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Nature Communications volume 14、記事番号: 48 (2023) この記事を引用

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11 オルトメトリック

メトリクスの詳細

肝癌の病理学的診断には生検が推奨される標準です。ただし、この方法では通常、切片化と染色が必要であり、組織画像を解釈するには十分な訓練を受けた病理学者が必要です。ここでは、ラマン分光法を利用してヒト肝組織サンプルを研究し、肝がんの in vitro および術中病理学的診断のためのワークフローを開発および検証します。当社では、組織メタボロミクスによって検証されている深層学習と組み合わせたラマン分光法を使用することにより、迅速、非破壊的、ラベルフリーの方法で癌組織を隣接する非腫瘍組織から区別します。この技術により、サブタイプ、分化度、腫瘍段階など、がん組織の詳細な病理学的同定が可能になります。分子組成の可視化に基づいて、未処理のヒト組織スライスのサブマイクロメートル分解能の 2D/3D ラマン画像も取得され、腫瘍境界認識や臨床病理学的診断に役立ちます。最後に、手術中のリアルタイムの術中ヒト肝がん診断のためのポータブルハンドヘルドラマンシステムの可能性を示します。

肝臓がんは、2020 年に世界で 7 番目に多いがんであり、がん関連死亡原因の第 3 位でした1。肝臓がんの新規診断症例の発生率と年齢標準化罹患率は、大幅な増加にもかかわらず、過去数十年間、世界的に増加し続けています。診断と治療の進歩2、3。

したがって、肝臓がんの治療と生存率の向上には、正確かつタイムリーな診断が不可欠です。画像検査と組み合わせた血清学的検査は、肝がんの標準的な診断方法です4。ただし、最も一般的に使用される血清学的検査であるアルファフェトプロテイン (AFP) の診断感度は約 60% です5。磁気共鳴画像法 (MRI)、コンピューター断層撮影法 (CT)、超音波検査 (US) などの画像検査は、特に肝硬変患者における肝臓がんの検出に高い感度と特異性を備えています6。しかし、このような画像検査には、空間分解能が限られている、術中診断が複雑である、および/または電離放射線にさらされるリスクが伴う7。したがって、生検は、予後および治療の指針にとって重要である病理学的診断のゴールドスタンダードとして今でも推奨されています4。

臨床では、組織病理学的観察は通常、ヘマトキシリン & エオシン (H&E) または免疫組織化学的染色で行われます。染色手順は時間がかかるため、分離された組織を使用した診断にのみ適しています。さらに、病理学専門家の数が限られているため、組織病理学の使用が制限される可能性があります6。最近、ハイスループット画像分析を使用したデジタル病理学は、組織サンプルの識別と分類において病理学者を大いに支援しています8,9。ただし、デジタルパソロジーのサンプル前処理には、従来の方法と同じ制限があります。したがって、肝臓がんをより迅速かつ非破壊的に in vitro およびさらには in vivo で調査するための技術が必要とされています。

ラマン分光法に基づくスペクトル組織病理学は、がん診断への代替アプローチを提供します10。ラマン分光法は、分子の振動による光の非弾性散乱に基づいた光学技術で、複雑な生体サンプルの化学的指紋を提供します。また、ほとんどの生体分子情報は、ラマン測定による簡単なスナップショットだけで入手できます。重要なのは、生物学的サンプルの化学構造と組成は、最小限のサンプル前処理で、汚れのない非破壊的な方法でラマン分光法によって取得できることです11、12、13、14。スペクトル情報を人工知能アルゴリズムと組み合わせて、自動診断を可能にする診断分類モデルを確立することもできます15、16、17、18。さらに、ラマン分光イメージングにより、肉眼では見えない腫瘍の縁の描写や関心のある病変領域の視覚化が可能になります19。これらの機能により、ラマン分光法は分離された組織標本の検査や外科医による腫瘍の縁の特定に役立ち、正常組織への損傷を最小限に抑えてより完全な切除が容易になります。

これまでに、脳 20、乳房 21、皮膚 22、23、結腸 24、膀胱 25 など、いくつかの生体組織の病理学的診断にラマン分光法の使用が研究されてきました。肝臓がんの場合、ラマン分光法に基づく研究は主に血液サンプルの分析に焦点を当てており、ヒト組織を対象とした研究はわずかです。

さらに、腫瘍組織の不均一性と癌浸潤の可能性により、組織から収集されるスペクトルデータのばらつきが大きくなることが知られています。したがって、データをより適切に表現するには各組織サンプルから多数のスペクトルを収集する必要がありますが、これによりデータ分析の複雑さが増大し、従来の化学測定法に課題が生じる可能性があります。深層学習のデータ駆動型の性質は、この問題の解決に非常に適しています17。深層学習は、大量のデータから隠れた特徴を直接抽出して学習することができ、生物学的および医療画像分析を含む画像認識の分野で成功裏に適用されています26、27、28。アーキテクチャの柔軟性のおかげで、ディープラーニングは、スペクトルデータなどの 1 次元の連続データの分析にも拡張されました 29,30。いくつかの報告では、1-D ラマンスペクトルデータを使用した医療診断のための深層学習について説明しています18,31。

この研究では、ラマン分光法を使用したヒト肝障害組織の探索について報告しました。我々はまず、ラマン分光法と VGG-16 ベースの畳み込みニューラルネットワーク (CNN) を組み合わせて、迅速かつ無停止かつラベルフリーの方法で肝癌組織を隣接する非腫瘍組織から区別することに成功しました。その後、サブタイプ、分化度、腫瘍段階など、肝臓がん組織のより詳細な病理学的同定が行われました。組織メタボロミクス分析により、代謝産物の同定におけるラマン分光法の信頼性が確認されました。さらに、未処理のヒト組織ブロックおよび組織切片のラマン画像をサブマイクロメートル解像度で表示することにより、分子組成を視覚化することができ、腫瘍境界の特定と臨床病理学的診断が容易になりました。最後に、リアルタイムの術中肝臓がん診断の実現可能性を調査するために、ハンドヘルドのラマン分光システムが手術中に使用されました。ラマン分光法とインテリジェントアルゴリズムに基づく肝臓組織の病理診断と術中診断のグラフィカルなワークフローを図1に示します。

肝臓組織から取得された大規模なラマンデータセットが収集され、CNN ベースの深層学習モデルに入力されて、さまざまな組織タイプのスペクトルデータを区別できるようにトレーニングされました。次に、このモデルを使用して、さまざまな病理学的タイプの肝がん組織を区別しました。さらに、ラマン結果は、液体クロマトグラフィー - 質量分析 (LC-MS) に基づく組織メタボロミクスによって検証されました。さらに、ラマン画像を使用して、未処理のヒト組織ブロックおよび組織切片の分子組成を視覚化しました。最後に、リアルタイムの術中肝がん診断のために、ハンドヘルドラマンシステムが手術中に使用されました。

