複数の 3D 細胞モデルをハイドロゲル内に同一平面上に埋め込み、高精度な埋め込みを実現

Scientific Reports volume 12、記事番号: 9991 (2022) この記事を引用

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7 オルトメトリック

メトリクスの詳細

一部の 3D in vitro モデルの製造および実験処理のために、標準化されたハイスループットな方法が開発されています。しかし、科学者や研究者が前臨床薬物検査や精密医療において複雑な細胞モデルの可能性を最大限に活用するための、適応された分析ツールがまだ不足しています。組織学は、組織の構造および機能を分析するための、確立され、コスト効率が高く、ゴールドスタンダードな方法です。ただし、標準的な組織学的プロセスは、サイズが小さいためサンプルの位置合わせが不十分になり、分析スループットが低下することが多いため、3D 細胞モデルに適用するのは困難でコストがかかります。この一連の研究は、新しいアプローチを提案しています。HistoBrick は、切断面に平行な正確な共面配置による 3D 細胞モデルのゲル包埋を可能にすることで、スフェロイドとオルガノイドの組織学的処理を容易にし、サンプル材料の損失を最小限に抑えます。 HistoBrick の機能は自動化標準と互換性があり、マルチウェルプレートからゲルデバイスへの自動サンプル移動が可能になる可能性があります。さらに、HistoBrick の技術は、直径 150 ～ 200 μm の HepG2 培養スフェロイドの位置合わせを ± 80 μm の高さ精度で実証することによって検証されました。 HistoBrick を使用すると、最小限の切片にわたって最大 96 個のサンプルを研究できるため、ハイスループットの微小組織学への道が開かれます。

in vitro 三次元 (3D) 細胞モデルは、二次元 (2D) 培養と比較して、より優れた生理学的関連組織機能、構造、および界面を可能にするため、注目を集めています。患者由来の複雑な in vitro モデルは、独特の遺伝子構造を反映しています。さらに、オミクス解析や薬物スクリーニング解析は、動物実験に比べて非常に容易です1。これに関連して、スフェロイド、オルガノイド、または腫瘍様体（総称して微小組織と呼ばれます）などの複雑な in vitro モデルが、疾患モデリング、前臨床薬開発、および組織工学に広く使用されています 2。したがって、微小組織は個別化医療の実現をサポートします3。複雑な 3D 細胞モデル 4 は主に細胞生物学の側面 5 を解明するために使用され、その後、生産、選別、配置、成熟、分析のためのツールと標準化された方法論の開発が行われました。そのため、複雑な細胞システムのハイスループット分析と品質管理は依然として継続的な課題です。組織学は、組織の微細解剖学的構造を分析するための代表的な方法です。したがって、3D 細胞モデルの組織学的分析は当然の帰結です。免疫組織化学と組み合わせることで、特定のタンパク質または抗原の視覚化による組織の形態および組成に関する情報が得られます。微小組織学は、微小組織技術開発のすべての手順段階における品質管理のための強力な技術であり、エンドポイント分析へのニーズが高まっています (図 1)。

微小組織学の必要性が高まっていることを示す微小組織処理チェーン。エンドポイント分析に加えて、微小組織の微小解剖学と生物学へのアクセスを提供することにより、微小組織学は、サンプルに対する処理ステップの影響（たとえば、組み合わせた場合に形態や生物学的機能に影響を与える応力や損傷など）を判断するのに役立ちます。免疫組織化学による）。したがって、これは、生産から組織モデルの開発まで、完全な微小組織プロセスフローに役立つ新しい方法を実装するための品質管理に最適な方法です。 BioRender.com で作成されました。

しかし、現在の組織学的プロセスは、微小組織の処理には適応していません。微小組織は生検サンプルよりも小さく、ほぼ透明であるためです。これに加えて、技術的な処理の問題により、処理が遅くて面倒になり、自動化を使用しても再現できない収量が限られた結果が生じる可能性もあります6。

最初に、組織学的処理では、その後のパラフィンへの包埋のための操作を容易にするために、微小組織をヒドロゲル、例えばアガロースに包埋する必要がある7,8。ランダム包埋を行う場合、関連する組織学的分析に十分な適切な材料を確実に利用できるようにするために、数十の微小組織の複製が必要です。この反復回数は不必要に多いように見えますが、特に同じ焦点面にある 5 ～ 10 個の微小組織を正確に位置合わせすることで十分な分析結果が得られるため、より少ないサンプル切片を分析するほうが効率的である可能性があることを考えると、材料の多くが無駄になる可能性があります。堅牢な分析のための情報。たとえば、最近の研究で示唆されている、クライオチューブ内の 0.5% アガロース中で微小組織を遠心分離することにより、複数のサンプルを平面上でより効率的に整列させる可能性があります 9。しかし、この研究で使用されたプール手法は依然としてコストがかかり、依然として貴重な生物学的材料を無駄にしています。

