光学顕微鏡でラベルなしで生命を観察する

Communications Biology volume 6、記事番号: 559 (2023) この記事を引用

6252 アクセス

15 オルトメトリック

メトリクスの詳細

今日の光学顕微鏡は、速度、品質、生物標本の観察可能スペースの限界を押し広げ、今日の生命の見方に革命をもたらしました。さらに、画像化のためのサンプルの特定の標識により、生命がどのように機能するかについての洞察が得られました。これにより、ラベルベースの顕微鏡法が主流のライフサイエンス研究に浸透し、統合されるようになりました。しかし、ラベルフリー顕微鏡の使用はほとんど制限されており、その結果、バイオアプリケーションのテストは行われていますが、バイオインテグレーションのテストは行われていません。バイオインテグレーションを可能にするためには、そのような顕微鏡が生物学的疑問に独自に答え、長期的な成長見通しを確立するための適時性を評価する必要があります。この記事では、主要なラベルフリー光学顕微鏡を紹介し、生体サンプルの平衡分析のためのライフサイエンス研究における統合的な可能性について説明します。

歴史的に、光学顕微鏡は生命科学と並行して進歩してきました。現在、標準的な生物学研究施設には、明視野モードで形態を画像化し、目的の標識構造を観察するための落射蛍光モードで分子分布を画像化するための顕微鏡が装備されています。ほとんどの研究はそのようなシステムで実行できるか、システムに適応できるように設計されているため、このセットアップは生物学者のスイートスポットです。分子の定量化と正確な光学的切片作成の必要性により、レーザー走査型共焦点顕微鏡法が生物学者の間で人気を博しました。 3D での厚いサンプルの高速ライブイメージングに対する関心の高まりは、多光子 1、2、3、4、5、6 やライトシート顕微鏡 7、8、9 などのイメージングツールの開発へのタイムリーなフィードバックとして機能しています。細胞の動的変化を観察する必要性により、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）10、11、蛍光寿命イメージング顕微鏡法（FLIM）12、13、光退色後の蛍光回復（FRAP）14、15などの蛍光ベースの方法が奨励されました。微細な細部を観察することの重要性は、構造化照明 (SIM)16,17、誘導放出除去 (STED)18,19、および単一分子局在化 (SMLM)20,21,22 顕微鏡などの超解像手法の動機付けとなりました。より高速なカメラ、高スループットの適応型オートメーション、革新的な色素などのサポートシステムにより、バイオ用途がさらに大幅に広がりました。それでもなお、ラベルベースの方法には限界があり、ラベルや関連する化学物質を一切介さずに生物学的サンプルを化学的に乱されずに評価するという点でギャップが存在します。

多くのよく知られたラベルフリーイメージング手法は、その利点にもかかわらず、目的が機構研究や知識発見である場合には制限されます。たとえば、明視野顕微鏡、位相コントラスト顕微鏡、微分干渉コントラスト (DIC) 顕微鏡は、生物学者にとって一般的な選択肢です。明視野顕微鏡法は、サンプルがコントラストを与える色素で染色されている場合に最適です。ただし、生きた研究の場合、ほぼ透明な生きた細胞の高コントラスト画像を取得することは困難です。位相コントラストと DIC イメージングは、サンプルと背景の差を光学的に強調して高コントラストの画像を生成し、蛍光顕微鏡で日常的に使用されます。位相コントラストと DIC イメージングはどちらも生物学者にとって非常に役立つツールです。しかし、強度値は位相情報に非線形に関係しており、サンプル内の実際の変化を追跡することができないため、位相変化を定量化することはできません。

現在、ラベルフリーイメージングの進歩により、形態、ダイナミクス、機能性、物質交換、病原体相互作用、生化学、生体力学の高解像度かつ高速イメージングが可能になりました（図1）。この記事では、さまざまなラベルフリー光学顕微鏡の幅広い選択肢、その生物学的用途、および主流の生物医学研究の強力なツールに成長する可能性について説明します。したがって、この記事は、確立された方法を強化し、最終的には知識発見においてより統合的な役割を果たすために、適切なラベルフリー光学顕微鏡ツールを選択する根拠を確立することを目的としています。

この図は、細胞および組織の構造的、生体力学的、および生化学的属性を機能の尺度として評価するための、利用可能なラベルフリー光学顕微鏡の適用可能性を示しています。 QPM定量的位相イメージング、AF自家蛍光顕微鏡、SHG第二高調波発生顕微鏡、FTIR FTIR顕微分光法、ラマンラマン顕微分光法、BMブリルアン顕微鏡、OCE光コヒーレンスエラストグラフィー、OCT光コヒーレンストモグラフィー、D-OCTドップラーOCT、PAM光音響顕微鏡。

ラベルフリーの位相画像を定量化する必要性により、生命科学研究ではほとんど活用されていない定量的位相イメージング法が開発されました。定量位相顕微鏡 (QPM) は、サンプルによって引き起こされる光路遅延 (または位相変化) を測定することを目的としています。 QPM はラベルフリーであるため、化学毒性や蛍光顕微鏡における光退色などの外部要因による信号損失のないライブイメージングが可能です。今日のいくつかの QPM 手法は、サンプルを通過する光波の重ね合わせによって形成される複雑なインターフェログラムとして画像を確立した、187323 年のエルンストアッベによる初期の画像形成理論に基づいて構築されています。

