ラベルの仮想組織染色 - 南通組織消耗品有限公司

Scientific Reports volume 12、記事番号: 10296 (2022) この記事を引用

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組織病理学的視覚化は、現代医学および生物学研究の柱です。外科腫瘍学は、最終的な手術の成功を判断し、補助治療を導くために、もっぱら術後の組織学に依存しています。現在の組織学のワークフローは、組織化学的に染色された組織の明視野顕微鏡による評価に基づいており、いくつかの大きな制限があります。たとえば、明視野評価用の染色標本の準備には長時間のサンプル処理が必要であり、介入が数日または数週間も遅れることもあります。したがって、組織病理学法の改善が急務となっている。本稿では、未染色組織の全吸収光音響リモートセンシング（TA-PARS）画像の仮想ラベルフリー組織化学染色のための深層学習ベースのアプローチを紹介します。 TA-PARS は、散乱や全吸収 (放射および非放射) などの直接測定された一連のラベルフリーコントラストを提供し、任意の組織構造を推測する必要なく H&E カラー化を開発するのに最適です。私たちは、Pix2Pix 敵対的生成ネットワークを使用して、ラベルフリー TA-PARS 画像からの H&E 染色に類似した視覚化を開発します。ヒトの皮膚組織の薄切片は、最初に TA-PARS で仮想的に染色され、次に H&E で化学的に染色され、仮想染色と化学的染色が 1 対 1 で比較されました。 1 対 1 で対応付けられた仮想染色画像と化学染色画像は、ゴールドスタンダード H&E に対して TA-PARS 画像のデジタルカラー化を検証する高い一致性を示します。 TA-PARS 画像は 4 人の皮膚病理学者によって検査され、診断品質があり、解像度、コントラスト、色が H&E であるかのように解釈できることが確認されました。提示されたアプローチは、TA-PARS スライド不要の組織学的イメージングの開発への道を開き、標本切除から組織学的イメージングまでの時間を大幅に短縮することが期待されます。

組織病理学は、がんの診断と予後、外科腫瘍学、創薬と開発を含む多くの分野における基本的な顕微鏡検査ツールです1。顕微鏡イメージングのための組織染色は、組織サンプルの組成を識別するのに役立ち、組織病理学を可能にしました。組織学的イメージングのゴールドスタンダードは、染色されたホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 薄組織標本の明視野顕微鏡検査であり、最も一般的な染色セットはヘマトキシリンアンドエオシン (H&E) です。ヘマトキシリンは細胞核を濃い青紫で染色し、エオシンは細胞質と細胞外マトリックスをピンク色で染色します2。

これらの染色された FFPE 標本を明視野顕微鏡評価用に開発するには、固定、包埋、切片化、染色という骨の折れるプロセスが必要であり 3、この手順が完了するまでに数日かかります 4。この長いプロセスにより、術中の迅速な評価に一般的に使用される技術である凍結切片 (FS) 組織学が採用されるようになりました。 FS により、所要時間は約 20 分5 になります。しかし、FS 用の標本のサンプリングは限られており、難しい技術的プロセスを伴います。急速凍結により細胞の形態を劣化させるアーチファクトが生じ、それが病理学者による組織サンプルの病理学的診断に影響を及ぼします5。これらの制限のため、FFPE の組織化学的手順は、依然としてかけがえのないゴールドスタンダード法であり続けています。

組織化学的染色はサンプル評価を遅らせるだけでなく、サンプル前処理ステップにより複数の化学物質による組織組成が永続的に変化します。つまり、組織は切片ごとに 1 回しか染色されない可能性があります 2。希望する染色コントラストごとに独立したスライドを準備する必要があります。この集中的な FFPE 組織の準備により、がんの診断と辺縁の評価が 1 週間以上遅れる可能性があり、その結果、補助治療や補助処置も遅れます。これにより、正確、高速、再現可能な組織像のような画像をラベルフリーで提供する臨床的に受け入れられる技術が促進されます。

病理学者は主に組織化学的に染色された組織サンプルを診断するように訓練されているため、有望なアプローチの 1 つは、化学的染色効果をシミュレートして、ラベルされていない組織の仮想 H&E のような視覚化を生成するアルゴリズムを開発することです。これにより、ラベルフリーツールの導入が容易になります。さらに、仮想染色により組織が保存され、同じ組織切片の下流処理が可能になります。臨床現場では、これにより小さな組織標本の診断上の有用性が向上します。さらに、仮想染色は分析前のばらつきを排除することで、わずかなプロセスの変動によって引き起こされる研究室間および研究室内の染色ばらつきを低減し、臨床病理学における大きな課題に対処できるはずです。最後に、現在の染色を直接複製することで、採用に必要なステップである真の H&E に対する 1 対 1 の検証が可能になります。