あるいは、微小組織の手動による移送と位置決めは時間がかかりすぎ、自動化の際にボトルネックを引き起こします。代わりに、手動およびランダムなアガロース包埋に代わるエレガントな代替方法は、組織マイクロアレイ (TMA) を使用した並列化されたハイドロゲル包埋に依存しています 7,8。 TMA はサンプルを 2D 配置に配置するのに適しており、マルチウェルプレートなどの細胞培養で使用される標準フォーマット方法の実装を可能にします。 TMA を使用すると、各実験条件のトレーサビリティも保証され、結果として 3D 細胞モデル 10、11 や、ゼブラフィッシュ幼生 12 などの小型生物モデルの組織学に適用できます。ただし、得られたゲルブロック内のサンプルの垂直位置がランダムであるため、すべての微小組織が同じセクション内に位置する可能性は低くなります。 TMA では、プールと比較して実験条件ごとの微小組織の数が減少しているにもかかわらず、サンプルに関するすべての関連データを取得するために多くの切片を処理 (染色や画像化など) する必要があり、その結果、材料費が高くつき、分析に長い時間がかかります。 -結果。

他のいくつかの研究では、組織学的目的（切片化、染色、画像化からなる）のための微小組織包埋の高度な並列化を達成することを目的として、さまざまなアプローチが研究されています。 1 つの方法では、切断面内の位置ずれの影響を分析するために、手動で充填された円筒形ウェルのアレイで設計されたアガロースブロックを使用して、最大 96 個のスフェロイドを並行して調査することから構成されていました8。別の研究では、漏斗マニホールドによる遠心分離を使用して、円筒形ウェルのアレイを備えたアガロースブロックに微小組織をロードしました13。それにもかかわらず、転写を準備するにはプレートを手動で操作する必要がありました。他の出版物 14、15、16 では、3D 細胞モデルの形成と培養、および同じデバイスへのそれらの埋め込みが提案されています。しかし、そのような実験器具は非常に特殊であり、既存の標準的な微小組織製造プラットフォームと互換性がありません。これらの著者の知る限り、ゲルブロック内の標本の共平面性は調査されていません。さらに、組織学的処理は、アガロースブロックの形状および包埋されたサンプルの相対位置に影響を与える可能性があります。

この論文では、微小組織のハイスループット組織学的処理のための費用対効果が高く効率的な方法を提案します。アガロースベースの基質 HistoBrick を使用して、標準アレイ形式で複数のサンプルを調製するための、ユーザーフレンドリーで堅牢な方法について説明します (図 2)。 HistoBrick は、サンプルを単一平面上に整列させることで、分析に必要な切片の数を減らしながら、サンプルの位置決め、ゲル包埋、脱水、パラフィン包埋、切片作成、および光学イメージングを容易にするように設計されました。 HistoBrick 内の標本の相対的な配置とミクロトーム上のブロックの位置を評価できます。さらに、HistoBrick のアプローチは標準の自動化プロセス形式と互換性があり、微小組織学の標準化とハイスループットの自動化への道を開きます。

微小組織の組織学的分析のパイプラインを示す概略図。 HistoBrick は、ホルマリン固定およびパラフィン包埋切片のハイスループット分析に向けて、3D 細胞モデルの作成と組織学的処理の橋渡しに必要な共面アライメントとアレイ配置を提供します。 BioRender.com で作成されました。

市販の 1536 ウェルプレートのアレイピッチの構成に基づいて、SolidWorks (Dassault Systèmes) を使用して、96 本の垂直柱を含む 2 つのシリコンモールドを設計しました。柱の寸法は直径 1.5 mm、高さ 15 mm です。図 3 に示すように、柱は金型の中央に意図的に配置され、両側に 2 つの空きスペースが残されています。このスペースは、一度充填されると、成型および型から外す際のヒドロゲルの取り扱いを容易にするのに役立ちます。ピラーと金型の底部の間の距離は高さ 2 mm で、HistoBrick を得るために必要なヒドロゲルを注入するのに十分なスペースを提供します。金型の設計は、スイスの Spectroplast AG でシリコーン A 50 を使用して 3D プリントされました。

Histobrick デザインとハイドロゲルブロック。 (a) 96 ウェル HistoBrick を作製するためのモールドの CAD、(b) 3D プリンティングによって製造されたシリコンモールド、(c) 96 ウェルを含むヒドロゲルベースの HistoBrick。