ここで報告するラマン測定には 532 nm の励起波長が使用されましたが、生物学的サンプルの分析では通常、蛍光バックグラウンド信号を回避し、より深い光の透過を得るためにより長い波長が推奨されます。ただし、より長い波長（それぞれ633または785 nmなど）と比較して、より短い波長ではラマンスペクトルのデータ品質と信号対雑音比が向上しました（補足図1）。これは部分的に特定のタンパク質の共鳴増幅の結果ですおよびカロテノイド関連バンド32。

一致する肝癌組織と隣接する非腫瘍組織のラマンスペクトルを 120 人の肝臓癌患者から取得しました。詳細な患者情報は補足表 1 に記載されています。癌組織の不均一性と複雑さのため (補足図 2)、各組織サンプルの表面上のランダムに選択された点から少なくとも 50 のスペクトルが収集されました。癌組織サンプルと傍癌組織サンプルから得られた平均ラマンスペクトルの比較を図 2a に示します。ほとんどの組織サンプルから 19 個の特徴的なラマンピークが観察されました。 2 つのグループのラマンピークは大部分が重なっていましたが、傍癌組織グループの各ピークの強度は癌組織グループの強度よりも有意に高かった (スチューデントの t 検定、P < 0.05)。密接に関連するラマンピークを事前に区別するために、特徴的なラマンピークの階層的にクラスター化されたヒートマップがプロットされました（補足図3）。補足表 2 は、文献で報告されている主要なラマン振動モードのピーク位置と対応する代表的な化合物を示しています 33。

a – d 120 個の癌腫および 120 個の傍癌組織サンプル (a)、HCC および ICC 患者の癌組織サンプル (b)、さまざまな腫瘍段階の HCC 組織サンプル (c)、およびさまざまながんを伴う HCC 組織サンプルの平均ラマンスペクトル細胞分化グレード (d)。影付きの領域は平均の標準偏差を表します。 e および f この研究で検査された 120 サンプルからの傍癌組織 (左) および肝臓癌組織サンプル (右) (e) の典型的な写真と、H&E 染色された組織の対応する画像 (f)。 g マイクロラマン分光計を使用した肝臓組織のラマン検査。 h VGG-16 ベースの深層学習モデルのアーキテクチャ。 12,000 のスペクトルで構成されるラマンデータが、64 のフィルターを備えた最初の畳み込み層に入力されました。各畳み込み層のカーネルサイズは 3 で、ReLU 活性化層と接続されています。ドロップアウト層は、基本ブロックに従って完全な接続層で利用されました。データ長を削減するために、ブロック間に最大プーリング (サイズ 2、ストライド 2) が採用されました。各ブロックの下の数字は、それぞれ出力の長さとチャンネル数を表します。 i, j CNN の反復トレーニングにおけるクロスエントロピー損失 (i) と精度 (j)。クロスエントロピーは、予測値と真の値の間の平均二乗誤差を表します。 k CNN アルゴリズムに基づいて 4 つの組織カテゴリを分類するための二値混同行列 (パーセント (%))。 l ROC 曲線と対応する AUC 値。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

ピークのほとんどは、芳香族アミノ酸、タンパク質、カロテノイドに起因すると考えられます。具体的には、約 749、1212、1393、1547、1586、および 1602 cm-1 のピークは、それぞれトリプトファン、チロシン、またはフェニルアラニンに関連しています。 1637 cm-1 のバンドは、アミド I バンドの C = O 伸縮に対応します。 1003、1156、および1519 cm-1のラマン線は、カロテノイドのC-CおよびC-Nストレッチを表しています。 1003 cm-1 のピークは、肝細胞癌 (HCC) のバイオマーカーである AFP と関連していることも報告されています 34。さらに、1081、1130、および 1304 cm-1 に現れるラマン特徴は主に脂質または脂肪酸に関連しています。 674、974、1336、および 1356 cm-1 のバンドは核酸に割り当てることができます。さらに、835 cm-1 付近のラマンシグネチャは糖類に関連しています。傍癌組織と癌組織との間のラマンスペクトルのこのような違いは、発癌によって引き起こされる肝臓組織の生化学成分の変化を反映しており、癌組織と正常組織を区別するための基礎となります。

次に、ラマン分光法に基づく肝臓癌の組織病理学的区別をさらに調査しました。原発性肝がんは世界中で最も一般的ながんの 1 つであり、そのうち 75 ～ 85% が肝細胞がん (HCC)、10 ～ 15% が肝内胆管がん (ICC) です35。図2bに示すように、HCCグループとICCグループの間のラマンシグナル強度の主な違いは、カロテノイド関連ラマンピーク（1003、1156、および1519cm-1）にあり、ICCグループの方が著しく高かった。対照的に、ほとんどのアミノ酸、脂質、および核酸関連のピーク（それぞれ 749、974、1304、1356、1393、および 1586 cm-1 など）は、HCC グループの方が高かった。さらに、腫瘍の病期と分化の程度を正確に判断することは、治療戦略の選択と予後評価に役立つ可能性があります。図2cに示すように、初期段階と進行段階の間の主なスペクトルの違いは、1003、1156、1519cm-1（カロテノイド）、1130cm-1（脂肪酸）、749および1547cm-1（トリプトファン）で見つかりました。このピークは初期段階のグループでより高い強度を示しましたが、674 および 974 cm-1 の核酸に関連するピークと 835 cm-1 の糖に関連するピークは進行段階のグループでより高かったです。さらに、補足図4は、癌の分化のさまざまなカテゴリーのラマンスペクトルを示しています。中程度に分化したグループと低分化グループ間の全体的なスペクトルの違いは、高分化グループと中程度に分化したグループのそれよりも有意でした。がん群と準がん群の違いと同様に、高分化群および中程度に分化した群も、特にカロテノイド関連ピークにおいて、より高い全体的なスペクトル強度を示しました（図2d）。各組織ブロックの病理学的タイプは、ラマン試験後の H&E 染色に基づいて病理学者によって再確認されました（図 2e-g）。

ラマンスペクトルを使用してさまざまな種類の肝臓組織を分類するために、VGG-16 ネットワークベースの CNN モデルが採用されました。モデルアーキテクチャは、13の1次元畳み込み層、5つのプーリング層、および3つの全結合層（図2hに示すように）で構成され、大規模な畳み込みカーネルではなく小規模な畳み込みカーネルスタッキングを利用して、必要なパラメータを削減しました。計算36。肝臓組織ラマンデータベースは組織サンプルあたり 50 のスペクトルで確立され、合計 12,000 のスペクトルが 120 対の肝臓組織サンプルから得られました。スペクトルデータは 500 ～ 2000 cm-1 の範囲で、889 個の 1 次元浮動小数点データでした。肝癌組織と傍癌組織を分類するために二値分類モデルが構築され、それぞれ 1 と 0 と指定されました。スペクトルデータは、ベースラインの減算と平滑化によって前処理され、ランダムシャッフルによって CNN モデルに供給されました。ソフトマックス関数は出力層の活性化関数として使用され、より高い値が予測クラスとみなされる 2 つのクラスの確率を出力します。

