凍結ヒト制御性 T 細胞からのクロマチンアクセシビリティと遺伝子発現ダイナミクスの並行回復

Scientific Reports volume 13、記事番号: 5506 (2023) この記事を引用

1369 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

DNA へのアクセス可能性などのエピジェネティックな特徴は、細胞型および細胞状態に固有の方法で転写制御を決定し、これを臨床関連資料で健康と疾患でマッピングすることにより、新しいメカニズムの洞察と治療の新しい標的への扉が開かれます。 Assay for Transposase Accessible Chromatin Sequencing (ATAC-seq) を使用すると、少ない細胞入力からクロマチンアクセシビリティプロファイリングが可能になり、制御性 T (Treg) 細胞などの希少細胞集団でも扱いやすくなります。ただし、このアッセイと凍結保存された希少細胞集団との適合性についてはほとんど知られていません。ここでは、新鮮または凍結保存された PBMC サンプルから回収された初代 Treg 細胞を、定常状態と刺激に応答した状態で比較する ATAC-seq プロトコルの堅牢性を実証します。我々は、この方法を拡張して、50,000個の凍結保存されたTreg細胞の単一アリコートからクロマチンアクセシビリティとトランスクリプトームの同時定量を行う実現可能性を調査します。同じ細胞プール内でクロマチンのアクセス可能性と遺伝子発現を並行してプロファイリングすることにより、細胞の不均一性が制御され、投入材料が限られている場合に特に有益です。全体として、新鮮なサンプルと凍結保存されたサンプルの間で、アクセシビリティパターンと転写因子の動態に高い相関関係があることが観察されました。さらに、細胞全体と ATAC-seq 反応から回収した上清から、非常に類似したトランスクリプトームプロファイルが得られました。我々は、これらの技術を適用して、凍結保存バイオリポジトリから回収された細胞のエピゲノム状況をプロファイリングする実現可能性を強調します。

遺伝子発現は、転写因子（TF）が近位プロモーターおよび遠位調節要素（エンハンサーなど）に結合することによって制御されます。クロマチン構造は、これらのエンハンサーやプロモーターの結合部位への TF のアクセスを制御することにより、遺伝子発現に大きな影響を与えます1。ヒストン修飾、DNAメチル化、ヌクレオソームリモデリングなどのクロマチンのエピジェネティック修飾の局所的パターンは、エンハンサー活性、TF結合、転写制御と相関しています。クロマチンのアクセス可能性は、タンパク質がクロマチンと物理的に相互作用できる程度に関係し、エピジェネティックな修飾、ヌクレオソームの位置決め、および DNA へのアクセスを制限するクロマチン結合タンパク質によって強く影響されます2。アクセスしやすいクロマチンまたは開いたクロマチンは転写活性領域および調節要素と関連付けられ、一方、閉じたクロマチンはサイレント領域または抑制された領域と関連付けられます。たとえば、アクセス可能な DNA はゲノムの約 2 ～ 3% を構成しますが、ENCODE プロジェクトでアッセイされた TF が占める領域の 90% 以上を捕捉しています 2,3,4。クロマチンのアクセス可能性は通常、酵素によるメチル化または切断に対するクロマチンの感受性によって実験的に決定されます。しかし、DNase-seq などの従来のクロマチンプロファイリング方法では、入力要件として数百万の細胞が必要であり、複雑なライブラリー調製ワークフローが必要です。ハイスループットシークエンシングによるトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイ（ATAC-seq）は、クロマチン構造（アクセシビリティとヌクレオソームの位置決め）と重要なことに、他の技術よりも低い入力要件で高分解能でTF結合を同時にプローブする比較的新しいゲノム規模のアプローチです5,6 。 ATAC-seq の開発により、はるかに少ない細胞数を使用してクロマチンのアクセス可能性を定量化できるようになったため、臨床現場や対象となる希少細胞集団に適用しやすくなりました。単一細胞分解能でのクロマチンアクセス可能性の測定も、単一細胞 ATAC シーケンス (scATAC-seq) 戦略の開発により可能になりました 7、8、9。 ATAC-seq では、次世代シーケンシングアダプターがプリロードされた Tn5 トランスポザーゼが、アクセス可能なオープンクロマチン領域でシーケンシングアダプターの切断とライゲーションを同時に行います 5、6。アダプター間に捕捉されたフラグメントは、PCR によって増幅され、ハイスループットシークエンシングに供されます 5、6。