HistoBrick の準備に含まれる主な手順を図 4a ～ d に示します。アガロース (Sigma-Aldrich、A7174) をあらかじめ温めた HistoGel (Epredia、HG-4000-012) に 1.5 ～ 2% w/v 比で加え、アガロースが完全に溶けるまで溶液を 80 °C の水浴中で撹拌しました。完全に溶けた。シリコーン型を柱を下に向けてペトリ皿上に置きました。アセンブリはオーブンで 80 °C に予熱されています。次に、10 ml のアガロース-HistoGel 混合物を、加熱したシリコン型に静かに注ぎました。次に、これらの要素を室温で 10 分間放冷しました。その後、ブロックを 4 °C で 2 時間ゲル化させて、型から外すのに十分な機械的安定性を獲得しました。両側を保持しながら中央領域に穏やかな手動圧力を加えることにより、固化した HistoBrick をペトリ皿上の型から外しました。得られた HistoBrick は脱イオン水中で 4 °C で保存され、14 日以内に使用されました。組織学的処理の前後でウェルをよりよく視覚化できるようにするために、アガロース-HistoGel 混合物に青色色素 (Davidson Tissue Dye) を加えて追加の HistoBrick サンプルを調製しました。

HistoBrick の準備と使用。 (a) シリコーン型をピラーを下に向けてガラスペトリ皿に置き、側面の開口部からアガロースとヒストゲルの混合物を型に充填します。(b) 充填された型は 4 ～ 5 °C で 2 分間冷却します。 h、(c) 側面を押して HistoBrick を型から外します、(d) 型から外した HistoBrick、(e) 固定した微小組織をロードします、(f) HistoGel をウェルに加え、4 ～ 5 °C で冷却します、(g)スライシングツールを使用してブロックします。 (h) HistoBrick を 3 つのセグメントに分割した後、2 つの側のセグメントを破棄し、ウェルを含む中央のセグメントを組織学的処理のために保存する必要があります。 (i) HistoBrick の中央のセグメントを組織学に配置します。カセット。

この研究では、Sphericalplate 5D (SP5D、Kugelmeiers Ltd.) を使用して生成されたヒト肝細胞癌 (HepG2) (HB-8065、ATCC) スフェロイド (平均直径 150 ～ 200 μm) のサンプルを使用して調査が行われました。それらの調製のための詳細なプロトコールは、補足方法 S1 に記載されています。固定された HepG2 微小組織は、シングルまたはマルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに 1 つの微小組織をピペットで移すことにより、エッペンドルフチューブから HistoBrick に手動で移されました (図 4e)。微小組織の付着を防ぐために、ピペットチップ (20 μl) を 1% ウシ血清アルブミン (BSA) (A3059、Sigma-Aldrich) でプレコーティングしました。各微小組織は、約 5 μl の水性緩衝液とともに吸引されました。ロードされたチップはゲルに触れずに HistoBrick ウェルの底近くに配置され、気泡の捕捉を防ぐためにサンプルはゆっくりと分注されました。微小組織をウェル内に５分間沈降させて沈殿させた。微小組織を移した後、型を約 1 時間放置して余分な水性媒体を吸収させました。新しいチップを使用して、80℃に予熱した10〜20μlのHistoGelを各ウェルに添加しました（図4f）。最後に、HistoBrick を 4 °C で 1 時間放置して冷却し、ゲル化のプロセスを発生させました。その後、脱イオン水中で 4 °C で保管し、3 日以内に使用しました。

8 つのピペッティングヘッドと Venus ソフトウェアバージョン 2.1 を備えた Microlab STAR 液体処理システム (Hamilton) を使用して、最初のウェルプレートから HistoBrick への HepG2 微小組織の移送を調査するために、いくつかの方法が開発およびテストされました。固定した HepG2 微小組織を 96 ウェル Corning Costar Ultra-Low Attachment (ULA) Multiple Well Plate (CLS7007, Merck) に配置し (ウェルごとに 1 つ)、200 µl のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS Gibco 2062235) に 1 つの微小組織を入れました。）を各ウェルに入れます。デジタルツインラボウェアは、専用ホルダーを使用してデッキ上に配置された HistoBrick をサポートするために作成されました。転写方法には、BSA によるチップのプレコーティングが含まれていました。

前述のように、固定 HepG2 微小組織をロードした HistoBricks を、組織学カセットに収まるようにトリミングしました（図 4g–i）。補足方法 S2 で説明されているように、カスタマイズされたスライシングツールがこの目的のために設計されました。組織学的プロセスは、脱水ステップとそれに続く透明化およびパラフィン包埋で構成され、これらは標準的な実験室手順に従って実行されました。パラフィン包埋ブロックをライカ RM2265 ミクロトーム上に置き、切片を作成しました。合計 75 のセクションが 1 つの HistoBrick から取得されました。各スライスの厚さは 4 μm でした。 3 枚のスライスのうち 1 枚をスライドガラスに載せた後、標準プロトコルに従ってヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色しました。