定量的位相イメージング 6、反射共焦点顕微鏡 (RCM) 7、紫外表面励起顕微鏡 (MUSE) 8,9、光コヒーレンストモグラフィー (OCT) 10,11 など、H&E のようなイメージング機能を提供するためにいくつかの光学顕微鏡が開発されています。 12、自家蛍光顕微鏡法13、および光音響顕微鏡法（PAM）14、15、16、17。これらの方法は通常、深層学習ベースの仮想染色モデル、特に敵対的生成ネットワーク (GAN) と組み合わせられます 18。顕微鏡画像がキャプチャされ、仮想 H&E 染色を実行するネットワークのトレーニングに使用されます。したがって、得られる仮想 H&E 染色の品質は、画像の取得に使用される光学顕微鏡の特性によって直接決まります。理想的なケースでは、顕微鏡技術は、(1) 反射モードで動作し、厚い組織標本のイメージングを可能にし、(2) 現在の組織化学的染色と同様のコントラストを提供し、重要な診断特徴の推論を回避することで人工的な色付けの品質を向上させます。 H&E のようなイメージングにおいて顕著な進歩を示した他の光学顕微鏡には、ライトシート顕微鏡法 (LSM) 19 や誘導ラマン散乱顕微鏡法 (SRS) 20,21 があります。

リストされた技術のうち、MUSE と LSM は、標準的な H&E 染色特異性を模倣し、H&E 染色組織像と許容できる一致を示しています。ただし、MUSE と LSM は両方とも、H&E コントラストを提供するために蛍光染色に依存しています。これらの色素は潜在的に変異原性、発がん性、または毒性を示す可能性があり、これらの蛍光ベースの技術の現場での適用性を妨げます9。さらに、LSM は新鮮な組織の 3D 体積イメージングに比較的透明なサンプルを必要とするため、追加の機器と長い前処理時間が必要となり、この技術は術中設定では実用的ではありません 19。したがって、ラベルフリー技術が好都合である。

人気のあるラベルフリーモダリティの 1 つである SRS は、分子結合の振動共鳴を利用してコントラストを提供します 22。 SRS は、薄い組織サンプルと厚い組織サンプルの両方で H&E 染色と比較した場合に有望な結果を示しています。ただし、SRS は通常、送信モードで動作します21、22、23。厚い組織は通常、画像を取得するために透過可能な厚さまで圧縮されます20。これにより、組織の形態が大きく変化します。これは病理学者の評価に影響を与えるだけでなく、SRS がその場画像化に実用的でなくなることにもなります。

逆に、OCT は通常、反射モードで動作し、厚い組織標本のイメージングに適しています。 OCT は、ラベルフリーの組織ブロック画像処理 11,24、切除断端評価 25,26、生検検査 27,28 において可能性を示しています。ただし、OCT は主に形態学的情報を強調表示する光学散乱コントラストを使用します。このコントラストには、組織学的分析に不可欠な、細胞核や細胞質などの生体分子を区別するのに十分な特異性が欠けています。その後、人工的な色付け方法でこれらの重要な診断特徴の構造を推測する必要があり、診断の信頼性が大幅に低下します。これにより、より高い発色団特異性を備えたラベルフリーの顕微鏡モダリティの採用が促進され、カラー化の信頼性が向上する可能性があります。

最近、自家蛍光顕微鏡法が仮想組織学の人気の候補として浮上しています。自己蛍光は、UV から ~ 500 nm の範囲の励起波長で、エラスチン、コラーゲン、アミノ酸、NADPH、その他の細胞小器官などの生体分子をラベルフリーで可視化します29。以前、Rivenson et al.13 は、自己蛍光画像からの仮想 H&E 染色の開発に成功しました。この研究では、カラー化を目的として、自家蛍光画像と H&E 染色画像のペアでディープニューラルネットワークをトレーニングしました。この方法は、H&E 染色プロセスをバイパスして、自己蛍光画像に適用することに成功しました。しかし、バルク組織におけるこの技術の広範な実現は、自己蛍光コントラストによって制限されました。自己蛍光はエオシン染色に似た多くの生体分子を強調表示しますが、DNA と核 30 は測定可能な自己蛍光をまったく示しません 31。したがって、多くの診断要素が存在しますが、核の特徴は測定できないため、色付けネットワークは核の特徴を推定する必要があります。核構造の推定 (がん診断の重要な決定要因) は、臨床採用と規制当局の承認に課題をもたらします。

モダリティの 1 つである PAM は、強力なラベルフリー顕微鏡モダリティとして登場し、幅広い発色団の選択的な生体分子コントラストを提供します。 PAM は、特定の励起波長を使用して個々の発色団の光吸収特性をターゲットにすることにより、正確な識別を可能にします。これまでに、PAM システムは、ヘマトキシリン染色 32,33 に類似した核の可視化と、エオシン染色 15 に類似した結合組織イメージングの両方を回復することが示されています。ただし、従来の PAM システムには 1 つの大きな欠点があります。 PAM はハイブリッド光音響イメージングモダリティであり、光吸収によって引き起こされる光音響圧力が超音波信号として捕捉されます。これらの音圧波を測定するには、音響的に結合された超音波トランスデューサが必要です。効果的な音響結合が必要であるということは、トランスデューサを試料に接触させるか、水槽などの結合媒体に浸漬する必要があることを意味します14、15、16。この配置は、いくつかの臨床応用に対する PAM の適合性を妨げます。

新しく開発されたモダリティである光音響リモートセンシング (PARS) 34、35、36 は、PAM の欠点を克服します。 PARS では、音響的に結合された超音波トランスデューサーが二次共焦点検出レーザーに置き換えられ、堅牢な全光学式の非接触ラベル不要の光音響イメージングが提供されます 37。過去数年にわたり、PARS はラベルフリーの組織学的イメージング分野における強力な競争相手として浮上してきました 34、35、36、38。 PARS は、DNA の UV 吸収 (ヘマトキシリン染色に類似) 34,35 をターゲットにし、シトクロムの 420 nm 吸収 (ヘマトキシリン染色に類似) 34 をターゲットにすることにより、現在の組織化学染色をエミュレートできます。最近の研究では、PARS が新たに切除された組織、ホルマリン固定組織、および FFPE 組織切片において高コントラストと高空間分解能を提供する可能性があることが示されています 35,36。切除組織では、PARS は表面下の核の 3D イメージングを提供することさえ示されています 35。