QPM は、時の試練に耐えるために、情報の忠実性と生物学的知識の価値を評価する必要があります。 QPM の最も重要な側面は、ノイズを処理して定量化可能性を確立することです。これは、システムの空間的および時間的位相感度によって決まります。ノイズ軽減は、ディフューザー、白色光照明、画質を向上させる低時間コヒーレンス光源の使用など、さまざまな方法で実現されます。スキャン動作によるノイズを低減するために、非スキャン技術であるフルフィールド QPM が登場しました。フルフィールド QPM は、2 つの平面 (サンプルとリファレンス) からの光の干渉を使用して、サンプルによってもたらされる光路遅延に関する情報を提供します。干渉幾何学形状によって、システムが位相シフト QPM のような高い空間分解能を持つか、それとも軸外 QPM24 の高い時間分解能を持つかが決まります。さらに、強度輸送法のような非干渉法 QPM は、特殊な干渉幾何学を使用せずに位相情報を取得しますが、焦点が合っている画像とわずかに焦点が合っていない画像の 2 つの強度画像のみを取得します25。この方法は、非常に特殊なシステムを必要とせずに簡単に実装できますが、低解像度のイメージングを目的としています。フーリエ位相顕微鏡 (FPM)26、デジタルホログラフィック顕微鏡 (DHM)27、回折位相顕微鏡 (DPM)28、光回折断層撮影 (ODT)29、空間光干渉顕微鏡 (SLIM)30、広視野デジタル干渉法 ( WFDI)31 は、長年にわたって開発されてきた著名な QPM テクノロジーの一部です。現在の QPM の焦点は、技術開発から実用化に移りつつあります。現在、QPM テクノロジーは、発生生物学 32、神経科学 33、34、35、微生物学 36、病理学 37、癌 38、遺伝病 31、免疫学 39、薬理学 39、創傷治癒 36、代謝障害 40 への応用を実証しています。ただし、メソッドの普遍的な魅力を確保するには、メソッドの生物学的分野への適用可能性をパラメータ化する必要があります。

大まかに言うと、QPM は細胞の形態、ダイナミズム、および体積情報を測定します。位相シフト値を使用して形態学的特徴を測定し、成長、生存率、外部刺激への反応、または病理を判断できます。ただし、定量化された位相値は高さと屈折率と組み合わされます。したがって、2 つのどちらかを決定することが重要な場合は、それらを正しく切り離す必要があります。デカップリングは、体積や細胞質量などの追加パラメータの測定を可能にするため、実際に重要です。デカップリング方法の 1 つは、2 つの異なる屈折率媒体を連続的に使用し、位相遅延を測定することです41。他の方法には、断層撮影イメージングを実現する複数の照明角度の使用や、高分散媒体での 2 つの波長の使用が含まれます。 QPM とチャネルチップ (ミリ/マイクロ流体チャネル) を組み合わせると、細胞内浸透圧、細胞体積の変化、高分子濃度、衝撃刺激応答、細胞内の分子輸送の時間的フラックスを測定できます41。さらに、時間分解 QPM データは、分散関係位相分光法 (DPS) による粒子拡散の測定に使用されています 42。この技術は、固定角度でのサンプルからの散乱信号による強度変動に基づいて粒子流量を決定し、輸送特性 (アクティブ/パッシブ) を予測します。

位相はまた、ガラス表面上の細胞接着を画像化するために革新的に使用され、干渉反射顕微鏡 (IRM) と呼ばれる方法による全内部反射顕微鏡 (TIRF) のラベルフリーの類似物として機能します 43, 44。この方法は、位相差に基づいて画像コントラストを生成します。ガラスによる反射光とガラスに非常に近いセル領域との間の距離。したがって、ガラスに最も近いセル表面は、サンプル表面とガラスの反射光との間の弱め合う干渉により最も暗く見えます。この方法は細胞表面や微小管を高コントラストでイメージングするために使用されますが 45、非常に薄い領域に限定されています。さらに、IRM と蛍光顕微鏡を組み合わせると、免疫細胞が関与する動的な研究に機能的に関連することが示されています 46。これは、免疫学的に活性なカバーガラス上のT細胞の接触点を追跡することによって達成され、その結果、蛍光で見えるカルシウムレベルと相関して細胞の接触点を視覚化することができます。

これまで説明したイメージング方法による位相測定は、薄いサンプル、またはカバーガラスに近い領域を対象としています。これは、イメージングフィールドの範囲が限られているか、サンプルの焦点の合っていない部位から発生する強い散乱信号によって圧倒されるためです。