精度とクロスエントロピー損失は、CNN モデルのパフォーマンスと信頼性を評価するためによく使用される 2 つの指標です。学習の反復により、検証セットの精度とクロスエントロピー損失曲線は徐々に収束する傾向があり、モデルが過剰適合ではないことを示しています（図2i、j）。その結果、癌組織面積の推定精度は92.6%、感度は90.8%、特異度は94.6%であった。

さらに、HCC 組織と ICC 組織、および異なるがんの段階と分化グレードを持つ組織間を区別するために、他の 3 つの CNN モデルが確立されました。 4 つのバイナリモデルのパフォーマンスを図 2k の混同行列に示します。腫瘍の不均一性は、腫瘍組織のさまざまな段階と分化グレードの識別に課題をもたらし、精度はそれぞれ 78.3% と 72.3% でした。しかし、肝臓がんのサブタイプである HCC および ICC の分類では、より良い結果が得られ、識別精度は 82.4% でした。分類器の性能を定量的に検証するために、4 つの受信者動作特性 (ROC) 曲線がプロットされました (図 2l)。曲線下面積 (AUC) 値は 0.783 ～ 0.965 でした。さらに、PLS-DA、ランダムフォレスト、XGBoostなどの他の一般的な機械学習アルゴリズムと比較して、深層学習アプローチは、特に不均衡なデータの処理において、さまざまな病理学的タイプの組織識別においてより高い精度で優れた計算パフォーマンスを示します（補足表3））。

この研究では、単一の血清学的バイオマーカー (AFP など) に基づく従来の HCC 診断では感度が低かったことは注目に値します。 200 ng / mlのAFP閾値では、92人のHCC患者のうち25人が陽性であり、感度はわずか27.2％であり（補足図5）、ラマン測定に基づく私たちの方法よりもはるかに低かった。さらに、CT や MRI などの画像診断法は、HCC のさまざまな病理学的状態を特定または予測するための第一選択の診断方法として推奨されています 37,38。例えば、HCC の臨床病期分類は主に、HCC 結節の数やサイズ、血管浸潤の存在などの画像特性に基づいて診断されます。ここで、ラマンスペクトルは、84人の患者に基づいて67％の精度と0.694のAUC値で微小血管浸潤を決定する実現可能性も示しています（補足図6）。サンプル数とスペクトル収集をさらに増やすと、結果が改善される可能性があります。要約すると、精度の点で、ラマン分光法は、現在の研究でさまざまな病理タイプを特定する点で従来の画像診断法（CT、MRI、USなど）と同等かそれよりも優れており（補足表4）、既存の画像診断法を強力に補完します。病理診断技術。

肝臓がん組織の生化学的組成の変化をさらに確認するために、液体クロマトグラフィー - 質量分析法 (LC-MS) に基づく非ターゲットメタボロミクス戦略が採用されました。組織メタボロミクスは、代謝特性に基づく疾患の病因の研究に広く使用されており 39,40 、標的部位の代謝変化に関する直接情報を提供し、関連する腫瘍バイオマーカーを明らかにすることができます。この研究では、合計 25 対の一致する HCC 組織と隣接する非腫瘍組織が評価されました。 1995 イオンと 2228 イオンは、偏差と欠損値を除去した後、それぞれ正および負のエレクトロスプレーイオン化源 (ESI+ および ESI-) モードで保持されました (補足データ 1)。合計で、ESI+ モードで 57 個の代謝物、ESI- モードで 51 個の代謝物が特定され、差次的代謝物の候補として選択されました (補足データ 2)。 9 種類の一次代謝産物と、HCC 組織と隣接する非腫瘍組織間の 108 の特定の代謝バイオマーカーの階層的にクラスター化されたヒートマップ間の差異を図 3a および b にプロットしました。ほとんどの代謝産物は HCC 組織内で減少傾向を示し、これは HCC 組織内のラマン強度が低いことと一致しています。

a HCC 組織サンプルと対応する隣接する非腫瘍組織サンプルの間の 9 種類の異なる代謝産物の相対存在量の分布 (非腫瘍組織の相対存在量の中央値に対する比率として)。 i ～ ix は、チロシン (i)、非芳香族アミノ酸 (ii)、脂肪酸 (iii)、PUFA でタグ付けされた PC (iv)、SFA および MUFA でタグ付けされた PC (v)、カルニチン (vi)、ヌクレオシドの代謝物を表します。 (vii)、塩基およびその誘導体 (viii)、および糖類 (ix)。 b ユークリッド距離に基づいた、HCC 組織と隣接する非腫瘍組織間の 108 個の有意に異なる代謝物の階層的にクラスター化されたヒートマップ。ブロックは代謝産物の相対的な発現レベルに従って色付けされました。紫は発現が高いことを示します。薄いオレンジ色は発現が低いことを示します。 c HCC組織と隣接する非腫瘍組織との間の芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン）の含有量の差異。傍癌群ではチロシンの有意な増加が観察され (両側スチューデント t 検定、P < 0.05)、より高いレベルのトリプトファンとフェニルアラニンも観察されましたが、変化は有意ではありませんでした (両側スチューデント t 検定) 、Ｐ＞０．０５）。箱ひげ図には、平均値、中央値、下位/上位四分位が表示されます。ひげは内側のフェンスを示しています。 d HCC組織と隣接組織間で有意な差がある、代表的なホスファチジルコリン(i)、ヌクレオシド、塩基、および糖類(ii)の含有量。データは平均値±SDとして表示されます。 HCC 組織、n = 25、隣接組織、n = 25。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

たとえば、HCC組織ではチロシンの有意な下方制御が観察されましたが、他の2つの芳香族アミノ酸（ArAA）であるフェニルアラニンとトリプトファンには大きな変化はありませんでした（図3a（i）および図3c）。しかし、HCC組織ではドーパ、3-ヒドロキシアントラニル酸、アニリンなどの他の芳香族化合物の減少が見つかり、肝臓組織からのベンゼン環関連ラマンバンドの変化もArAA誘導体や他の芳香族代謝物に由来する可能性があることが示唆されました。さらに、β-アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタチオン、スレオニンなどのほとんどの非芳香族AAもHCC組織で減少することがわかりました（図3a（ii））。しかし、HCC 群ではアルギニンが増加しましたが、これはアルギニン分解酵素アルギナーゼ I (ARG1) の抑制に起因すると考えられ、アルギニンは腫瘍増殖を促進することも報告されています 41。