この論文では、第 2 世代 PARS アーキテクチャである全吸収光音響リモートセンシング (TA-PARS)36 を採用し、ラベルフリーの組織学的画像を提供します。 Ecclestone et al.36 によって概説されているように、TA-PARS アーキテクチャには多くの進歩が組み込まれており、組織標本を画像化する際の感度とコントラストが向上しています。 TA-PARS は切除組織に適用され、H&E 染色と同様のコントラストを直接測定し、核と細胞質を個別に捕捉します。提案されたフレームワークは H&E 情報を直接測定するため、確実なカラー化モデリングが可能になります。さらに、これにより、臨床応用に許容される出力を提供しながら、グラウンドトゥルース H&E 染色と直接比較する機会が提供されます。

TA-PARS は、ターゲット励起光のパルスを発色団に導入し、発色団が吸収した光エネルギーを放出するときに緩和プロセスを捕捉することによって動作します。この緩和には、放射性経路と非放射性経路の 2 つの主な経路があります。非放射緩和中、吸収された光エネルギーは熱として放散されます。これにより、励起プロセスが十分に速い場合、局所的な熱弾性膨張と光音響圧力が生成されます37。非放射緩和は局所的な光学特性の変調を引き起こし、共焦点の TA-PARS 検出レーザーの後方反射強度変動として捕捉されます。 266 nm 励起を使用すると、非放射吸収により主に核構造が明らかになり、通常は「H」染色によって視覚化されます。逆に、放射緩和中は、吸収されたエネルギーが光子として放出されます。放射緩和は、蛍光イメージングと同じメカニズムで、これらの吸収誘起光放出として捕捉されます。 266 nm 励起を使用した場合、放射吸収コントラストは通常、「E」染色によって一般に明らかにされる核外の特徴を示します。光吸収率に加えて、TA-PARS 検出レーザーを使用して局所散乱も捕捉されます。光学散乱により、薄い組織切片の形態構造が明らかになります 38。

全体として、TA-PARS 顕微鏡検査は、放射吸収、非放射吸収、および光学散乱コントラストのラベルフリーの非接触イメージングを同時に提供します。私たちの知る限り、TA-PARS は 1 回の撮影で 3 つのコントラスト機構すべてを提供できる唯一のモダリティです。この豊富な入力データにより、細胞核、フィブリン、結合組織、脂肪細胞、ニューロン 36 などの構造を 1 回の興奮イベントで同時に回復できます。ネットワークのトレーニングと色付けにこのより有益なデータセットを使用すると、深層学習ベースの仮想組織学的染色の診断の信頼性を向上させることができます。

ここでは、汎用の画像間変換モデル、つまり Pix2Pix39 を使用して、TA-PARS システムによってキャプチャされた組織学的画像をカラー化します。 Pix2Pix モデルは、与えられた入力 (トレーニング) データに基づいて新しいデータセットを作成する生成モデルの一種である敵対的生成ネットワーク (GAN)18 に基づいて設計されています。このアーキテクチャは、新しい実行可能なデータを作成するジェネレーターサブネットワークと、新しく生成された (合成) データとグランドトゥルース (実際の) データを区別しようとするディスクリミネーターサブネットワークで構成されます。 2 つのサブネットワークは敵対的プロセスで同時にトレーニングされます。このプロセスでは、ジェネレーターモデルは識別器モデルのエラー率を最大化することを目的とし、識別器モデルは分類エラーを最小限に抑えようとします。トレーニングタスクでは、従来のスライドイメージング手順を使用してキャプチャされた H&E 画像と同時登録された TA-PARS チャネルのマルチコントラスト画像がネットワークに供給されました。

TA-PARS が提供する一連のコントラストを通じて、H&E 情報を直接取得します。 1 つのデータセットで目的の H&E コントラストを直接測定することで、強力な深層学習モデルが可能になり、細胞核などの特徴の存在に関する仮定や根拠のない推論が回避されます。提案された研究は、組織スライドの H&E のような TA-PARS を提供し、ゴールドスタンダードに匹敵する画像をもたらします。 TA-PARS の仮想組織学画像は 4 人の皮膚病理学者によって検査され、診断品質があり、解像度、コントラスト、色が H&E であるかのように解釈できることが確認されました。これは、新鮮な組織標本のスライド不要の仮想染色を特徴とする代替の組織病理学的ワークフローの開発に向けた重要なステップです。最終的には、組織学に似たその場イメージングを実現することで、ほぼリアルタイムの術中の断端評価が可能になるでしょう。