組織、器官、動物のより深い部分を画像化することは、光学顕微鏡の一般的な課題です。 3D 環境は生物学的機能にとって重要であるため、生命を 3D で画像化することが重要です。初期胚段階や線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ幼虫などの小動物は、光学的に密度が高くないため、顕微鏡観察に非常に適しています。人間や哺乳類のプロセスをより小さな長さのスケールで画像化するという初期のニーズは、利用可能な光学的手法に簡単に挑戦できる 3D 培養、スフェロイド、人工組織、およびオルガノイドに大きな関心を向けました。分解能が犠牲になる可能性がある場合は、より長い光の波長を使用してサンプルのより深い領域にアクセスできます。 QPM に先行する干渉法ベースの断層撮影技術の 1 つは、光コヒーレンストモグラフィー (OCT) であり、最大 3 ～ 5 mm の深さまで画像化するために 5 ～ 15 μm の空間分解能を示します。これは、眼科、皮膚科、がん研究、歯科、消化器科、心臓病学における OCT の臨床統合47に役立ちました。偏光感受性 OCT48、OCT 血管造影 49、ドップラー OCT50、OCT エラストグラフィ 51 などの OCT の改良により、細胞外マトリックス、血流、組織の硬さの機能イメージングが可能になりました。ただし、OCT は他のラベルフリー手法と同様に、ノイズやアーチファクトの影響を受けます。安定化光学コンポーネントを使用して高度に散乱した光を除去し、フーリエ領域による高速イメージングにより、OCT の感度が向上しました。ただし、特に深部組織領域の定量化は光の減衰の影響を受けます。これを解決するには、がんの進行 52 と創傷治癒 53 を決定する際の OCT 画像の定量化可能性を高めるために、減衰補正方法が役立ちます。 OCT はサンプルの奥深くまで到達しますが、生物学的な疑問の宝庫が潜むサブミクロンのスケールを実現することはできません。

深さと解像度のバランスは、厚いサンプルのラベルフリー 3D イメージングの重要な側面です。長い間、QPM は、複数の散乱光の処理が不十分で細部が失われ、画質が低下したため、厚いサンプルのイメージングではうまくいきませんでした。しかし、傾斜光干渉顕微鏡 (GLIM)32,54 を使用すると、断面の視覚化を可能にする断層像を作成できるため、サンプル内の数百ミクロンの位相定量化が可能です。 GLIM は、胚の生存率の測定、3D 培養、人工組織、オルガノイド、生体 (C. エレガンスやゼブラフィッシュなど) の生理学的研究において、すべての先行製品を上回っています。 GLIM は、焦点外の散乱信号を抑制することでサンプルを光学的に切片化できるという点で、ラベルフリーの共焦点顕微鏡の類似品です。したがって、GLIM の解像度は光の回折限界によってのみ制限されます。

生体サンプルは光の位相だけでなく偏光も変化させる可能性があります。したがって、偏光顕微鏡 (PLM) は、位相顕微鏡を補完するものとして登場しました。 PLM は、位相差顕微鏡では明確に識別することが難しい、コラーゲン 55、アクチン 56、微小管 57、有糸分裂紡錘体 58 などの繊維状タンパク質のような光学異方性構造を画像化するために使用されます。 PLM は、生体サンプルの前後にある 2 つの偏光フィルターを通過する光によって機能します。理想的には、最初のフィルターからの光は 2 番目のフィルターを通過できません。しかし、サンプル内の異方性により、一部の光が 2 番目のフィルターを通過できるように光の方向が決まり、サンプル内に存在するこれらの異方性構造の視覚化が可能になります。さらに、定量化の必要性により、リターダンスや配向などの特徴を測定するための定量的 PLM (qPLM) の出現が促進されました 59,60。密度とリターダンスの両方を測定する位相顕微鏡と偏光顕微鏡の相補性により、2 つのラベルフリー法の組み合わせが促進されました 61、62、63。位相と偏光の組み合わせイメージングの高スループットなバリエーションは、位相と偏光を使用した定量的ラベルフリーイメージング (QLIPP) を開発するための計算学習手法を統合することによって作成されます64。

細胞から細胞内スケールまでの定量的位相イメージングには、回折限界が許容する解像度よりも高い解像度が必要です。これは、再構成前に画像化されている構造のより詳細な部分をカプセル化する複雑な散乱場に関する情報を革新的に抽出することによって実現できます。 1 つの方法は、照明またはサンプルを他方に対して回転させ、本質的にサンプルの複数の視点を取得することです。次に、複数の 2D 画像がアルゴリズムを使用して再構成され、3D 断層像が取得されます。これにより、QPM の横方向解像度が 2 倍以上向上します 34,65。 2π-DHM – DHM に基づく特殊な方法 – は、360° 照明、405 nm 青色レーザー UV、および 2 つの高開口数 (NA) 油対物レンズを使用して目標を達成します34。収集対物レンズは、0 ～ 360° のさまざまな角度でサンプルを通過する光を取得し、より角度の高い視点をキャプチャして、最大 70 nm の空間解像度の画像を生成します。

もう 1 つの高コントラストのラベルフリー超解像度イメージング方法は、回転コヒーレント散乱 (ROCS) 顕微鏡です 66。 ROCS は、細胞足、バイオフィラメント、ウイルス様ナノ粒子などの小さくて速い構造 (150 nm) を画像化できます。高速回転する青色レーザーがサンプル上に 360° の照明を生成します。散乱光は数ミリ秒以内に収集され、高速に取得されます。 100 nm の粒子をラベルフリーで高速にイメージングできるため、生細胞とウイルスの動的な相互作用を理解できるようになりました。