エピジェネティックなメカニズムは、細胞の発生と分化に重要な遺伝子発現機構の重要な側面を支配します10、11。エピジェネティックな混乱と遺伝子発現の変化は、全身性エリテマトーデス（SLE）、炎症性腸疾患（IBD）、関節リウマチ（RA）、多発性硬化症（MS）などの多くの自己免疫疾患で報告されています12。疾患コホートにおけるクロマチンのアクセス可能性のプロファイリングは、自己免疫におけるエピジェネティクスの調節不全についての理解を深め、疾患に関連するエピジェネティクスの特徴の同定を通じてトランスレーショナルリサーチや個別化医療の開発に大きく役立ちます。このプロトコールは新たに処理したサンプルに広く適用されていますが、クロマチン構造と遺伝子発現に対する凍結保存の影響を調べた研究は数多くあります 13,14,15,16,17,18,19 があり、現在まで初代ヒト T細胞では行われていません。凍結保存されたヒト FOXP3+ 制御性 T (Treg) 細胞を含む細胞サブセット。 FOXP3+ 制御性 T (Treg) 細胞は、免疫寛容を維持し、不適切な免疫応答を防ぐリンパ球のまれなサブセットです 20、21、22、23。 Treg 細胞の頻度と機能の変化は、1 型糖尿病 (T1D)24、SLE25、IBD26、RA27 を含む幅広い自己免疫疾患に関与していると考えられています。

無傷の生きた細胞や組織の凍結保存は、基礎研究および臨床研究アプリケーションでは一般的に行われており、症状の状態や期間を超えて患者やサンプルを追跡することができます。凍結保存は、サンプル数が多い、または処理や時点が多いため、新鮮なサンプルのゲノム解析が不可能な大規模コホート研究では重要になります。このようなバイオリポジトリは、複雑な病気の理解、診断、予防、治療の向上にますます大きく貢献しています28,29。過去数十年でヒト生体サンプルの収集と保管における大幅な改善が見られ 29、これにより、疾患バイオマーカーの同定により、診断や予後、さらには医薬品開発に情報を提供できるようになりました。バイオバンキングは、自己免疫を含む多くの分野でますます採用されています。したがって、これらの最先端のゲノムアプローチをバイオバンク材料に適用する場合、正確な解釈と臨床翻訳のために、回収された細胞が新鮮な細胞の表現型を厳密に再現していることを確認することが不可欠ですが、回収された細胞のエピジェネティクスに対する凍結保存の影響を調査する報告書は、細胞は限られています13,14。

これらのバイオバンクで高品質のマルチオミックス分析を実行するには、解凍後の生存率と回収率が重要な指標であるだけでなく、回収されたサンプルが凍結前の状態の生理学的および生化学的状態を厳密に反映している必要があります。これをテストするために、我々は、健康な成人被験者から得た PBMC の凍結保存に関する膵島自己免疫環境決定因子 (ENDIA)30,31 研究によって確立されたバイオバンキング標準を採用しました。私たちの研究は、凍結保存された希少免疫細胞集団の全体的なクロマチンアクセシビリティ状況を評価することを目的として開始され、50,000 個の細胞の単一反応からクロマチンアクセシビリティとトランスクリプトームを並行して定量化する実現可能性をテストしました。具体的には、核単離前の凍結により核の完全性が損なわれ、FOXP3+ 制御性 T (Treg) 細胞のクロマチン構造が変化するかどうかを調べました。