この研究で使用されたデータセットは、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) ヒト皮膚組織の薄切片から収集されました。匿名の組織サンプルは、Cross-Cancer Institute (カナダ、アルバータ州、エドモントン) の臨床協力者によって提供されました。これらのサンプルは、アルバータ州研究倫理委員会 (プロトコル ID: HREBA.CC-18-0277) およびウォータールー大学保健研究倫理委員会 (外科的切除、針生検の光音響リモートセンシング (PARS) 顕微鏡検査、および病理標本;プロトコルID: 40275)。サンプルは患者の診断にはもはや必要のない保存組織であるため、倫理委員会は患者の同意を放棄し、患者の身元に関する情報は研究者に提供されなかった。ヒト組織を含むすべての実験は、「ヒトを含む研究の倫理的行為 (TCPS 2)」などのカナダ政府のガイドラインおよび規制に従って実施されました。

仮想染色手順に必要な、同時登録された TA-PARS と H&E のペアのデータセットは、次のように取得されました。染色されていない薄い組織切片を TA-PARS システムで画像化しました。画像化したら、標本を染色し、明視野顕微鏡でスキャンして、まったく同じサンプルの一致する TA-PARS および H&E 画像ペアを生成しました。データセットの作成手順を図1に示します。

ヒト皮膚組織スライド画像の TA-PARS および H&E データセット作成プロセス。スケールバー: 50 μm。

未染色の組織切片を次のように調製した。まず、バルク切除組織をホルマリン固定液で最長 48 時間固定しました (切除後 20 分以内)。次いで、組織を脱水し、パラフィンワックス浸透の準備をしました。このプロセス中に、組織から残留脂肪が除去されました。次に、組織をパラフィン基材に埋め込み、FFPE 組織ブロックを作成しました。厚さ約 5 μm の薄切片を FFPE 組織ブロック表面からスライスしました。薄い切片をスライドガラス上に直接固定し、スライドを 60 °C で 60 分間ベーキングすることで余分なパラフィンを除去しました。このプロセスの最後に、薄切片は TA-PARS システムで画像化する準備が整いました。すべてのイメージングはウォータールー大学の PhotoMedicine Labs で行われました。 TA-PARS データセットが収集されたら、薄い組織スライドを H&E で染色し、封入剤とカバースリップで覆い、透過モード明視野顕微鏡を使用して画像化して、対応する H&E データセットを提供しました。

TA-PARS システムアーキテクチャとイメージ形成プロセスのより詳細な説明は、36 を参照してください。実験システムを簡単に図 2 に示します。励起源は 266 nm ダイオードレーザー (Wedge XF 266、RPMC) でした。検出には 405 nm OBIS-LS レーザー (OBIS LS 405、Coherent) を使用しました。画像は、〜 400 pJ の励起パルスエネルギー、〜 0.16 mW の検出出力レベルで取得されました36。励起光源と検出光源はダイクロイックミラー (図 2: DM) を介して結合され、NA 0.42 UV 対物レンズ (図 2: OL) でサンプル上に共焦点合わせされ、最大空間分解能約 350 nm が得られます36。サンプルから戻った検出光 (光学散乱と非放射緩和を含む) はサーキュレーター (図 2: Circ.) にファイバー結合され、サーキュレーターは反射光をフォトダイオード (図 2: PD) にリダイレクトします。ナノ秒スケールの光音響強度変調が捕捉されました。同時に、放射緩和が色的に分離され、フォトダイオードを使用して捕捉されました。

簡素化された TA-PARS システムアーキテクチャとシステムセットアップ。コンポーネントのラベルは次のとおりです: ダイクロイックミラー (DM)、可変ビームエキスパンダー (VBE)、コリメーター (Col.)、サーキュレーター (Circ.)、スペクトルフィルター (SF)、コンデンサーレンズ (Cond.)、フォトダイオード (PD)、10 :90スプリッター(90:10)、ミラー(M)、対物レンズ(OL)。

TA-PARS画像形成は次のように行われる。画像を形成するには、対物レンズを固定したまま機械ステージを使用してサンプルをスキャンします。ステージの速度は、250 nm のピクセルサイズが得られるように調整されました。 50 kHz のパルス励起源を使用して組織を励起し、光散乱、放射緩和、および非放射緩和による誘導信号が各パルスで収集されました。各イベントは、その信号に対応するチャネルに配置されました。このような信号は、ピクセル値となる単一の特徴を抽出することによって圧縮されました。したがって、画像は一度に 1 ピクセルずつ収集されるため、総画像化速度は主に励起レーザーの繰り返し速度によって決まります。ここで使用される 50 kHz の励起により、メガピクセルあたり約 25 秒のイメージング速度が実現します。その後、ステージからの対応する位置信号に基づいて、計算されたピクセル値をデカルトグリッドに当てはめることによって、各 TA-PARS チャネルの最終画像が再構成されます。次に、画像は目的のタスクに従って処理されました。次のサブセクションでは、仮想染色タスクのための画像の処理について説明します。

本作ではPix2Pix GAN model39を採用しました。このモデルでは、入力データ (TA-PARS) とグラウンドトゥルース (H&E) の間のピクセル間の対応が必要です。目的は、2 つのデータドメイン間の統計的変換を学習することです。 TA-PARS 画像と H&E 画像は異なる技術を使用して取得されたため、同じサンプルの画像は同時登録されませんでした。したがって、TA-PARS 画像と H&E 画像のほぼ同時位置合わせされたペアを生成するには、視野のマッチングや位置合わせなどの前処理が必要でした。仮想染色フレームワークを図 3 に示します。