顕微鏡検査では、高い空間分解能とともに、特定の生物学的研究において同時に高速イメージングを達成することも重要です。したがって、ナノメートル単位の空間分解能とマイクロ秒単位の時間分解能を必要とする、ウイルスと宿主のライブ相互作用の捕捉には適しています。これは、コヒーレント明視野顕微鏡法 (COBRI)67 や干渉散乱顕微鏡法 (iSCAT)68、69、70 などのラベルフリーの方法で実現されます。 COBRI は、空間的および時間的にコヒーレントなレーザー光照明を使用することにより、標準的な明視野顕微鏡を改良したものです。これは、数ナノメートルの空間分解能と 10 μs の時間分解能に相当します。一方、iSCAT は、干渉法 70 を使用して感度を高め、ウイルスなどのナノ粒子から散乱した光を利用します。蛍光出力は蛍光分子と光退色によって制限されますが、ラベルフリー領域では、入射光を増やすだけで光散乱による光子出力を増やすことができます（入射光の一定の割合が散乱されるため）。出力が高くなると、同じ情報を収集するのに必要な時間が短縮され、高速イメージングが可能になります。しかし、光子強度を単純に増加させると、光毒性に加えて、重大なバックグラウンド散乱が導入され、超高感度検出の目的が無効になります。ここで、干渉散乱の検出が重要になります。iSCAT では、ナノ粒子からの散乱光とガラス/水の界面からの反射光の両方が、高 NA 対物レンズによって厳密に焦点を絞った後に収集されます。この方法は、必要なコントラストを生み出すために散乱光と反射光の差が非常に大きいため、より小さい粒子 (<50 nm) に最適です。これらの方法に加えて、今日ではウイルス追跡に代替ラベルフリー方法がますます使用されています 70,71。

位相顕微鏡はサンプルによって変化する入射光に依存していますが、生体物質には光センサーで検出できる分子が豊富に含まれています。たとえば、光音響顕微鏡 (PAM) はヘモグロビンなどの色素を検出します。 PAM はレーザーパルスでターゲットを励起し、その結果生じる色素の熱膨張により機械波が放出され、超音波検出器で検出されます。超音波検出により、PAM は最大 1 ～ 3 mm の深さまで画像化できます。横方向の分解能は、光がサンプルにどれだけうまく集束するかによって決まり、PAM を光学的に分解したもの (分解能 0.2 ～ 1 μm、最大 1 mm) または音響的に分解したもの (分解能 2 ～ 15 μm、最大 2 ～ 3 mm) の変動として分類します。 PAM の横方向の解像度は、革新的な超解像手法により 90 nm まで向上しました 72,73。 PAM は血液微小血管系の研究に使用され、創傷評価 74,75、新血管形成 76、糖尿病性足部潰瘍 77、血管新生 78 などの臨床応用が行われています。

発色団のほかに、私たちの体には自家蛍光分子が蔓延しています。自己蛍光は、蛍光標識された分子を妨害するため、イメージングにおいてしばしば迷惑となります。しかし、自己蛍光は、上皮間葉移行79やがん幹細胞性80などの重要な病態生理学的プロセスを解明するために使用されます。細胞の自己蛍光イメージングでは、NADH や FADH などの代謝分子は細胞のエネルギー課税を反映しており、増殖、成長、分化において変化する可能性があります。一方、組織では、細胞外マトリックス (ECM) には、組織の機械的完全性を示すコラーゲンとエラスチンがあり、リモデリング、線維化、および癌の際に影響を受けます。さらに、自己蛍光は、細胞内のクロマチン状態を画像化するためのナノ構造を可視化するための超解像顕微鏡法にも利用され81、また癌組織における組織病理学的検出にも利用できる82。分子特異性の欠点により、分子特異性は疾患分類の目的に限定されてきました。厳密な励起および発光フィルターの使用、追加のアッセイ、構造ベンチマーク、サンプル知識などの戦略を組み込んで、メソッドの実用性、忠実度、および定量化を可能にすることができます。

コラーゲンやエラスチンなどの ECM 原線維は自己蛍光を発しますが、密度が高く、検証するのが困難です。第 2 高調波発生イメージング (SHG) は、生体サンプル内のフィブリル構造を検出するラベルフリーのもう 1 つの方法であり、ECM の自己蛍光を補完することができます。 ECM に加えて、SHG は細胞内のアクトミオシン複合体と微小管を画像化できます。したがって、病気の可能性を評価するのに価値があります83。 SHG は、光変調を使用してサンプル内のフィブリル状などの特定のナノ/マイクロ構造情報を引き出す例を示しています。 SHG の主な利点は、吸収ではなく光の偏光を利用するため、光毒性と光退色が軽減されることです。さらに、近赤外光を使用するため、数百ミクロンまでの厚いサンプルの画像化にも使用できます。さらに、SHG イメージングは原線維構造に特有であり、高い構造感度を提供します。 SHG は構造的感度と特異性により、膠原病、線維症、心臓および筋骨格系の状態、癌などのいくつかの臨床応用に応用可能です 83,84,85。さらに、いくつかの超解像法 5,86,87 により、SHG では少なくとも 2 倍の改善が達成されており、線維密度と構造の説明を正確に定量化できます。技術的な観点から見ると、二光子顕微鏡ベースは、非線形顕微鏡を使用した自己蛍光 3,88,89,90 および SHG イメージング 83,84,85,86,91,92,93,94 における最近の開発の多くを推進してきました。