肝臓は、脂質と脂肪酸の主要な合成部位です。肝細胞の損傷は肝機能を損ない、脂質代謝機能障害を引き起こす可能性があります42。たとえば、エイコサジエン酸とネルボン酸を除いて、ほとんどの脂肪酸、特に多価不飽和脂肪酸（PUFA）は、HCC組織において下方制御されています（図3a（iii））。さらに、ホスファチジルコリン (PC) は細胞膜の重要な成分であり、活性酸素種によって酸化される可能性があります 43。この研究では、PUFA でタグ付けされた PC のレベルが HCC グループで大幅に減少しました (図 3a(iv))。これは、がん組織における高い酸化ストレスの存在下での PUFA の酸化に起因すると考えられ、その結果、飽和脂肪酸（SFA）または一価不飽和脂肪酸（MUFA）でタグ付けされたPCのさらなる増加（図3a(v)および図3d(i)）。さらに、長鎖アシルカルニチンの増加と、プロピオニルカルニチンやヘキサノイルカルニチンなどの短鎖または中鎖アシルカルニチンの減少が観察されました（図3a(vi)）。

肝細胞は、通常、ヌクレオチド代謝に関与する重要な役割を果たします。いくつかのヌクレオシド、塩基および関連代謝産物の障害も観察されました（図3a（vii-viii））。これらは主にプリン代謝に関連していました。 DNA および RNA 合成に関与するプリン代謝物は、細胞の生存と増殖の促進に重要です44。イノシンを除いて、キサンチン、ヒポキサンチン、キサントシン、デオキシイノシン、ウリジン、尿酸、アデニンを含むほとんどのプリン代謝産物は、HCC グループで下方制御を示しました（図 3d(ii)）。これは、関連物質の活性の低下に起因すると考えられます。代謝酵素45．

d-リボース、d-セドヘプツロース、d-グルクロン酸、d-タガトース、スクロースなどのほとんどの糖類および関連代謝産物は、HCC組織で大幅に下方制御されました（図3a（ix）およびd（ii））。しかし、以前に報告されているように、HCC グループでは解糖代謝物グルコース 6-リン酸の高レベルが観察され、フマル酸やコハク酸などのトリカルボン酸回路 (TCA) 代謝物は下方制御されていました。これらのエネルギー関連代謝産物の変化は、がん細胞における好気性解糖の増加による急速なグルコース消費を示唆しており、これはヴァールブルグ効果によるものである可能性があります47。

さらに、グルタチオン、5'-メチルチオアデノシン、3,4,5-トリメトキシ桂皮酸、オキソアジピン酸、2-オキソアルギニンなど、肝がんのバイオマーカーとなる可能性のあるいくつかの代謝産物がHCC組織で大幅に増加していることが観察されました。スクリーニング（図3bおよび補足データ2）。上記の代謝産物の違いをより直観的に比較するために、それぞれの隣接組織に対するHCCサンプルの相対的な変化表現を補足図7に示します。さらに、メタボロミクスの予測力も、HCC組織を区別するためのスペクトル分析に使用されるCNNモデルによって調査されました。隣接する非腫瘍組織から。精度は 70% ～ 80% とスペクトル解析結果に比べて低くなりますが、サンプル数を増やすことで精度が向上する可能性があります。

腫瘍組織の不均一性と患者間の差異のため、組織サンプル間のラマンデータの差異は避けられず（補足図2）、これは異なる組織の全体的な識別にとって困難です。ただし、同じ患者から採取した肝臓がんと隣接する非腫瘍組織のペアでは、ほとんどのサンプルでラマン強度の違いが容易に観察されました。したがって、ここで説明するラベルフリースペクトル技術には、癌の辺縁を視覚化し、術中の腫瘍の描写を容易にする適切な画像解析アルゴリズムを組み込むことができることを提案します。

これをテストするために、ラマンスキャン用に 2 つの肝臓がん組織ブロックが選択されました。図4aおよびbに示すように、2つの肝臓がんブロックと対応するH＆E染色画像は、肝髄の配置が乱れ、細胞密度と核/細胞質比が増加した肝細胞がん化の存在を確認しました。肝臓癌組織のマッピングテスト領域の明視野画像を図4cに示します。 LiveTrack テクノロジーを使用してサンプルの高さを継続的に調整し、サンプルの焦点を維持しました。ラマン測定中に表面高さデータが記録され、2つの組織サンプルの三次元（3D）表面プロファイル画像が図4cに示されており、最大高さの差はそれぞれ38.2μmと27.4μmです。ラマン画像は、自己モデリング曲線解像度 (SMCR) および階層クラスター分析 (HCA) アルゴリズムを使用して分析されました。 SMCR メソッドは、未知のラマンマッピングデータセットを純粋な成分のスペクトルに分解し、濃度画像と純粋なスペクトルを同時に生成できます (「方法」セクションで説明したとおり)。 SMCR法に基づいて高品質の画像が得られました（図4d）。最初の組織サンプルでは癌領域の明確な境界が見られ、癌腫領域と肝実質領域が異なる擬似色で示されるようにうまく区別されました。ラマンイメージングでは腫瘍境界は滑らかではありませんでした（図4dおよびe、上部パネル）。これはおそらく、腫瘍カプセルが薄く、ミクロンスケールのスキャン間隔（2μm）でのイメージング領域（50×50μm）が小さいためです。 2番目の組織は、表示された領域で癌の境界が比較的貧弱であり（図4dおよびe、下のパネル）、肝臓実質と混ざり合っており、これはおそらく癌性浸潤の存在によるものであり、明視野画像ではほとんど検出できませんでした。これらの癌性病変は、H&E 染色によって確認されました (図 4b)。 HCA は、より抽象的な方法でスペクトルのセットを同様のスペクトルを持つクラスターに結合するためにここで使用されるもう 1 つの化学測定法です。 HCA から得られた画像の結果 (図 4e) は、SMCR で処理された画像 (図 4d) と一致しており、画像処理アルゴリズムの信頼性を示しています。

a 選択された 2 つの肝がんブロックの写真。矢印はラマンイメージング領域の位置を示しています。 b 2 つの肝臓組織の局所 H&E 染色画像と下の行の白いボックスは、おおよそのラマンイメージング領域です。 c マッピングテスト領域の明視野画像（50×50μm）（左）と、2つのサンプルのLiveTrackテクノロジーを使用して構築された対応する3D表面プロファイル画像（右）。 d、e SMCR 由来 (d)、および HCA 由来 (e) のラマン画像は、肝臓組織サンプルの癌の辺縁を示しています。 f (d) に示されているポイント 1 ～ 8 から収集された典型的なスペクトル。ポイント 1、2、5、および 6 は、推定上の傍癌領域または非腫瘍領域に由来し、3、4、7、および 8 は、推定上の癌領域に由来します。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

異なる肝臓組織表面領域におけるスペクトルの変化をさらに実証するために、図4dの矢印でマークされたいくつかの位置からスペクトルを収集しました（図4f）。ポイント 1、2、5、および 6 は、推定傍癌領域および非腫瘍領域から収集され、両方の組織ブロックにおいて推定癌領域 (ポイント 3、4、7、および 8) から収集されたものよりも高いラマン強度を示しました。このラマン署名の違いは、画像アルゴリズム認識の基礎を提供し、ラマン技術を使用した高精度の腫瘍辺縁検出という我々の当初の期待を裏付けます。さらに、低倍率の対物レンズを使用したり、強力な画像アルゴリズムの助けを借りてスキャン間隔を増やしたりすることで、より大きなラマン画像を取得することもできます（補足図8）。