仮想染色フレームワーク。 TA-PARS 画像と H&E 画像のペアが同時に登録されてトレーニングデータセットが作成され、それが Pix2Pix39 モデルのトレーニングに使用されます。次に、目に見えない TA-PARS 画像が仮想染色用のトレーニング済みモデルに入力され、H&E のような視覚化が生成されます。スケールバー: 50 μm。

登録プロセスは次のように説明できます。まず、2 つの画像ドメインの対応する視野 (FOV) がスライド画像全体から抽出され、1 対 1 の位置合わせプロセスの準備としてピクセルサイズの点で大まかに一致しました。登録には、MATLAB Image Processing Toolbox からコントロールポイント登録ツールをデプロイしました。 TA-PARS 画像は参照画像として選択され、H&E は登録される画像として選択されました。制御点は手動で選択され、全体的および局所的な歪みを最小限に抑えるために 2 回目のパスで微調整されました。その後、アルゴリズムは 2 つの画像間に非剛体幾何学的変換 40 を適用し、それを H&E 画像に適用して、相互に位置合わせされた TA-PARS 画像と H&E 画像を取得します。すべての TA-PARS チャネルは本質的に登録されているため、登録プロセス全体は非放射チャネルのみを使用して適用されました。

登録プロセスが完了すると、データセットは色付けのためのネットワークトレーニングの準備が整いました。この研究では、3 つの TA-PARS チャネルすべてがモデルのトレーニングに使用されました。図 4 は、ネットワークの入力と出力を示しています。非放射および放射吸収および光散乱チャネルをそれぞれ図4a〜cに示します。マルチチャンネル入力は、3 つのチャンネルを連結したものとして図 4d に示されています。色付けの例を図 4e に示し、対応する H&E グランドトゥルースを図 4f に示します。非放射吸収チャネルはヘマトキシリンコントラストを表す強い核コントラストを特徴とし、放射吸収コントラストは組織の形態学的情報を示すエオシンコントラストを示すことが明らかです。正規化された TA-PARS 画像は、すべてのピクセル値の上位 1% と下位 1% を飽和させることによってコントラストストレッチを受け、その後、カラーマップとグレースケールグラウンドトゥルースイメージのヒストグラム分布に一致するように色が反転されます。コンセプト検証のために、同様の方法でいくつかのデータセットが準備されました。

カラー化ネットワークは、人間の皮膚組織スライドの画像を入力および出力します。 (a) TA-PARS 顕微鏡を使用して撮影された TA-PARS の非放射吸収コントラスト画像。 (b) 同じ顕微鏡を使用した同じ組織の TA-PARS 放射吸収コントラスト。 (c) TA-PARS 光学散乱コントラスト。 (d) 3 つのチャネルすべての TA-PARS イメージ (カラー化されるネットワーク入力)。 (e) Pix2Pix モデルを使用したカラー化された TA-PARS 画像。 (f) 明視野顕微鏡で撮影した同じ領域の組織学的に染色された組織。仮想染色フレームワークのグラウンドトゥルース。スケールバー: 100 μm。

このフレームワークは、組織学的染色プロセスを置き換えることを目的としています。このプロセスでは、Pix2Pix モデルがマルチチャネル TA-PARS 画像を入力として、対応する H&E 画像をラベルとして使用してトレーニングされ、ネットワークが 2 つのドメイン間の統計的変換関数を学習するようにトレーニングされました。。モデルがトレーニングされると、仮想染色プロセスに数秒かかり、4000 × 6500 ピクセル (約 1.6 mm2) の画像の仮想染色バージョンが生成されます。

Pix2Pix 画像間変換モデル 39 を適用して、ラベルフリー TA-PARS 画像を、対応する H&E 組織化学染色サンプルと一致する仮想染色画像に変換しました。このモデルは GAN アーキテクチャ、より具体的には条件付き GAN (cGAN)41 に基づいており、生成モデルは入力データに基づいてさらに条件付けされます。

Pix2Pix のモデルトレーニングアルゴリズムは、図 5 に示すように、ジェネレーターとディスクリミネーターという 2 つの別個のニューラルネットワークを同時にトレーニングします。トレーニングアルゴリズムは、ネットワーク出力とグランドトゥルースの間の損失関数を最小化することを学習します。弁別器ネットワークは、実際の画像と合成的に生成された画像を効果的に区別するようにトレーニングされますが、生成器ネットワークは、グラウンドトゥルースデータによりよく似た画像を生成するように同時にトレーニングされるため、弁別器が正しく区別することが徐々に難しくなります。その結果、このモデルは、組織学的に染色された画像と同等の診断品質の仮想的に染色された TA-PARS 画像を生成することができます。

Pix2Pix トレーニングアルゴリズムの図。 Pix2Pix は、ディスクリミネーターとジェネレーターという 2 つのサブネットワークで構成されています。識別子サブネットワークは、実際の H&E と合成的に生成された H&E を区別するようにトレーニングされています。同時に、ジェネレーターのサブネットワークは、本物の H&E のように見える画像を生成することで、ディスクリミネーターを混乱させるようにトレーニングされます。

標準 Pix2Pix モデルのトレーニングは、3 チャネル RGB カラー画像を使用して実行されました。提案されたアプローチでは、3 つのチャネルがそれぞれ非放射吸収コントラスト、放射吸収コントラスト、および光学散乱に置き換えられました。このようにして、モデルは 3 つの利用可能な情報ソースから補完的な情報を同時に学習できます。