機能変化の検出は、生物学的メカニズムを理解するために不可欠です。したがって、生化学的アッセイ、分子ブロット、および分光法は、サンプルの全体的な機能特性評価のためのツールとなります。生体サンプルの空間的不均一性が大きいため、重要な展開が平均化されてしまうことが多く、生物学的経路の欠落部分の理解が妨げられます。したがって、サンプル領域を機能的に画像化する必要性により、化学染色法が推進され、その後の顕微鏡評価が生物学者や病理学者に大いに役立ちました95、96、97。これらの方法は、死、損傷、組織化、増殖などの機能状態を段階的に分類するのに使用されますが、染色手順における主観性のため、定量化するのが難しいことがよくあります。さらに、詳細は光学顕微鏡の空間分解能に限定されるため、すでに現れている変化、または進行の比較的進んだ段階にある変化を特定することになります。一部の蛍光標識は、条件に依存した蛍光活性化を通じて化学情報を提供することもできます98,99が、いくつかの生物学的機能にのみ限定されます。

病気の早期発症を理解するには、超解像を含む従来の光学顕微鏡の能力をはるかに超えた初期の化学官能基変化（100～200 pmの長さスケール）を特定する必要があります（図2）。フーリエ変換赤外 (FTIR) 分光法 100 やラマン分光法 101 などの光学分光法における進歩は、化学結合や官能基の変化に関する情報を提供することでこの空白を埋めています。典型的なスペクトルには、特定の化学種にそれぞれ対応するいくつかのピークが含まれています。高さ、幅、位置/シフトは、化学種の濃度、多様性、結合長/結合エネルギーに関する重要な情報を提供します。スペクトル分解能の制限要因は、アミドバンドのようなブロードなピークを分解してタンパク質の二次構造のサブピークを明らかにするスペクトルデコンボリューションアルゴリズムを使用して処理されます102。このように、分光法はイメージングを完全に補完するものであり、これらを組み合わせることで、健康と病気における生命の謎を理解するのに役立ちます102。さらに別の制限要因は、不均一なサンプル内で空間的に一致する化学情報を特定することです。このニーズは、FTIR103 およびラマン 104、105、106 の分光顕微鏡または顕微分光法バージョンによって主に対処されています。顕微分光法は、対応する分光法と同じ原理を使用し、対物レンズがサンプルを空間的に走査する機能が追加されています。したがって、イメージングシステムのスペクトル範囲にわたるすべての波長の画像を含む画像スタックが得られます。顕微分光法は、対応する分光法と同様に、ノイズ管理、ベースライン調整の必要性、自家蛍光の軽減（ラマンの場合）、基質や水分含有量に由来する干渉信号など、同等の分光法と同じ制限を受けます。それにもかかわらず、ノイズ管理が改善され、スペクトルおよび空間分解能が向上することで、より詳細な生化学情報が抽出可能になります。

光学顕微鏡と分光法は、さまざまなスケールの組織を検出するため、発達と疾患のさまざまな段階を視覚化するのに補完的です。光学顕微鏡は超解像であっても 1 nm を超えることはできません。顕微分光法は、官能基レベルで起こる化学変化を空間分布で検出します。しかし、何千もの化学変化が発生するため、ミクロンからナノスケールで発生する明白な構造変化と相関付けるまで、特に初期の段階では、分光法を単独で使用することは困難です。これは、病気の早期発症を特徴づけるだけでなく、いくつかの生理学的および病理学的事象の基礎を理解するのに役立ちます。

顕微鏡法と顕微分光法を賢明に組み合わせて使用すると、生物学的システムの非常に初期の変化を予測できます (図 2)。長い間、顕微分光法の分解能は先進的な顕微鏡に匹敵しませんでした。これは、前者が依然として数ピクセルにわたる領域からスペクトル情報を収集しているためです。この状況は、ナノスコピーが FTIR107、108、109 とラマン 110、111、112、113 の両方の顕微分光法に導入され、他の高解像度イメージング手法とのポイントツーポイント比較のための高解像度のスペクトルおよび空間解像度を可能にしてから、数年にわたって変化しました。さらに、高速スペクトルイメージング 114 と単一分子トラッピング 115、116 の改良により、生細胞および in vivo イメージングの精度が向上しました 117。

2 光子顕微鏡による非線形光学イメージングは、自家蛍光や SHG イメージングだけでなく、タンパク質、脂肪滴、核のイメージングのためのコヒーレントアンチストークスラマン散乱 (CARS) や誘導ラマン散乱顕微鏡 (SRS) などのスペクトルイメージング手法も強化しました。酸118,119。 CARS と SRS はどちらも非線形光学イメージングであり、複数段階の励起を使用して化学種に特有のスペクトル領域から化学情報を収集します。 C-H ストレッチ領域とタンパク質フィンガープリント領域が最も広く使用されています。これらの領域がスペクトル的に混雑しているため、複数の化学種が重複し、特定の官能基からの寄与を特定することが妨げられます。ただし、特定の場合にはスペクトルデコンボリューションを使用して、多くの場合純粋な情報を復元できます120,121。