ラマン分光法の臨床病理学的および診断能力を検証するために、マイクロラマン分光計を使用して、厚さ 5 μm の未染色のヒト肝組織切片を画像化しました。まず、2000〜3400 cm−1の範囲で元のスペクトルを取得しました（図5a）。組織スペクトルには、タンパク質の CH3 伸縮に関連する 2930 cm-1 の顕著なピークが含まれていました 48。さらに、2855、2885、および3007 cm-1で脂質に関連するいくつかの特徴的なラマンピークが検出されました。これらは、脂質の対称CH2振動、飽和直線長アシル鎖におけるCH2のフェルミ共鳴または非対称振動、および不飽和アシル鎖におけるCH2の非対称振動に起因すると考えられます。 =CH はアシル鎖にそれぞれ伸びます49。 StreamHR モードでのラマン画像取得は、未染色の肝がんおよび隣接組織切片に対して 2 軸方向の解像度 0.8 μm で実行されました。組織の主な化学成分の空間分布マップを再構築するために、ラマンマッピングデータに対して多変量解析が実行されました。純粋なタンパク質と脂質のラマンスペクトルも SMCR アルゴリズムによって解析されました (図 5a)。 SMCRによって再構築された正常肝組織内のタンパク質と脂質の濃度マップをそれぞれ図5bとcに示します。それらの相対的な空間分布をよりよく理解するために、両方のカラーオーバーレイ画像を図5dに示します。

2000〜3400 cm−1の範囲の肝臓組織スライスの典型的なラマンスペクトル（紫線）。純粋なタンパク質 (青色の線) と脂質 (黄色の線) のラマンスペクトルも SMCR アルゴリズムによって分解されます。 2930 cm-1 (矢印 3) のラマンピークはタンパク質に関連しており、2855 cm-1 (矢印 1)、2885 cm-1 (矢印 2)、および 3007 cm-1 (矢印 4) 付近のピークはタンパク質に特徴的です。脂質。 b – d SMCRによって再構築された正常肝組織内の脂質（b）およびタンパク質（c）の濃度マップ。 d は 2 つのオーバーレイです。 2 つの画像を結合するために、黄色 (脂質) の最小 LUT 値が調整されました。 e – i マッピングテスト領域の明視野画像、対応するH&E染色、SMCR由来ラマン画像、および正常肝組織の対応する3D表面プロファイル画像（e）。 f〜iは、癌化（f）、脂肪性肝炎（g）、線維症（h）、結合組織（i）などの典型的な形態を持つ他の組織領域を示しています。すべてのスケールバーは 10 μm です。

次に、典型的な正常な肝実質（図5e）と癌領域（図5f）のラマン画像を比較しました。タンパク質と脂質のオーバーレイラマン画像と、テスト領域の対応する3D表面プロファイル画像、明視野画像、H&E染色画像を図5eとfに示します。 SMCR アルゴリズムから導出された画像は、疑似カラーで明確な細胞内構造を示し、脂質とタンパク質の濃度の変化を明らかにしました。正常な肝組織では、タンパク質は核領域で高濃度に存在し、脂質は主に肝細胞の周辺領域に分布していました。がん細胞では、タンパク質は主に細胞膜近くに分布し、細胞内にはほとんど分布しません。生化学成分の空間分布におけるこのような違いは、通常、H&E 染色画像では識別することが困難であることは注目に値します。さらに、肝細胞の不規則な配置や核/細胞質比の増加など、がん細胞の形質転換中の典型的な変化もラマン画像で観察され、明視野およびH&E染色と一致しました。平面イメージングに加えて、化学組成に関する情報と組織表面のトポグラフィーを組み合わせた 3D 表面プロファイル画像も取得されました。

正常組織と癌組織に加えて、脂肪性肝炎、線維性組織、結合組織などの典型的な形態を持つ他のいくつかの組織領域でもラマンスキャンが実行されました（図5g–i）。これらのラマン画像は、脂肪滴やフィラメント繊維などの細胞や組織のさまざまな形態学的特徴を示し、対応する明視野画像や染色画像と一致していました。組織切片中のタンパク質と脂質の個々の SMCR 再構成濃度マップをすべて補足図 9 に示します。組織表面の 2 次元（2D）組織化学イメージングに加えて、3 次元の「Z スタック」画像も生成しました。ラマン分光法による。補足図10は、図5の5つの組織スライスの再構成された3D画像を示しています。画像は、各平面が50μm×3μmをカバーする6つのZスライススタック（5μmスライス）から再構成され、より豊富な組織化学的深さが得られました。組織サンプルの情報。この研究では、532 nmレーザー下の共焦点ラマン分光法による肝臓組織の最大検出深さは約200μmでした（補足図11）。より深い組織の検出については、空間オフセットラマン分光法（SORS）の統合を適用して、センチメートルレベルの深さ検出を達成することができます50。

in vitro で肝組織の診断とイメージングにおけるラマン分光法の性能を検証した後、リアルタイムの術中肝がん診断の実現可能性をさらに調査しました。肝臓癌を検出するために、特注のハンドヘルドポータブルラマン分光法システムが術中に使用されました。このシステムは、785 nm のファイバー結合レーザー、ハンドヘルドプローブ、およびファイバー分光計で構成されていました (詳細は「方法」セクションで説明します)。分光計は取得ソフトウェアを備えたパーソナルコンピュータに接続され、標的組織の分子内容に関する情報を出力しました。操作中、プローブは使い捨ての滅菌保護カバーでも覆われていましたが、測定されたラマンスペクトルにほとんど影響を与えませんでした（補足図12）。

図 6 は、in vivo 術中測定から得られた肝臓組織の平均ラマンスペクトルを示しています。プローブを組織表面上に保持して、癌腫および隣接する非腫瘍領域内のランダムに選択されたいくつかの点でラマン信号を測定しました。非腫瘍領域の総ラマンスペクトル強度は、腫瘍領域の総ラマンスペクトル強度よりも有意に高かった。これは、インビトロ試験の結果と一致していますが、ポータブルラマン分光計とマイクロラマン分光計によって収集された組織スペクトルには違いがあります（補足図13）。腫瘍領域と非腫瘍領域間の主なスペクトルの違いは、640、976、1024、1540、および1635cm-1のタンパク質関連ピーク、413、775、1314、1381、および1436cm-1の脂質関連ピークにあります。 1、および 689、1094、および 1514 cm-1 の核酸に関連するピーク。より多くの術中スペクトルデータが取得されるにつれて、これらのスペクトルの違いを適切なアルゴリズムと組み合わせることで、手術中に腫瘍領域と肝実質領域を区別するのに役立ち、さらに術中のラマンマッピング技術により腫瘍境界の視覚化が可能になる可能性があります。