256 × 256 ピクセルの重複するパッチが TA-PARS および H&E 画像から抽出され、トレーニングセットと検証セットが生成されました。実験では、およそ 15,000 のトレーニングパッチと 6,000 の検証パッチが使用されました。エポックの最大数は 500 に設定され、ジェネレーターの損失が改善しなくなったときにトレーニングを終了する早期停止基準が設定されました。次に、トレーニングされたモデルがテスト画像に適用され、テスト画像も 256 × 256 ピクセルの重複するパッチに再分割されました。通常、最終的なステッチ画像の隣接するパッチの境界で目に見えるアーティファクトを回避するには、約 50% のオーバーラップで十分です。色付けアルゴリズムは Python バージョン 3.8.10 で実装され、モデルトレーニングは CUDA バージョン 11 をサポートする PyTorch バージョン 1.9.1 を使用して実装されました。

生成された TA-PARS の 9 枚の代表的な画像と AI で色付けされた人間の皮膚が、評価のために 4 人の認定皮膚病理学者に配布されました。この技術に関して利益相反や金銭的関係を持った皮膚病理学者は一人もいませんでした。各病理医は、すべての画像が診断を可能にするのに十分な品質であること、およびコントラスト、解像度、色付けの品質が臨床診断を可能にするのに十分な H&E のようなものであることを確認しました。

私たちは、TA-PARS で画像化された未染色のヒト皮膚組織切片に機械学習フレームワークを適用しました。これらの結果は、まったく同じ組織を H&E で染色した後に取得された明視野顕微鏡画像と比較されました。したがって、これらの画像は、TA-PARS と対応する H&E 画像の間で 1 対 1 の核間の一致を提供します。限られたデータセットを前提として、私たちの最初のステップは概念実証を実行し、オーバーフィッティングによってモデルのパフォーマンスを括ることでした。過学習の場合、モデルのトレーニングとテストに同じデータが使用されました。これは、それぞれ 256 × 256 ピクセルの 5000 のパッチに分割された 1 つの画像を使用して実行されました。この実験のカラー化結果は、視覚的にはグラウンドトゥルース画像とほとんど区別がつかず (図 6 を参照)、モデルのパフォーマンスに上限を設定しています。モデルを一般化する場合、トレーニングセットがターゲットドメインの変動性を十分にカバーしていれば、トレーニングデータセットに含まれていないデータ (目に見えないデータ) を使用しても、同等の結果を現実的に達成できます。

ヒト皮膚組織スライドの TA-PARS 画像の仮想染色。ここでは、モデルのトレーニングとテストに同じ画像が使用され、モデルのパフォーマンスの上限が設定されました。スケールバー: 100 μm。

過学習データ処理を通じてカラー化プロセスの最初の概念化を検討した後、次のステップは一般化です。したがって、モデルの汎化パフォーマンスを評価するために実験を拡張しました。実験では、およそ 15,000 のトレーニングパッチと 6,000 の検証パッチが使用されました。このモデルは、同じラベルのない組織切片から取得された未確認の TA-PARS 画像のみでテストされました。この場合も、結果は、TA-PARS 仮想染色と H&E グラウンドトゥルースの間の視覚的な強い一致を示しており、さまざまな組織構造の色付けは、H&E 染色組織サンプルで通常見られるものと似ています。具体的には、図 7 に示す組織で注目すべきは核です。多くの悪性腫瘍では、個々の核の形態と分布が病気の進行と重症度を示す可能性があります。したがって、核構造を正確に表現することは、仮想染色技術にとって最も重要です。図7に示されているように、色付けされたTA-PARSと真のH&Eの間では、核の形状とサイズの再現が非常に正確です。図 7a の強調されたセクションを評価すると、H&E と仮想染色の間で核構造が非常に類似しているため、類似性はさらに明らかです。

目に見えないデータを使用した、人間の皮膚組織のさまざまな部分の仮想染色結果。 (a) 結合組織の拡大画像。スケールバーは25μm。 (b) 高密度で不規則な結合組織の画像。スケールバーは100μm。 (i) 生の TA-PARS。 (ii) H&E のような TA-PARS。 (iii) 真の H&E。画像セット (a) および (b) は、H&E と仮想染色の間で、特に核構造の高度な視覚的一致を示しています。

視覚的な一致に加えて、構造類似性指数測定 (SSIM)42 と二乗平均平方根誤差 (RMSE) という 2 つの統計指標が比較に使用されました。カラー化されたグラウンドトゥルース画像は、知覚的に相関した色空間で画像を表すために、SSIM および RMSE の計算の前に Lab 色空間に変換されました。 RMSE は、画像間の直接比較を提供し、仮想染色と H&E の間の真の違いを捕捉するために選択されました。 SSIM は、人間の視覚システムを模倣し、絶対的な誤差ではなく、コントラストと輝度の変化だけでなく構造情報の知覚変化を測定するため、指標として選択されました42。この指標 (SSIM) は、組織病理学の主観的な評価の性質により特に興味深いものです 43。統計メトリックは、サイズ 256 × 256 ピクセルの 1000 個のパッチに適用されました。計算された平均 SSIM は 0.91 ± 0.02 で、平均 RMSE は 14.28 ± 1.61 と測定され、H&E 様 TA-PARS と真の H&E の間の客観的な構造的および量的一致が示されました。