細胞表面の化学受容体と同様に、生物物理学的な力を変換して遺伝子発現を可能にし、生物学的機能を調節できる機械受容体も存在します。メカノバイオロジーは、幹細胞 122、腫瘍の進行 123、神経変性疾患 106、発生生物学 124、再生生物学 125、細胞接着、および遊走 126 で実証されています。現在、細胞や組織に関する生体力学的研究の多くは、機械感受性分子を標識し、蛍光顕微鏡でその発現と局在を観察することによって間接的に行われています。しかし、生きた細胞や組織の動的な機械的変化をラベルフリーで直接画像化することは、健康や病気の進行における動的な変化を理解するのに役立ちます。

最も一般的なメカニカルイメージングモダリティの 2 つは、原子間力顕微鏡 (AFM) と超音波エラストグラフィー (USE) です。 AFM は、表面の機械的情報を提供する非常に小さなスケール (1 nm ～数ミクロン) の物理的な力を対象としています。体を越えた浸透を伴う臓器スケールの画像を使用するため、臨床現場に適しています。しかし、長さスケールには数ミクロンから数ミリメートル（細胞と組織）の間のギャップがあり、生体力学の探求にとって大きな可能性があります。

USE の光学的類似物は、OCT の機能を進歩させた光コヒーレンスエラストグラフィー (OCE) です。 OCE は、組織の変位を測定するために接触ベースまたは非接触ベースの組織変形の外部ソースを使用します 51,127。 OCE は、不均一なサンプルの数ミリメートルの深さで機械的剛性を測定できます。これは、生体組織、3D in vitro モデル、および小動物モデルに最適です。ただし、依然として解像度が数十ミクロンという限界があります。これにより、セルラーまたはサブセルラーの解像度が保証されるアプリケーションが制限されます。

ブリルアン顕微鏡法は、ブリルアン光散乱 128 の原理に基づいて回折限界の解像度を提供し、縦弾性 129 またはせん断弾性率 130 を測定するラベルフリーの機械イメージングです。ブリルアン散乱は、光源からの光子とサンプルからのフォノン (機械的振動) の相互作用によって発生する非弾性散乱現象です。フォノンは入射光と相互作用してエネルギーを交換し、その結果、非弾性散乱光（ブリルアン散乱）が生成されます。したがって、これらのブリルアン散乱は、サンプルの機械的特性の尺度を提供します。ブリルアン顕微鏡法は、今日、高速かつ低光毒性で細胞や組織に適用されています129。細胞では、細胞骨格の修飾、細胞間相互作用または細胞マトリックス相互作用の接合部、細胞質および膜の固液体積分率から機械的変化が生じます。組織の細胞外マトリックスでは、タンパク質の配置、架橋、および密度が機械的特性に関与します。ブリルアン顕微鏡法は、いくつかの生物学的モデルや疾患で実証されています。いくつか例を挙げると、細胞生物学 131、発生生物学 132、腫瘍の転移能の推定 133、アルツハイマー病におけるプラーク沈着 104、アテローム性動脈硬化症における ECM 硬化 134 などで使用されています。ブリルアン顕微鏡を使用して弾性特性を測定する場合の制限の 1 つは、組織の密度と屈折率についての事前の知識が必要なことから生じます。さらに、この方法の信頼性は、不均一な生物学的サンプル、特に動的状態ではまったく単純ではありません。これは、機械的な関係時間と実際の生物学的イベントが発生する時間の間に不一致がある可能性があるためです。顕微鏡の時間分解能を向上させるために許容範囲は存在しますが、現時点では、その制限を考慮し、音響緩和よりも遅い速度範囲に対応できる画像構造を維持することが重要です。また、機械的変化は化学的挙動に影響を与え、またその逆も同様であるため、機械的および化学的相関イメージングは、生命過程における因果関係を明らかにする鍵となり得る104。さらに、機械的活動は多面的かつ非線形であり、剛性の単純な尺度ではないという事実を認識することは、生物学的問題に正しく対処するのに大いに役立ちます。

ラベルフリー顕微鏡は、生物学的サンプルの多くの側面において多大な可能性を秘めていますが、一部の生物学的ターゲットはラベルフリー光学顕微鏡法により適しており、生物医学研究との関連性が高く、これらをスーパーバイオターゲットと呼びます (表 1)。過去数十年にわたるラベルフリー光学顕微鏡の大幅な改良を考慮すると、速度、分解能、定量的精度、選択性、および自動分析の可能性においては、大きな改善の余地があります。

解像度: 動作中の小さな実体を観察するバイオアプリケーションにおいて、超解像顕微鏡への関心が急速に高まっています。 STORM、STED、PALM、SR-SIM135 などの蛍光ベースの超解像手法は、この需要に応えます。超解像と標識に関連する制限に対する多大な関心が、ラベルフリー光学ナノスコピーを動機付けました。現在、ラベルフリーナノスコピーの領域は、位相イメージング 34、光音響イメージング 73、自己蛍光 81、および SHG6 における生体応用が実証されており、存在しています。これらの可能性は、特異性とアーティファクトの特徴付けを解決することによる強化によってさらに恩恵を受けるでしょう。