染色された切片の画像は、Olympus VS120 ホールスライドスキャナーで取得されました。最初に、微小組織を含む領域を特定するために、ガラススライド全体の全体像を倍率 4 倍で取得しました。その後、サンプルスライス全体に分布するいくつかの微小組織が選択され、スキャンプロセス中のスライドガラスの傾きを補正するために焦点が合わせられました。最後に、スキャンによってセクション全体の高倍率 (10 倍または 20 倍) 画像を取得しました。

青色に染色した HistoBrick サンプルは、視覚化を向上させるために準備され、それらのウェルは未染色の HistoGel で満たされ、さまざまな段階でサンプルの直径が評価されました (特に、新たに調製された HistoBrick および組織学処理後に得られたスライド上で)。次に、倒立顕微鏡 (Carl Zeiss Microscopy GmbH) を使用してサンプルの明視野画像を撮影し、FIJI オープンソースプラットフォーム 17 を使用した手動円形フィッティングに基づいてウェルの直径を測定しました。

画像は FIJI プラットフォーム 17 で処理され、TrackEM モジュール 18 を使用してさまざまなセクションのウェルアレイが調整されました。画像には 2 つの処理が行われ、まず位置合わせパフォーマンスの信頼性を保証するために各画像上でランドマークが手動で選択されました。次に、位置合わせを確実にするために、画像の自動剛体変換がスタック全体に適用されました。続いて、各微小組織の赤道面の位置が、画像スタック全体にわたって対応する微小組織の最大セクションを含む平面であると視覚的に特定された。微小組織の 2 つの連続するセクションが著しく類似していると特定された場合、それらの赤道面は 2 つのセクション間の中心となる赤道面として選択されました。複数の微小組織が同じウェルに埋め込まれた場合、それらの赤道面の位置は非常に近接していた（差が 15 μm 未満）ため、それらは一緒に平均化されました。この手順により、3D 空間位置でフィッティングを実行するときに各ウェルの寄与のバランスがとれ、最適なフィッティング平面が追加の微小組織を含むウェルによって偏らないことが保証されました。次に、3D 位置を MATLAB (2012、MathWorks) で処理し、処理された HistoBrick サンプルごとに平均二乗誤差の最小化によって最適な平面を特定しました。

アガロースで構成された HistoBrick ブロックは、専用のシリコンモールドを使用して簡単に作製できます。 HistoBrick 内の 96 個のウェルの直径は、脱イオン水での安定化後に 1.7 ± 0.1 mm であり、金型ピラーの直径から 6% の誤差が生じます。ただし、標準の 1,536 アレイのピッチは維持されるため、自動リキッドハンドラーを使用したサンプルのロードが容易になります。

HistoBrick は、脱水、パラフィン包埋、ミクロトームによる切片作成、染色などの組織学的処理ステップに適しています。図 5c と d を比較すると、ウェルの視覚化を容易にするために青色の色素を使用することが重要であることがわかります。複合ヒドロゲルブロックに対する処理の効果を決定するために、HepG2 微小組織が埋め込まれた 2 つの青色 HistoBrick サンプルのスライスでウェル直径 (D) と 2 つの軸 (P1 および P2) のアレイピッチを測定しました (図 1)。 5c–f)。結果は、ウェル直径が 34% 縮小したことを示しています。組織学処理後に測定されたピッチは 1.7 mm で、これは 28% の減少に相当します。ゲル包埋後または組織切片内に気泡は観察されませんでした（図５ａ）。 HepG2 微小組織は、H&E 染色後も無傷のままでした (図 5b)。

さまざまな処理ステップを経た HistoBrick 内の HepG2 微小組織の画像。 (a) HistoBrick に埋め込まれ、HistoGel をトッピングした後の HepG2 微小組織 (矢印で示す)。マイクロウェル内に気泡が閉じ込められていないことに注意してください。(b) 単一の微小組織の切片の H&E 染色。(c) 色素を含まないスライスの顕微鏡画像。井戸の輪郭を決定するのは困難です。 (d) 青色の染色を使用したスライスの顕微鏡画像。ウェルの輪郭がはっきりと見えることに注目してください。 (e) パラフィン包埋前の HistoBrick のウェルの直径とピッチを測定します。(f) 切片化後の HistoBrick のウェルの直径とピッチを測定します。パラメータ D は直径ですが、P1 と P2 はマイクロウェルアレイの 2 つの軸上のピッチを比較するために使用されます。