追加のより大きな皮膚組織切片を評価すると (図 8)、TA-PARS の診断特徴と H&E 画像の間でさらに比較を行うことができます。これらの画像は、主に結合組織と血管を含む人間の皮膚組織の真皮を捉えています。生の TA-PARS データを直接観察すると (図 8-i)、核構造は濃い青/紫で識別でき、結合組織は黄色とオレンジの色合いで見られます。最後に、微小血管系が赤色ではっきりと見えます。血管構造や核などの特定の詳細は、H&E (図 8-iii) や仮想染色画像 (図 8-i) と比較して、生の TA-PARS 入力 (図 8-i) の方が識別および評価しやすい場合があります。 8-ii)。病理学者が診断と組織学的分析を行うために必要なすべての診断情報は、生の TA-PARS 画像に存在する可能性があります。ただし、TA-PARS の症状は、ゴールドスタンダードの H&E 画像とは大幅に異なって色付けされています。ここでは、3 つの TA-PARS コントラスト (非放射および放射吸収コントラスト、および光学散乱) が、結合画像 (GAN ネットワークに提供されるのと同じ形式) を形成する赤、緑、青のカラーチャネルとして直接表示されます。現在の病理学者は、主に H&E イメージングに基づいた広範なトレーニングとパターン認識スキルを備えています。したがって、病理学者が生の TA-PARS 画像のさまざまな色を解釈するには、かなりの再トレーニングが必要になります。以前、これらの TA-PARS 視覚化をカラーマッピングして H&E のような視覚化を開発できることが示されました 36。ただし、この技術はさまざまな組織に簡単に一般化できない場合があります。これは、提案された AI カラー化技術の動機となり、TA-PARS 画像を臨床的に受け入れられる形式に変換することで臨床的に受け入れられる可能性があります。

人間の皮膚組織の目に見えないデータを使用した仮想染色結果の別のセット。画像セット (a) と (b) は、結合組織や血管などの真皮のさまざまな部分を示しています。 (i) 生の TA-PARS。 (ii) H&E のような TA-PARS。 (iii) 真の H&E。スケールバーは100μm。

TA-PARS 仮想 H&E を使用すると、コラーゲンが豊富な皮下結合組織と核構造の両方が高品質とコントラストで表現され、ゴールドスタンダードイメージングに実質的に匹敵します。さらに、4 人の独立した皮膚病理学者が画像を評価し、色付け、コントラスト、解像度が臨床診断に十分であり、H&E イメージングと主観的に同等であることを確認しました。これらの TA-PARS 画像は染色されていない組織標本から直接生成されたものであるため、これは心強い結論です。さらに、これは、皮膚組織の異なるスライド全体を H&E 染色で着色するために一般化できる堅牢なモデルが開発されたことを裏付けています。このモデルは、画像の明るさの違いなど、異なる標本間に存在する撮像条件の変化に対応できることが証明されています。

今後、追加の組織タイプが TA-PARS で調査される可能性があります。さまざまな組織タイプを仮想的に染色するには、GAN ネットワークの特定の調整が必要な場合があります。各組織タイプ (乳房、脳、皮膚など) は、特定の固有の H&E 色相を示す場合があります。したがって、皮膚組織に対して最適化された現在のモデルは、他の組織に対しては完璧ではない可能性があります。 H&E のような優れた視覚化が提供される可能性がありますが、他の種類の組織に適用すると一部の色合いが異なる場合があります。現在の組織病理学ワークフローでは組織タイプが異なると若干異なる扱いを受けることが多いため、これは現在の臨床実践と一致しています44。染色方法は通常、組織の種類に基づいて「その場で」調整されます。これらの変更は、原稿で強調されている H&E 染色の変動の主な原因です。したがって、最適な色付けを行うために、病理学者は色付けの前に組織の種類 (皮膚、脳、乳房など) を提供する必要がある場合があります。今後の研究は、脳や乳房などの他の個々の組織タイプやさまざまな染色に対するいくつかの色付けモデルの開発に焦点を当てていく予定です。

現在の研究は、同じ組織からの H&E と 1 対 1 で対応するために組織切片に限定されていますが、TA-PARS 顕微鏡では新たに切除された組織の高解像度画像も提供されます 36。ヘマトキシリンとエオシンのコントラストを直接捕捉することで、同等の新鮮組織の着色が可能になる可能性があります。近い将来、TA-PARS 仮想 H&E を従来の視覚化と検証および比較することを目的とした正式な臨床研究が実施される予定です。この検証が完了して色付けの精度が証明されると、提案されたシステムはバルク切除組織標本に直接使用できるようになります。バルク組織に移行する場合、TA-PARS イメージングには、標準的な H&E に比べて他の潜在的な利点が得られます。診断までの時間が大幅に短縮されることに加えて、この技術を新鮮な組織に適用すると、失活からの時間、失活から固定までの時間、固定の時間、組織からの距離に応じた固定の変動など、多くの分析前の変数が削除されます。表面および染色のばらつき。