速度: 超高速イメージングの実現は新しいものではありません。画質を損なうことなく撮像時間を短縮するには、パターン化された照明、超高速焦点合わせ、効率的な検出などの革新的な光学ハードウェアを使用することが可能です136,137。主な目的は、心臓の鼓動から細胞内の貨物輸送に至るまでのスケールで体内の素早い動きを捕捉することです。イメージングの速度は、情報の効率的な取得を犠牲にします。これには、サンプルからの信号を確実に取り込み、画質を損なうことなく効率的な方法でノイズを処理することが含まれます。

精度: イメージングの精度は、サンプルからの情報を確実に伝えるためのイメージングシステムの忠実度です。照明工学、サンプル処理、および検出システムにより、信号対雑音比が向上し、アーティファクトが減少します。しかし、多くの場合、ノイズは信号の固有の部分であり、悪用されると隠された情報が明らかになる可能性がある重要な情報を運ぶこともあります。したがって、ノイズとして知覚されるものの特徴付けは役立つ可能性があります。計算シミュレーションでは、光とサンプルの相互作用、より具体的には顕微鏡システムによって検出されると予想される信号をモデル化できます。現在の計算モデリングの課題は、このような畳み込みを解き明かして、取得ごとに利用可能な信号を増やすことに寄与するいわゆるノイズを利用し、3 つの空間軸すべてでより高速かつ正確なイメージングを実現することです。

選択性: 空間選択性は、サンプルの正確な 3D 空間をイメージングすることを意味します。精度が向上すると、他の場所からの信号を拒否しながら、より選択的な情報がもたらされます。もちろん、これはラベルフリーの光学イメージングを主流の生物学研究に統合するための鍵です。特定の成分の発生が病気のマーカーとなる医療診断では非常に重要です。選択性にはさまざまな方法でアプローチできます。最も一般的なのは、既知のベンチマークを標準と比較することです。標準の正確な要件が新しい方法に適合せず、既存の標準に適合するように作られていることがよくあります。もう 1 つの方法は、形状や質感などの固有の識別要素を見つけることです。たとえば、細胞の位相マップではミトコンドリアとアクチンフィラメントの両方が見られ、QPM を使用すると、屈折率などの尺度を使用した仮想多重化によってそれらを区別できます。自家蛍光イメージングでは、固有の手段は、特定の分子のイメージングを可能にする励起フィルターと発光フィルターだけで済みます。

自動化: 計算ツールを使用して、他の方法では区別できない構造を評価、特定、学習し、エンドユーザーに通知することができます。これは、開発中は大量のタスクになる可能性がありますが、特定の構造のこの仮想ラベル付けは、臨床スクリーニングや診断支援などのハイスループットサービスにとって長期的には有益となる可能性があります。ディープラーニングは、テストグループ間の分類などのタスクを実行するための強力なツールです。ただし、計算上の決定の基礎を理解することが重要です。現在、ナレッジマイニングや基礎的な発見の可能性を秘めた解釈可能なニューラルネットワークに取り組んでいる計算科学者にとって興味深いものです。

このように、ラベルフリーの光学顕微鏡法は、生物学的プロセスの多面的な乱れのないライブイメージングの限界を押し上げる上で長い道のりを歩んできました。しかし、持続的な問題点の 1 つは、今日の光学顕微鏡技術に存在する照明光によって引き起こされる光毒性の問題です。これは蛍光イメージングにおける大きな問題です138。ラベルフリー領域では、QPM のような広帯域照明での光毒性は比較的低い 24 が、SHG、CARS、スペクトルイメージングなどのレーザーベースのモダリティでは依然として重大です（フェムト秒レーザーパルスで最大 GW/cm2）139。光毒性は、分子から遺伝子に微細な変化をもたらし、生命の真に乱れのない画像化を制限します。光毒性は、顕微鏡の種類、波長の選択、サンプル調製、サンプルの種類などの複数の要因に依存するためです。したがって、ライブイメージングのベストプラクティスを確保するには、プロトコルとシステムを進化させる必要があります。

