境界が明らかになりました。 ナット。 共通。 9, 5114 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

カマチョ、C.ら。 BLAST+: アーキテクチャとアプリケーション。 BMCバイオインフ。 10、421 (2009)。

記事 Google Scholar

スマイリー、CS 他。 エコロジーは、ヒトのマイクロバイオームを繋ぐ遺伝子交換の世界的なネットワークを推進します。 Nature 480、241–244 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Seemann, T. Prokka: 原核生物ゲノムの迅速な注釈付け。 バイオインフォマティクス 30、2068–2069 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Alcock、BP et al. CARD 2020: 包括的な抗生物質耐性データベースを使用した抗生物質レジストーム監視。 核酸研究所 48、D517–D525 (2020)。

CAS PubMed Google Scholar

アイヒンガー、V.ら。 EffectsDB – 細菌分泌タンパク質およびタイプ III、IV、VI 分泌システムの注釈を向上させるための更新と新しい機能。 核酸研究所 44、D669–D674 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Huang、Y.ら。 自動化と機械学習を使用したハイスループットの微生物培養学。 分離コレクションの WGS。 シーケンス読み取りアーカイブ。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA745993 (2023)。

Huang、Y.ら。 自動化と機械学習を使用したハイスループットの微生物培養学。 GitHub。 https://github.com/hym0405/CAMII (2023)。

リファレンスをダウンロードする

原稿に関してアドバイスとコメントをくださった王研究室のメンバーに感謝します。 HHW は、NSF (MCB-2025515)、NIH (1R01AI132403、1R01DK118044 および 1R21AI146817)、ONR (N00014-18-1-2237 および N00014-17-1-2353)、バロウズウェルカム基金 (1016691) からの関連資金援助を認めています。イルマT. ヒルシュル トラストおよびシェーファー研究賞を受賞。 RUS は、ファニー＆ジョン・ハーツ財団フェローシップおよび NSF 大学院研究フェローシップ (DGE-1644869) によって支援されています。 TM は、NIH Medical Scientist Training Program (T32GM007367) によってサポートされています。 MRとFV-C。 は、NSF 大学院研究フェローシップ (DGE-1644869) によってサポートされています。 CR は、Simons Society of Fellows のジュニア フェロー奨学金によってサポートされています。

これらの著者は同様に貢献しました: Yiming Huang、Ravi U. Sheth。

コロンビア大学システム生物学部、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国

ファン・イーミン、ラヴィ・U・シェス、チャオ・シジエ、ルーカス・A・コーエン、ケンダル・ダバギ、トーマス・ムーディ、ディアドラ・リコート、マイルズ・リチャードソン、フローレンス・ベレス＝コルテス、トマシュ・ブラゼイェフスキー、アンドリュー・カウフマン、カルロッタ・ロンダ＆ハリス・H・ワン

コロンビア大学生物医療情報学部、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国

サン・イーウェイ

コロンビア大学病理学・細胞生物学部、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国

ハリス・H・ワン

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

YH、RUS、HHW は最初のコンセプトを開発しました。 YH、KD、TB は形態学に基づいたコロニー選択ソフトウェアを開発しました。 YH、RUS、LAC は HHW からの入力を基に実験を実施し、データを分析しました。 TM、DR、YS、MR、FV-C.、AK、CR がコロニー単離を支援しました。 YS と SZ は分離株 WGS を支援しました。 YH、RUS、SZ、HHW が原稿を書きました。 他のすべての著者は結果について議論し、原稿を承認しました。

ハリス・H・ワンへの通信。

HHWはSNIPR Biome、Kingdom Supercultures、Fitbiomics、Arranta Bio、VecX Biomedicines、Genus PLCの科学顧問であり、Aclidの科学共同創設者でもあるが、全員がこの研究には関与していない。 RUS と KD は、Kingdom Supercultures の共同創設者です。 他のすべての著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Biotechnology は、この研究の査読に貢献してくれた Peter Turnbaugh と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

補足図。 1～13。

補足表 1 ～ 11。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Huang, Y.、Sheth, RU、Zhao, S. 他自動化と機械学習を使用したハイスループットの微生物培養学。 ナットバイオテクノロジー (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41587-023-01674-2

引用をダウンロード

受信日: 2021 年 8 月 12 日

受理日: 2023 年 1 月 11 日

公開日: 2023 年 2 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-023-01674-2

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

ネイチャー微生物学 (2023)

ネイチャーバイオテクノロジー (2023)