これにより、組織処理におけるオペレータに依存する変動性が排除され、組織学評価の一貫性が向上する可能性があります。ただし、バルク切除組織で TA-PARS を直接検証することはさらなる課題となる可能性があることに注意する必要があります。バルク切除組織に対して組織学的分析を実行するための、広く受け入れられている技術はありません。したがって、TA-PARS ラベルフリー画像を検証するために直接比較にアクセスすることは困難な場合があります。計画されているアプローチは、TA-PARS を使用してバルク組織標本を画像化し、標準的な病理組織学的ワークフローを通じてこれらの標本を処理することです。これにより、大まかに比較可能な TA-PARS の仮想および従来の H&E 視覚化が提供されます。 TA-PARS 仮想 H&E 画像と対応する従来の H&E 画像の診断詳細は、盲検検証研究を通じて比較されます。 PARS と H&E では視覚化が異なる場合がありますが、FFPE 調製により組織構造と化学的性質が変化するため、各標本からの診断は同一であるはずです。したがって、このアプローチは、TA-PARS 画像と現在のゴールドスタンダード法との間の 1 対 1 の診断比較を容易にする可能性があります。理想的には、大量の未処理の切除組織標本内でのこの直接検証が臨床採用への道を開く可能性があります。

要約すると、ラベルフリー TA-PARS 画像の H&E のような仮想染色のためのフレームワークが開発されました。提案された方法は、3 つの TA-PARS チャネル (放射吸収、非放射吸収、散乱) すべてから直接キャプチャされた情報を活用し、組織サンプルの H&E のような視覚化を首尾よく生成する堅牢なモデルを提供します。マルチモーダルデータをモデルにフィードすると、単一モードでは提供されない大量のデータが提供されます。これにより、全体的なカラー化の品質が大幅に向上する可能性があります。具体的には、この方法は組織の特徴の推測を回避し、診断的に正確な色付けを実現することを目的としています。提案された方法を人間の皮膚組織の薄切片に適用すると、仮想染色とゴールドスタンダードの組織学的染色の間で高度な一致が得られます。 TA-PARS のカラー化画像を検討した皮膚病理学者は、全員一致でこれらの結果の診断上の妥当性を確認しました。 4 人の独立した病理学者は、色付け、解像度、コントラストが H&E の代用として許容できると示しました。これを臨床現場に適用すると、染色されていない組織の画像化が可能になり、H&E のような視覚化が直接生成される可能性があります。このような技術は、組織化学的染色プロセス内のオペレーターの依存性を排除することで、組織学的イメージング時間を短縮すると同時に、染色のばらつきを減らすことができます。今後は、さまざまな組織タイプやさまざまな染色の種類についてさらに調査が行われる予定です。私たちは、このアプローチが組織の迅速なラベルフリーの組織学的イメージングへの道を開くことを想定しています。これは、診断と断端評価のための術中顕微鏡への重要なステップです。

この原稿の調査結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者である PHR から入手できます。

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著者らは、ヒトの皮膚組織サンプルを提供してくださったアルバータ州エドモントンの Cross-Cancer Institute に感謝したいと思います。著者らはまた、TA-PARS 画像の専門家による病理学的レビューについて、Gilbert Bigras 博士、Marie Abi Daoud 博士、Charlene Hunter 博士、Karen Naert 博士に感謝します。著者らは、このプロジェクト中に使用された資金について以下の資金提供者に感謝します。カナダ自然科学工学研究評議会 (DGECR-2019-00143、RGPIN2019-06134); カナダイノベーション財団 (JELF #38000); Mitacs Accelerate (IT13594); ウォータールー大学のスタートアップ資金。生物工学およびバイオテクノロジーセンター (CBB シードファンド); イルミソニックス株式会社 (SRA #083181); 研究資金の新たなフロンティア – 探査 (NFRFE-2019-01012)。

PhotoMedicine Labs、システムデザインエンジニアリング、ウォータールー大学、オンタリオ州ウォータールー、N2L 3G1、カナダ

マリアン・ボクトール、ベンジャミン・R・エクレストン、ヴラド・ペカール、パルシン・ハジ・レザ

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ベンジャミン・R・エクレストン & ヴラド・ペカール

Cross Cancer Institute、腫瘍学部、アルバータ大学、116 St and 85 Ave、エドモントン、AB、T6G 2V1、カナダ

ディーパック・ディナカラン & ジョン・R・マッキー

システム設計工学、ウォータールー大学、オンタリオ州ウォータールー、N2L 3G1、カナダ

ポール・フィーガス

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MB はフレームワークを実装し、実験を実行し、図を準備し、主要な原稿を書きました。 BRE は TA-PARS 画像を収集し、原稿の執筆を支援しました。 VP は実験の計画と結果の準備を支援しました。 DD と JRM は、組織標本の準備と収集に取り組み、結果に関する臨床フィードバックを提供し、結果の評価における臨床相談を実施しました。 PF は実験の計画を支援し、原稿執筆の相談に応じました。 PHR は主任研究者としてプロジェクトを指揮、組織し、原稿執筆を行いました。著者全員が原稿をレビューしました。

パルシン・ハジ・レザへの通信。

著者の BRE、VP、DD、JRM、および PHR は、PhotoMedicine Labs に資金を提供している IllumiSonics に金銭的利害関係を持っています。著者の MB と PF は利益相反がないことを宣言します。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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Boktor, M.、Ecclestone, BR、Pekar, V. 他ラベルフリー全吸収光音響リモートセンシング (TA-PARS) の仮想組織染色。 Sci Rep 12、10296 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-14042-y

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受信日: 2022 年 3 月 28 日

受理日: 2022 年 5 月 31 日

公開日: 2022 年 6 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14042-y

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