バイオイメージングに関して言えば、全体は部分の合計よりもはるかに優れています。ラベルフリー顕微鏡の開発の 5 つの側面 (図 3) により、より多くの隠れた詳細を捉える範囲が全体的に拡大されます。しかし、より優れた解像度、速度、視野を備えた顕微鏡は今後も登場し続けるでしょうが、それだけでは生物学の基本的な疑問に答え、それによって生物学研究に組み込まれるには十分ではない可能性があります。アプリケーションではなく統合を確実にするための戦略を講じる必要があります。いくつかのラベルフリー光学顕微鏡を組み合わせると、研究の欠落部分を補うことで相互に補完できるマルチモダリティの側面から恩恵を受けることができます。また、ラベルフリーメソッドとラベルベースメソッドの相関イメージングは、バイオ研究をさらに強化するだけでなく、ラベルフリー顕微鏡の使用のための新しいニッチ分野を生み出すこともできます。標識および蛍光顕微鏡技術は長年の実績があり、高精度および高スループットの結果をもたらす主力製品であるだけでなく、今日の生命の理解を形作るマイルストーンを生み出すことで、顕微鏡を生命科学者に近づける主な原動力でもあります。内因性タンパク質や生細胞に優しい色素などのプローブの開発により、ライブイメージングにも対応します。ただし、標識ベースの顕微鏡と標識を使用しない顕微鏡の間には相補性が存在します。双方向の相補性を理解することは、生命の謎をより深く理解することです。ラベルは、何千もの分子の海における特異性の信頼性を高めるのに役立ちます。ラベルフリー顕微鏡は生物学的特徴を全体として提供するため、情報が豊富です。したがって、このような方法を使用するとシステムの変化を観察できることが多く、仮説の策定に役立ちます。ラベルベースの手法は、特定のラベルを使用してこのような仮説を検証または無効にすることで、この情報の海から重要な出力をマイニングするのに役立ちます。したがって、生命科学研究の成果を最大化するには、2 つの顕微鏡間で連携して研究を進める必要があります。

この図は、ラベルフリー光学顕微鏡の技術的成長の可能性を示しています。中央の円はラベルフリー光学顕微鏡の現在の限界を示し、花びらはそれが成長し、最終的には生物学的イメージングのためのラベルフリー顕微鏡の範囲を拡大できるさまざまな側面を表しています。しかし、実際の成長の可能性は、標準的な生物医学ルーチンへの技術の統合に大きくかかっています。

生物学者にとってラベルフリー顕微鏡を不可欠なものにするためには、生物学者とラベルフリー顕微鏡開発者との間の架け橋として機能するアダプターツールをさらに開発する必要がある。蛍光標識におけるこのようなアダプターツールの好例は、蛍光顕微鏡による生物研究に革命的な変化をもたらした蛍光タンパク質、GFP の発見です。同様に、ラベルフリー領域では、屈折率、散乱、および吸光係数の明確なターゲットを開発するために、材料工学によって作成された校正および定量化ファントムがアダプターツールとなる可能性があります 140。ラマン、CARS、SRS などのスペクトルイメージングにおける化学結合校正用の振動タグ 141 も、化学イメージングの良い例です。定義された機械的特性を備えた組織模倣ファントム 142 により、顕微鏡エラストグラフィーが可能になります。イメージング研究と化学および材料科学の研究を統合して、ラベルフリー顕微鏡の標準化およびベンチマークツールを開発することは、これらの顕微鏡を主流にする上で長期にわたる影響を与える可能性があります。

ラベルフリーイメージングを主流の生物学研究に導入する際のもう 1 つの課題は、ライフサイエンスで価値を生み出すための積極的な取り組みの必要性です。これは、実績のある既存の技術との共通点を特定し、ラベルフリーイメージングを使用して生物学的疑問に答える革新的な方法を見つけることを意味します。 IRM や iSCAT などの多くのラベルフリー手法は、いくつかの変更を加えるだけで既存の共焦点顕微鏡セットアップに簡単に追加できます。より多くのスピンオフ企業がラベルフリーの定量位相顕微鏡を開発し、phi-optics Inc や nanolive143 顕微鏡などのユーザーフレンドリーなインターフェイスを備えた商用利用可能性を生み出しています。 SHG や CARS などの 2 光子ベースの非線形顕微鏡法は、Zeiss や Leica などの老舗顕微鏡会社で市販されています。もう 1 つのアプローチは、顕微鏡開発者と生物学的施設の間の長期的な協力で、実験現場で作業システムを確立し、相互に緊密に連携して手法と生物学的価値の両方を洗練させることです。

ラベルフリー顕微鏡の利点は、光変調、エネルギー交換、化学、力学に至るまで監視できる生物学的側面の多様性にあります。これらすべての特性は生物学的材料に固有のものであるため、外部からの摂動がない状態での情報により、今日の生物学に存在する深刻な疑問を解決できます。したがって、政策立案者、資金提供機関、投資家、業界は、バイオサイエンスを活用したラベルフリー顕微鏡の可能性を活用し、将来そのような活動を達成することに専念する大規模な労働力を動機付ける必要があります。

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この作品は、2020 年度に資金提供された FET-Open RIA プロジェクト OrganVision (id 964800) によって支援されました。図は BioRender.com で作成されました。貴重なフィードバックをくださった編集者と査読者に感謝いたします。

UiT ノルウェー北極大学 (北ノルウェー大学病院を含む) によって提供されるオープンアクセス資金。

UiT - ノルウェー北極大学、トロムソ、ノルウェー

ビスワジョイ・ゴーシュ & クリシュナ・アガルワル

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BG と KA は記事を概念化してレビューしました。 BG は論文を書き、図をデザインしました。

ビスワジョイ・ゴーシュまたはクリシュナ・アガルワルへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Marco Fritzsche と Manuel Breuer。査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Ghosh, B.、Agarwal, K. 光学顕微鏡でラベルなしで生命を観察。 Commun Biol 6、559 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04934-8

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受信日: 2023 年 2 月 21 日

受理日: 2023 年 5 月 12 日

公開日: 2023 年 5 月 25 日

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