組織学的分析のスループットは、切片作成手順中にブロック内で微小組織がどのように配置されるかに大きく依存するため、この論文の著者らは、HistoBrick に特化したアプローチを使用して HepG2 微小組織の位置合わせを特徴付けました。このアプローチでは、微小組織サンプルがウェルの底に沈降し、水平面上に整列します。図 6a は、H&E 染色後に 1 つの 96 ウェル HistoBrick サンプルから得られた切片の明視野画像の 3 つの例を示しています。 HepG2 微小組織は、ウェルの境界内の暗いスポットとして簡単に識別されます。サンプル懸濁液から HistoBrick を手作業で不正確にロードした結果、ウェルが空になったり、最大 3 つの微小組織が入ったりすることがあります。図 6b は、最初の組織切片および最適な平面に対する、Z 軸に沿った HistoBrick 内の微小組織の位置を示しています。図 6c は、位置決めツールを使用して準備された 5 つの HistoBrick ブロック (青色) と他の 2 つのブロック (緑色) における最初の組織切片からの複数の微小組織の位置を示しています。組織学的プロセスの結果、パラフィンと元の HistoBrick サンプルの表面が平行になったと仮定すると、位置合わせ面は切断面に対して 0.22 ± 0.06°の角度を形成します。この角度は、HistoBrick アレイのラインに沿った 1 番目と 12 番目のウェルの 2 つの微小組織間に約 70 μm の相対的なずれを表すため、分析に重大な影響を与える可能性があります。傾斜角度は HistoBrick サンプルごとに異なるため、7 つのサンプルの微小組織を直接比較できるように、最適な平面が導入されました (図 6d)。すべての HistoBrick サンプルでは、アライメントツールの使用とは関係なく、微小組織の 75% の中心が最適な平面から平均 ± 40 μm の位置にあります。言い換えれば、微小組織の 75% は、ブロック内の 80 μm の厚さのバンド内に中心が位置しています。

埋め込まれた HepG2 微小組織の同一平面性。 (a) 同じ処理ブロックからの 3 枚の H&E 染色スライドの明視野画像。点線で囲まれた例のように、明るい円板はウェルに対応し、暗い点は微小組織に対応します。(b) HistoBrick 内の回転楕円体の位置の概略図。最適な平面 (黄色の線) は、ミクロトーム上のブロックの手動位置決めの結果である傾斜角度 (赤色、最適な平面とミクロトームのブレードの平面によって形成される角度) を補正するための仮想の平面です。（ c ）7つの異なるHistoBrickサンプルの最初の組織切片からの微小組織の中心の距離[5つのヒストブリックは位置合わせツールなしで切断され（青色のボックス）、2つのヒストブリックは位置合わせツールを使用して切断されました（緑色のボックス）]。 (d) 同じ 7 つの HistoBrick サンプルの最適な平面から微小組織の中心までの絶対距離。

HistoBrick の自動ワークフローへの統合を評価するために、自動リキッドハンドラーと 96 ウェル ULA プレートを使用してさまざまな方法がテストされました。各ウェルには、200 μl の PBS を含む 1 つの HepG2 微小組織が含まれていました。 HistoBrick の各ウェルでは、理論的には 2 ～ 10 µL の量を収集できます。開発されたアプローチは、図 7 に示すように 3 つの主要なステップで構成されていました。まず、ULA プレートから 1 つの HepG2 微小組織を選択することは、300 μl カーボンチップを使用してウェル容量 (200 μl) を完全に吸引した場合にのみ成功しました。適用済み。試験した部分容積吸引では微小組織をうまく捕捉できませんでした。第二に、微小組織がチップの底に沈降できるように一時停止が行われました。最後に、調剤は 2 段階で調査されました。最初のテスト段階では、チップの内容物が標準の 96 ウェルプレートに完全に分注されました。このアプローチにより、HepG2 スフェロイドの 87.5% がうまく採取、移送、分注されました。この性能は、分注チップのコーティング (BSA)、回転楕円体のサイズ、およびプレートの底部への微小組織の付着に依存しました。 2 番目のテスト段階では、1 つの HistoBrick ウェルの容量範囲 (2 ～ 10 μl) に達する部分容量分注がテストされました。しかし、採取した 200 μl から 20 μl 未満の量の微小組織を部分的にジェット分注することは、再現可能な方法では達成できませんでした。ハードウェアの技術的限界と複雑なメソッドの最適化が制限要因となっているようで、このロボットプラットフォームを使用して 150 ～ 200 µm の HepG2 微小組織を 1 対 1 で自動搬送することは不可能でした。