癌および傍癌組織の in vivo 術中測定の平均ラマンスペクトルが 6 人の患者から収集されました。スペクトルは、785 nm NIR レーザーとコンピューター化された CCD 分光計を備えた手持ち式ポータブルラマン分光計システムによって収集されました。影付きの領域は平均値の標準偏差を表します。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

ラマン分光法は、固有の分子振動信号に基づいた迅速な検出と高い化学的特異性を可能にするため、肝がんの組織病理学的診断のための多用途ツールとなる可能性があります。具体的には、肝臓がんのスペクトルは、隣接する非腫瘍組織から収集されたスペクトルよりも全体的な強度が弱く、さまざまな病理学的組織で異なるラマンパターンも観察されました。これは、肝臓がんの進行における生化学代謝の複雑さを反映しています51。 HCC 組織と隣接組織間のこれらの生化学成分の違いを確認するために、LC-MS に基づいてメタボロミクス分析が実行されました。その結果、ほとんどのアミノ酸、脂質、核酸など、ほとんどの代謝産物が HCC 組織で減少傾向を示していることが明らかになりました。 SFA または MUFA のタグが付けられた PC が増加しました。この結果はラマン分析の結果と一致しており、ラマノミクス 52 としても知られるラマンベースのメタボロミクスが、従来のメタボロミクスと同様に包括的で信頼性の高い生物学的情報をもたらし、追加の消耗品を必要とせずに、さまざまな病理学的組織をより便利かつコスト効率よく識別できることが実証されました。

さらに、VGG-16 ベースの CNN モデルが構築され、肝癌組織と隣接する非腫瘍組織から収集されたラマンスペクトルの区別や、さまざまなサブタイプ、腫瘍段階、およびさまざまな肝臓病理学的組織の認識に使用することに成功しました。差別化。この結果は、ラマン分光法と深層学習を組み合わせることで、さまざまな病理学的サンプルのスペクトルパターンを正確に記録し、識別できることが実証されました。さらに、追跡調査では、HCC前駆細胞と非悪性肝病変の区別、ならびに肝癌の治療と予後にとって重要な原発性肝癌と二次性肝癌の区別についても研究する予定です。

ラマンスペクトルの違いに基づいて、組織切片の細胞形態をラベルフリーの方法で描写できます。 SMCR 分解ラマン画像は、空間分布を示すだけでなく、標準的な H&E 染色法では適用できない 2D および 3D 細胞内スケールでの細胞および組織の主要な生化学成分 (タンパク質と脂質) の定量的な同定も示します。これは、細胞内ラマン分析が臨床試験中のがん診断を簡素化する大きな可能性を秘めており、組織病理学的診断に関する展望を提供することを示しています。

臨床的には、外科的切除が癌治療の標準的な方法です。正確な腫瘍境界の特定は、正常組織を過剰に切除することなく病変を完全に切除する場合、特に肝転移切除の場合に役立ちます。しかし、これは、2 つの組織を視覚的に区別するための適切な術中方法を持たない外科医にとってはしばしば困難です。我々は、異なる病理学的パターンを特徴とする肝組織の ex vivo と in vivo の両方の測定にラマン分光法を採用しました。明確な癌辺縁で取得された画像は、腫瘍領域と肝実質領域の間のスペクトルの違いに基づいて可視化されました。さらに、手術中に腫瘍と非腫瘍領域を区別するポータブルラマン分光計の実現可能性を検証することに成功しました。これらは、ラマン技術が、術中凍結切片作成や H&E 染色による混乱や遅延を生じることなく、外科医が手術中に関心領域を迅速に分析できる可能性を秘めていることを示唆しています 53。

ポータブルラマン分光計によって収集された組織のラマンスペクトルは、特にいくつかのピーク位置で、マイクロラマン分光計から得られたものと一致しないことは注目に値します（補足図13）。これは、レーザー源、レーザー出力と波長、分光計などの 2 種類のスペクトル機器間の違いに起因すると考えられます。同様の結果は、ポータブルラマン装置によるマウス腫瘍のラマン検出でも観察されました54。ただし、2 つの装置で測定されたラマンデータには差異がありましたが、これは、癌組織と隣接する正常組織を区別するラマン分光法の能力には影響しませんでした。

さらに、ラマン分光法の臨床ツールとしての実用化には、さらなる探索と最適化が依然として必要です。この研究では、肝臓組織ブロックから得られたラマン信号は、診断のために検出できるほど十分に高いことがわかりました。したがって、ラマンシグナル増強には金属ナノ粒子は必要なく、臨床応用における金属粒子の毒性と排泄のリスクが回避されました55,56。ただし、自発ラマン分光法の主な欠点の 1 つは信号強度が比較的低いため、画質と短い取得時間の間で妥協する必要があります。これは、非線形光学効果に基づいており、ラマンスペクトルイメージングにおける高速性と高空間分解能を同時に使用できるコヒーレントラマン分光法を組み合わせることで解決できる可能性があります48,57。さらに、ハンドヘルドラマンプローブのスペクトル収集ポイントが限られているため、手術中に病変が見逃される可能性があります。また、ラマン積分時間が呼吸周期より 10 倍以上短い場合でも、呼吸変動がスペクトルの品質に影響を与える可能性があります。私たちは、今後の研究で、このような問題を解決するための術中のラマンイメージングを支援するためにインテリジェントロボット協調システムを使用できることを実証したいと考えています。さらに、統合型ハンドヘルド診断装置の開発により、がん手術中により便利な方法で関心領域を正確に除去できるようになりました58。しかし、これらの新しい機器の出現に伴い、すべてのユーザーにわたる機器の標準化も懸念されており29、データ処理アルゴリズムとともに励起波長、レーザー出力、スペクトルコレクターのタイプなどの要素も標準化される必要があります。したがって、正確な診断のための正規化基準を備えた便利なラマン分光システムがすぐに開発され、臨床導入が容易になることが期待されています。

現在の研究は肝癌に関連して行われたが、同じアプローチを他の臓器の腫瘍の同様の組織学的特徴を評価するために使用できる可能性がある。したがって、我々は、ラマン技術をインテリジェントなアルゴリズムと組み合わせることで、肝臓やその他の種類の腫瘍の診断に適用でき、病理学的同定や手術中のガイダンスにおいて潜在的な役割を果たす可能性があると結論付けています。

現在の研究方法はすべて、温州医科大学第一附属病院の倫理委員会によって承認されたガイドライン（倫理承認番号 2020213）に基づいて実施されました。治験のリスクと利点が詳細に説明されたすべての患者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。

本研究では、原発性肝がん患者120人から、一対の肝がんと隣接する非腫瘍組織ブロックを含む合計240個の組織サンプルが採取され、そのうち98人が肝細胞がん（HCC）と診断され、22人が肝内胆管がんと診断された。 (ICC)。 120 人の患者の臨床診断および組織病理学的診断に関する詳細情報は、補足表 1 に示されています。がんの種類、がんの病期、分化型などの患者の診断結果は、関連する臨床指標および病理学的指標 4 に基づいて、第一附属病院の医師によって確認されました。温州医科大学の博士。