研究室用自動液体ハンドラーを使用した 150 ～ 200 µm の HepG2 微小組織の移送方法の開発。 BioRender.com で作成されました。

研究および個別化医療の分野における 3D 細胞モデルの応用は、疾患のメカニズム、インビトロでの治療アプローチ、および治療計画の詳細な調査を可能にするため、徐々に拡大しています。患者由来の細胞の使用は大きな資産ですが、細胞ソースは限られています。これに関連して、微小組織ベースの研究は、処理チェーン全体を通じて信頼できるものである必要があります。これには、微小組織の生産、成熟、検査、エンドポイント分析が含まれますが、これらに限定されません。これに関連して、実験プロセスの開発と検証をサポートする分析方法の標準化（多くの場合、自動化が必要になります）が必要です。

この一連の研究は、コスト効率、トレーサビリティ、およびハイスループットの検査手順への準拠に焦点を当てた TMA アプローチを実装することにより、微小組織の組織学的分析を促進することを目的としています。以前の研究では TMA アプローチを使用する利点が示されていますが、これらの検討はより大きな標本 (直径 500 μm の範囲) に対して行われました 7、8、10、11。この論文で紹介されている新しいアプローチである HistoBrick は、小さな HepG2 微小組織 (直径 150 ～ 200 μm) を使用するだけでなく、標本の正確な位置合わせも可能にし、さまざまな標準ハードウェアと互換性があります。

HistoBrick は、3D 細胞モデルの共面包埋用の使いやすいヒドロゲル実験器具を実装することにより、ハイスループットの顕微組織学を促進します。その設計は自動化標準と互換性があります。 HistoBrick で収集されたデータは、13 スライスというより少ない選択を使用して、最大 96 サンプルの組織学的結果を実行して収集できることを示しています。設計されたシリコンモールドにより、アガロースベースのヒドロゲルへのメソスケールウェルの複製が容易になり、サンプルロード前に少なくとも 14 日間湿潤条件で保管できるマルチウェルデバイスが得られます。モールドの柔軟性と、アレイの両側に 2 つの開口部を備えたその設計により、型から外すときに十分な曲げが可能になり、ゲルの破損を防ぐことができます。さらに、HistoBrick のメソッドは、ウェルにロードされる際の検体の受動的な沈降と沈降のみに基づいており、微小組織の移送後に追加の処理手順は必要ありません。パフォーマンスの面では、HistoBrick は組織学的プロセス全体と満足のいく互換性を示しています。ウェル、アレイ、サンプルの寸法は脱水およびパラフィン包埋手順の影響を受けますが、サンプルの 2D 配置は保存されているため、サンプルを明確に追跡することが可能です。さらに、組織学的処理後、〜 80 µm の精度範囲で平面上に整列されます。これは、結果が小さな HepG2 微小組織 (直径 150 ～ 200 μm) で得られたものであるため、得られた位置合わせ精度がサンプルサイズの分散に近いため、特に重要です。最新の標準化された微小組織生産プラットフォームは、アレイ間で均一なサイズを保証しています19、20、21。アライメント方法は沈降に基づいているため、HistoBrick はそのようなプラットフォームの分析ニーズに特に対応しています。

以前の研究では、アライメント性能を評価する際のミクロトーム上のアガロースブロックの位置決めの重要性が実証されました8。この研究では、アガロースベースの TMA がアガロースとともに組織学カセットに接触して配置され、ゲルブロックの切片作成をサポートする一方、微小組織サンプルはブレードに面するピラーの上部に配置されました。 HistoBrick ブロックは最初に脱水され、サポートなしでパラフィンで包埋され、得られたサンプルの整列面はミクロトームのブレードに対して 0.2° ～ 0.3° の角度のみを示しました。カスタマイズされたツールは、ブロックとブレードの位置を調整するのに役立つ補完的なパラフィン包埋ステップ用に設計されており、この技術の経験の浅いユーザーにとって将来的に役立ちます。ただし、この文書では高度なスキルを持つユーザーによって位置合わせが見事に調整されたため、この例ではツールの有効性を調査しないことが決定されました。ブロックとブレードの位置合わせはオペレーターに大きく依存するため、このプロセスの標準化を支援する専用ツールの開発は、将来的に簡単に導入できるように、HistoBrick の開発における重要なステップとして依然として考慮されていました。

HistoBrick のウェルは、液体ハンドリングプラットフォームの自動化基準に準拠するために、1536 グリッド上の 96 ウェルアレイとして設計されました。 HistoBrick のデッキレイアウト上でのフォーマットと配置が成功した場合、自動化された 1 対 1 の微小組織移植手順には制限が生じます。理想的には、96 ウェルプレートの各微小組織を 2 ～ 10 μl の PBS でピックアップし、直接 HistoBrick に移し、その後 HistoGel で包埋します。しかし、丸底 ULA プレートから単一の微小組織をうまく採取するには、200 μl の全量を吸引する必要があり、微小組織はウェル内にランダムに配置されていました。チップ内でのサンプルの沈降を可能にした後、HistoBrick ウェルへの 2 ～ 10 μl の部分分注が達成できませんでした。この研究でテストされた条件は、単一のウェルに分離された微小組織を入力として、標準的な液体処理プラットフォームを使用した 1 対 1 の移送をテストすることを目的としていました。これらの開始条件は、大規模な標準化された微小組織生産プラットフォームが、より大量の微小組織のプール (< 1 ml) または少量の単離された微小組織 (< 100) に依存していることを考慮して、学校の事例として巧妙に考慮されました。 μl）22．試薬のピペッティングや培地交換などのプロセスは研究室自動化システムの標準的な操作ですが、3D 細胞モデルの転送は依然として困難です。これは主に、吸引中に 3D 細胞モデル上にピペットチップを正確に配置するためであり、これには光学的なフィードバックが必要です。それがなければ、より大量の液体がなければ微小組織の採取を成功させることができません。したがって、少量の液体 (< 20 µl) の必要な部分分注は、従来の装置では不可能ではないにしても困難です。バイオプリンティング 3D 細胞モデルは新興分野 23 であり、より大きな構造物のピックアンドプレース操作が実証されています 24 が、3D 細胞モデルをある場所から別の場所に明確に移動するためのピックアンドプレース操作についてはほとんど見つかりません。

この研究では、HistoBrick は、最大 96 個の微小組織を同一平面上に配置してサンプルを包埋するための、ユーザーフレンドリーでコスト効率が高く、堅牢な方法を提供します。この技術により、組織学的処理中に失われる標本の数が大幅に削減され、貴重な生体材料が節約されます。 HistoBrick アプローチは、微小組織学を使用した標準化されたサンプル分析を容易にします。患者由来の細胞を効率的に使用することは、研究や層別医療における 3D 細胞モデルの普及を促進する鍵となります。現在、このメソッドを完全に導入するには、複数の 3D 細胞モデルを 1 つの実験器具から別の実験器具に効率的に転送できる液体ハンドリングプラットフォームの開発が必要です。

この原稿に記載されているすべてのデータと記載されている方法の詳細は、責任著者にリクエストがあればすぐに利用できるようになります。

キム、J.、クー、B.-K. & Knoblich、JA ヒトオルガノイド: ヒトの生物学と医学のモデルシステム。ナット。モル牧師。セルバイオル。 21、571–584 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Schneeberger、K. et al. バイオファブリケーションとオルガノイド技術の融合: 肝臓および腸組織工学の次のフロンティア? バイオファブリケーション 9、013001 (2017)。

記事 ADS Google Scholar

Driehuis, E.、Kretzschmar, K. & Clevers, H. 薬物スクリーニング用途のための患者由来のがんオルガノイドの確立。ナット。プロトック。 15、3380–3409 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

マサチューセッツ州ランカスターとJA州ノブリッヒ皿の中の器官形成: オルガノイド技術を使用した発生と疾患のモデリング。サイエンス 345、1247125 (2014)。

記事 Google Scholar

ボック、C.ら。オルガノイド細胞アトラス。ナット。バイオテクノロジー。 39、13–17 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

オルセン、TR et al. 組織学的検査のための細胞スフェロイドの処理。Ｊ．Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． 37、138–142 (2014)。

記事 Google Scholar

Yan, P.、Seelentag, W.、Bachmann, A. & Bosman, FT アガロースマトリックスは組織マイクロアレイブロックの切片化を容易にします。Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．サイトケム。 55、21–24 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Gabriel, J.、Brennan, D.、Elisseeff, JH & Beachley, V. 3D 細胞スフェロイドの並行分析のためのマイクロアレイの包埋/切片化。科学。議員9号、16287号（2019年）。

記事 ADS Google Scholar

張、S.-W. 他。オルガノイドの細胞組織学的分析のための効率的で使いやすい方法。 J.組織工学。リジェネ。医学。 15、1012–1022 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Decembrini, S.、Hoehnel, S.、Brandenberg, N.、Arsenijevic, Y. & Lutolf, MP 標準化されたスケーラブルな網膜オルガノイド培養用のヒドロゲルベースのミリウェルアレイ。科学。議員 10、10275 (2020)。

記事 ADS CAS Google Scholar

カバディ、PK 他深部へ: in vitro の 3 次元微小組織視覚化技術。バイオテクニック 59、279–286 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

NA Sabaliauskas et al. ハイスループットのゼブラフィッシュ組織学。方法 39、246–254 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