外科的切除と検査後、すべてのサンプルは -80 °C の冷蔵庫に保管されました。スペクトル測定の前に、組織ブロックをスライドガラス上に置き、組織表面の水をティッシュペーパーで吸収しました。術中検出および画像化へのさらなる応用を容易にするために、最小限のサンプル処理が適用されました。癌組織および隣接する非腫瘍組織から収集された組織ブロックは、H&E 染色に基づいて病理学者によって再確認されました。

組織切片のイメージングでは、凍結ミクロトームを使用して厚さ 5 μm の組織切片を調製し、ラマン測定用にスライスをスライドガラスに貼り付けました。同じ組織がラマン測定後の H&E 染色によって観察されました。

組織サンプルのラマンスペクトルは、532 nm の励起レーザーを使用してマイクロラマン分光計 (Renishaw、グロスターシャー、英国) によって取得しました。レーザービームは、L×50 の対物レンズ (開口数 (NA) = 0.50、作動距離 (WD) = 8.2 mm) によってサンプルの表面に焦点を合わせました。各スペクトルは、5% (1.25 mW cm-2) のレーザー出力で 3 秒にわたって積分されました。各組織サンプルの表面上のランダムに選択された点から、500 ～ 2000 cm-1 の範囲の少なくとも 50 のスペクトルが収集されました。統計分析の前に、ベースライン減算と Savitzky-Golay スムージングを備えた WIRE 5.3 ソフトウェアを使用してスペクトルデータを処理し、蛍光バックグラウンドを除去し、信号対雑音比を高めました。

腫瘍辺縁描写のための組織ブロックのラマンイメージングでは、532 nm レーザーを備えた L×50 対物レンズ (NA = 0.50、WD = 8.2 mm) を使用して、2.5 mW cm-2 レーザー出力と 2 s 各データポイントの露出時間。ラマンスキャンは、x 方向および y 方向 (StreamHR モード) で 2 μm の解像度で収集されたため、高い空間解像度でスペクトルを迅速に収集できます。イメージング中の組織サンプル表面の凹凸による高倍率ラマン分析の品質の低下を避けるために、LiveTrack フォーカストラッキング技術を使用して、画像取得中にサンプル表面に自動的に焦点を合わせます。

組織切片のラマンイメージングでは、各データポイントの 12.5 mW cm-2 レーザー出力と 0.5 秒の露光時間を使用して、両軸方向に 0.8 μm の高分解能でラマンスペクトルが取得されました。迅速かつ正確なデータ取得のために、532 nm レーザーと L×50 対物レンズ (NA = 0.50、WD = 8.2 mm) を備えた StreamHR および LiveTrack モードを上記と同様に使用しました。

WiRE 5.3 ソフトウェアの自己モデリング曲線解像度 (SMCR) と階層クラスター分析 (HCA) を使用して、腫瘍辺縁のラマンイメージング分析を行いました。スペクトルは、さらなる多変量イメージングの前に、ベースライン補正、平滑化、宇宙線除去、およびノイズフィルターによって前処理されました。

ハンドヘルドラマン分光法システムは、術中の肝がん検出に使用されました。 785 nmのファイバー結合レーザー（FC-D-785、Changchun New Industries Optoelectronics Technology Co., Ltd.、中国）をレーザー源として使用し、レーザー用の100 μmファイバーに接続されたハンドヘルドプローブに導入しました。励起と信号収集用の 200 µm 標準ファイバー (NA = 0.22)。ラマンシグナルは、電荷結合素子（CCD）ベースのファイバー分光計（QE Pro、Ocean Optics Inc.、米国フロリダ州ダニーデン）を用いて、スペクトル範囲 200 ～ 1100 nm、分解能 6 ～ 7 cm-1 にわたって収集されました。。スペクトルは、0 ～ 4000 cm-1 の広範囲のスペクトルシフトをカバーしました。分光計は、OceanView インターフェイスによって PC に接続されました。

術中感染を避けるために、ラマンプローブと接続されたファイバーを医療用アルコールで拭き、ポリエチレン製の使い捨ての滅菌保護スリップカバーで覆いました（中国、淳安の仁和医療用品工業貿易有限公司）。測定前に、検査領域の血液を最小限に抑えるために組織表面が処理されました。最初にバックグラウンドスペクトルが記録され、レーザーをオフにした状態で 0.2 秒の積分時間を使用して、各測定の前に自動的に差し引かれました。次に、各組織表面のランダムに選択された点から 0.2 秒の積分時間で 5 つの測定値が取得されました。プローブ先端のレーザーパワーは、光パワーメーター（Thorlabs Inc.のPM100D）で測定すると、約40～56 mW cm-2でした。測定された組織は、手術後に病理学者による組織生検のために収集されました。

この研究では、LC-MS によって代謝の差異を検出するために、一致する HCC 組織と隣接する非腫瘍組織の 25 対が選択されました。具体的なサンプル処理および試験方法は以下のとおりである。

２５ｍｇのサンプルをエッペンドルフチューブに秤量し、５００μｌの抽出溶液（メタノール：アセトニトリル：水＝２：２：１）および同位体標識内部標準混合物を加えた。次に、サンプルを 35 Hz で 4 分間均質化し、氷水浴中で 5 分間超音波処理しました。均質化と超音波処理のサイクルを 3 回繰り返しました。次に、サンプルを -40 °C で 1 時間インキュベートし、その後 4 °C、12,000 rpm で 15 分間遠心分離しました。得られた上清を分析のために新しいガラスバイアルに移しました。品質管理 (QC) サンプルは、すべてのサンプルの上清を等量ずつ混合することによって調製されました。

LC-MS/MS 分析は、Q Exactive HFX 質量分析計 (Orbitrap MS、Thermo) に接続された UPLC BEH Amide カラム (2.1 mm × 100 mm、1.7 μm) を備えた UHPLC システム (Vanquish、Thermo Fisher Scientific) を使用して実行されました。移動相は、水 (pH = 9.75) (A) およびアセトニトリル (B) 中の 25 mmol/L 酢酸アンモニウムおよび 25 mmol/L 水酸化アンモニアから構成されていました。勾配溶出を使用しました: 0 ～ 0.5 分、95% B。 0.5 ～ 7 分、95% ～ 65% B; 7 ～ 8 分、65% ～ 40% B。 8 ～ 9 分、40% B。 9 ～ 9.1 分、40% ～ 95% B。 9.1 ～ 12 分、95% B。流速は 0.5 ml/分でした。オートサンプラーの温度は 4 °C、注入量は 2 μl でした。

QE HFX 質量分析計は、取得ソフトウェア (Xcalibur、Thermo) の制御で情報依存取得モードで MS/MS スペクトルを取得できます。このモードでは、取得ソフトウェアは MS スペクトルを継続的に評価します。 ESI ソースの条件は次のとおりです。シースガス流量、30 Arb。 Aux ガス流量、25 Arb。キャピラリー温度、350 °C。フル MS 解像度、60,000。 MS/MS 分解能、7500。衝突エネルギー、NCE モードでは 10/30/60。スプレー電圧、+3.6 または -3.2 kV。この測定は、Shanghai Biotree Biotech Co., Ltd. の支援により達成されました。

生データは、ProteoWizard を使用して mzXML 形式に変換され、R を使用して開発された社内プログラムによって処理され、XCMS に基づいてピークの検出、抽出、アライメント、および統合が行われました。化合物の同定は、一次質量分析における親イオンの質量電荷比と、フラグメンテーションによって生成された特徴的なプロダクトイオンに基づいて行われました。市販の MS2 データベース (BiotreeDB) を代謝産物の注釈付けに使用しました。注釈のカットオフは 0.6 に設定されました。検出されたすべてのイオンは、その後の定量分析のために内部標準に従って正規化されました。 ESI+ および ESI- から検出されたイオンは、多変量解析のために SIMCA ソフトウェア (Umetrics、スウェーデン、ウメア) にインポートされました。 HCC と隣接する非腫瘍組織間の差次的な代謝物をスクリーニングするために、有意な変化 (スチューデントの t 検定、P < 0.05) およびプロジェクトにおける変数重要度 (VIP) 値 > 1 を持つイオンが OPLS-DA モデルで選択されました。。最終的に、ESI+ モードで 57 個の代謝物、ESI- モードで 51 個の代謝物が同定され、差次的代謝物の候補として選択されました。

ラマンスペクトルは PyTorch によって分析され、CNN アーキテクチャは VGG-16 フレームワークに基づいて修正されました 36。 CNN モデルは、13 の 1 次元畳み込み層 (64 カーネルを含む 2 つの畳み込み層、128 カーネルを含む 2 つの畳み込み層、256 カーネルを含む 3 つの畳み込み層、および 512 カーネルを含む 3 つの畳み込み層の 2 セットを含む)、5 つのプーリングで構築されました。図 2h に示すように、レイヤー (サイズ 2、ストライド 2)、および 3 つの完全に接続されたレイヤー。

スペクトルを癌および傍癌組織領域から区別するために、ソフトマックスオプティマイザーを使用して、学習率 0.0001、バッチサイズ 128 で前の接続層の出力を確率出力に変換しました。ドロップアウト層は 50% の割合で使用され、分類における特定のニューロンへの過度の依存を減らすために、次の層へのニューロンの 50% の寄与が無効になりました。 20 対の肝臓組織サンプルからのスペクトルデータがテストセットとしてランダムに選択され、残りの 100 対のサンプルのスペクトルデータが 8:2 の比率でトレーニングセットと検証セットにランダムに分割されました。他の 3 つの分類モデルでも同様の分割が実行され、各グループのサンプルの 20% がテストセットとしてランダムに選択され、残りのサンプルが 9:1 の比率に従ってトレーニングセットと検証セットに分割されました。重みバランスは、損失を計算するときに各トレーニングサンプルの重みを変更して、すべてのクラスが損失に均等に寄与するようにすることで、起こり得るデータの不均衡を軽減するために使用されました (コードの詳細は、次の GitHub リンクでご覧いただけます)。

相関行列ヒートマップの形式のピアソン相関係数 (r) に基づく代表的なラマンピーク強度の相関分析は、Python によって計算されました。データ分析に使用したソフトウェアのバージョンは次のとおりです: Python 3.9.9、pytorch 1.10.1、numpy 1.22.0、matplotlib 3.5.1、torchvision 0.11.2、tqdm 4.62.3、pandas 1.0.4、および seaborn 0.9 .0。

データは、各図の凡例に示されているように、平均 ± 標準偏差 (SD) として表されます。すべてのデータは正規分布に準拠していました。 2 つのグループ間の統計的有意性は、P 値 < 0.05 を有意とみなし、両側スチューデント t 検定によって取得されました。染色画像とラマン画像の顕微鏡写真は、3 つの独立した測定結果を表しています。

SMCR アルゴリズムは、組織スライスのラマンイメージング分析で使用され、さまざまな肝臓の組織病理学的パターンを特定しました。 SMCR メソッドは、多変量曲線の決定と最小二乗分析を交互に行う形式で、コンポーネント情報を物理的に意味のあるコンポーネントに変換します。簡単に言うと、SMCR は、各ピクセルのすべてのスペクトルデータを含む実験データ行列 (X) を、濃度イメージングの行列 (C) と純粋なスペクトルの行列 (S) という 2 つの小さな行列に分解します。

ここで、E は誤差行列です。最初にスペクトル行列 S、C、ST を推定することにより、収束に達するまで代替最小二乗 (ALS) アルゴリズムを使用した反復最適化を実行できます 59。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付けるデータは、原稿とその補足情報から入手できます。この原稿に関連する生の質量分析データは、補足データ 1 および 2 にあります。ただし、商用 MS2 データベース (BiotreeDB) は、Biotree Biotech Co., Ltd. に連絡して入手する必要があります。ソースデータはこの論文で提供されます。

CNN モデルとデモデータセットに使用されるコードは、https://github.com/thidoiSanren/CNN_liver-cancer_Raman60 で入手できます。

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この研究は、YW への中国浙江省自然科学財団 (補助金番号 LR19H180001)、YW への温州の人材イノベーションおよび起業家精神プロジェクト (RX2016005)、および YW への温州公共プロジェクト (2020005) によって財政的に支援されました。

生物医工学部、眼科および検眼部、眼科病院、温州医科大学、325001、温州、中国

Liping Huang、Liangbin Sun、Yuzhe Chen、Xueqian Ren、Yuancai Ge、Xiaohu Liu、Yi Wang

浙江省臨床機能材料および診断・治療機器工学研究センター、中国科学院温州研究所、325001、温州、中国

Liping Huang、Danfeng Jiang、Qingwen Zhang、Yi Wang

温州医科大学第一附属病院、325015、温州、中国

孫宏偉＆師克清

オーストリア工科大学、Giefinggasse 4、ウィーン、1210、オーストリア

ヴォルフガング・ノール

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LH、QZ、YW が研究を計画し、実施しました。 HS と KS は臨床サンプルを提供し、組織染色と術中手術を支援しました。 LS、YC、YG は統計分析を実行し、CNN モデルを確立しました。 XR と DJ は、組織の準備とラマンテストで LP を支援しました。 LP はデータ処理とグラフ作成を担当しました。 LH、XL、QZ が原稿を書きました。 WK、QZ、YW がプロジェクトを監督しました。著者全員が原稿をレビューしました。

Qingwen Zhang または Yi Wang との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Wei Min と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Huang, L.、Sun, H.、Sun, L. 他ラマン分光法と深層学習に基づいた、ラベルフリーの肝臓がんの迅速な組織病理学的診断。 Nat Commun 14、48 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-35696-2

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受信日: 2022 年 3 月 2 日

受理日: 2022 年 12 月 15 日

公開日: 2023 年 1 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35696-2

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