Weisler, W.、Miller, S.、Jernigan, S.、Buckner, G. & Bryant, M. 球状癌細胞培養物のマイクロアレイを配置するための遠心流体デバイスの設計とテスト。Ｊ．Ｂｉｏｌ．工学 14、7 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Thomsen, AR et al. 接着に依存しない三次元細胞培養とダイナミックボリューム測定のためのディープコニカルアガロースマイクロウェルアレイ。研究室チップ 18、179–189 (2017)。

記事 Google Scholar

シメオネ、K. 他パラフィン包埋リソグラフィーおよび顕微解剖された組織マイクロアレイ: ex vivo 固形腫瘍の生物学的および薬理学的分析のためのツール。研究室チップ 19、693–705 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

栗生 S.、角之園 T.、木坂近藤 S.、石田 T. 形態学的および免疫組織化学的分析のためのマイクロ流体デバイスでのスフェロイドのスライス。マイクロマシン 11、480 (2020)。

記事 Google Scholar

シンデリン、J.ら。フィジー: 生物学的画像解析のためのオープンソースプラットフォーム。ナット。メソッド 9、676–682 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Cardona, A. et al. TrakEM2 神経回路再構成ソフトウェア。 PLoS ONE 7、e38011 (2012)。

論文 ADS MathSciNet CAS Google Scholar

ワスマー、C.-H. 他。三次元培養または移植のための初代膵島細胞スフェロイドの操作: 方法論的な比較研究。細胞移植。 29、0963689720937292 (2020)。

記事 Google Scholar

Brandenberg, N. et al. マイクロキャビティアレイにおける幹細胞凝集によるハイスループットの自動オルガノイド培養。ナット。バイオメッド。工学 4、863–874 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

ワードウェル・スワンソン、J.ら。創薬用の 3D モデルのハイコンテンツイメージングを最適化するためのフレームワーク。 SLAS ディスコブ上級科学。ドラッグディスコブ。 25、709–722 (2020)。

記事 Google Scholar

Velasco, V.、Shariati, SA & Esfandyarpour, R. オルガノイドモデルのためのマイクロテクノロジーに基づく方法。マイクロシスト。ナノエン。 6、76（2020）。

記事 ADS CAS Google Scholar

Jakab, K. et al. 生細胞の自己組織化およびバイオプリンティングによる組織工学。バイオファブリケーション 2、022001 (2010)。

記事 ADS Google Scholar

Blakely, AM、Manning, KL、Tripathi, A. & Morgan, JR バイオピック、配置、灌流: 三次元組織工学のための新しい機器。組織工学パート C メソッド 21、737 ～ 746 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

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著者らは、組織学用サンプルの処理について、EPFL 組織学コア施設の Jessica Sordet-Dessimoz と彼女のチームに感謝します。この研究は、イノスイスプロジェクト 39848.1 IP-LS の下でスイスイノベーションエージェンシーによって支援されました。

CSEM SA、Jaquet-Droz 1、2002、ヌーシャテル、スイス

サラ・ヒューブ、ファテメ・ナヴァイ、ダニエル・ミリオッツィ、ダイアン・ルドロイ、ステファニー・ボーダー＝パッシェ、ジョナス・ゴルドフスキー、エミリー・ヴイユ・ディット・ビル、ヴァンサン・レボル＆ジル・ウェダー

応用科学芸術大学生命科学部、スイス北西部、4132、ムッテンツ、スイス

ジョエル・ホーファー、カリン・ガイザー、ローラ・スーター＝ディック

スイス応用ヒト毒性学センター (SCAHT)、4001、バーゼル、スイス

ローラ・スーター・ディック

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SH は HistoBrick のアイデアを考案しました。 DMが金型を設計しました。 FN は切断および位置合わせツールを設計しました。 DM と FN は、ヒドロゲルゲルとメソッドの最適化実験を実行しました。 FN は HepG2 微小組織を作成し、アライメント実験を実施しました。 JH と CG は HistoBrick をテストし、プロトコルの最適化に貢献しました。 DMは画像処理手法とEV-D.-Bを開発しました。微小組織の位置の統計分析を行いました。 DL と JG は自動転送方法を調査しました。 SH は原稿の準備を調整しました。 CG、LS-D.、VR、SB-P. そしてGWはデータを評価し、原稿をレビューしました。

サラ・ヒューブへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Heub, S.、Navaee, F.、Migliozzi, D. 他。ハイスループットの微小組織学を目的としたヒドロゲルへの複数の 3D 細胞モデルの同一平面上埋め込み。 Sci Rep 12、9991 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-13987-4

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受信日: 2022 年 1 月 12 日

受理日: 2022 年 5 月 31 日

公開日: 2022 年 6 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13987-4

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