免疫細胞は環境刺激に応答する必要があるため、侵入する病原体やがんに対する適切な免疫応答のための特殊な機能を備えた免疫応答遺伝子の誘導を促進する、高度に調整された転写プログラムを備えています。一方、これらの転写プログラムの調節不全は自己免疫に関連しています。外部刺激に対する細胞の感受性と応答性は、クロマチンのアクセス可能性と遺伝子発現の変化の大きさを決定的に決定し、これの乱れが病気の原因となる可能性があります。これを免疫細胞のコンテキストに適用するために、冷凍材料を含む複数のアプリケーションにわたってデータ品質の大幅な向上を実現することが証明されている Omni ATAC-seq32 を採用しました。 ATAC-seq は、健康な成人被験者から得られた末梢血単核球 (PBMC) から単離され、新鮮に処理されたもの、または公開されているバイオバンキングプロトコールに従って低温保存および解凍された Treg 細胞に対して実行されました 31。我々は、定常状態および刺激に応答した Treg 細胞におけるクロマチンのアクセス可能性と TF 占有率をプロファイリングしました。我々は、新たに処理したサンプルと解凍したサンプルの両方から無傷の核を単離すると、グループ間で実質的に区別できないクロマチン接近パターンが生成されることを実証した。さらに、ATAC-seq と RNA-seq を組み込んで 50,000 個の細胞でクロマチンのアクセス性と遺伝子発現を同時に測定し、同じ細胞プールから 2 つのシステム間の制御関連を推測できるワークフローについて説明します。 ATAC-seq ワークフローでは、穏やかな細胞溶解の後、核画分と細胞質画分が遠心分離によって分離されます。核は ATAC-seq に供され、細胞質画分を含む上清画分は RNA-seq に供されます。全細胞から精製した RNA と凍結保存サンプルの ATAC-seq 上清画分との間のトランスクリプトームプロファイルの高い一致が観察されました。これは、クロマチンのアクセス可能性と遺伝子発現の並行プロファイリングが、投入材料によって制約される実験において有効なアプローチであることを示しています。要約すると、ATAC-seq と RNA-seq の組み合わせ解析がバイオバンクにプールされた細胞に適用できることを実証し、その結果は、休止細胞か活性化細胞かにかかわらず、新たに単離した細胞に対して実行した同じアッセイと強い相関関係を示します。これにより、これらのアプローチを臨床コホートからのバイオバンク免疫細胞に適用する際に自信が得られます。

凍結したバイオバンク材料が新鮮な材料を忠実に反映しているかどうかをテストするために、健康な成人被験者から得た各 PBMC サンプルを半分に分け、1 つをすぐに処理し、もう 1 つの半分を凍結保存して保存し、その後細胞分離および ATAC-seq および RNA を解析しました。逐次実験。極低温保存は、CD4+ Tconv 細胞および Treg 細胞の細胞生存率、回復率、頻度に大きな影響を与えませんでした（図 1a-d）。さらに、フローサイトメトリー分析（図1d）で実証されているように、凍結プロセスはT細胞の複雑性を保存し、t分布確率的近隣埋め込み（t-SNE）分析によって特定されたT細胞サブセットの保存も行いました（図1e、f）および補足図1）。よく形成された細胞集団クラスターが、新鮮なCD4 + T細胞と解凍したCD4 + T細胞の両方で同定され（図1c）、それらには、FOXP3、CD25、CD127、CD45RA、CCR10などのT細胞サインを発現する集団が含まれています（補足図1）。これらのデータはすべて、解凍した材料から単離された T 細胞が生存しており、新たに処理した細胞と同様の細胞表面マーカーを示していることを示しています。

冷凍サンプルの複雑さは、新鮮サンプルの複雑さを再現します。新鮮な PBMC サンプルと解凍した PBMC サンプルの生存率 (a) と絶対細胞数 (b)。 (c) 解凍後の生きた PBMC の回収率 (%)。細胞生存率と PBMC サンプルの回収率は、トリパンブルー色素排除試験を使用して測定されました。（ d ）代表的な新鮮および解凍したPBMCサンプルからのフローサイトメトリープロファイル、および従来型T（Tconv）細胞および制御性T（Treg）細胞を分離するためのゲーティング戦略。（e – f）手動クラスタリングによるt-SNE（t分布確率的近隣埋め込み）分布に寄与する新鮮な（e）および解凍した（f）CD4陽性細胞からのイベントを示すカラードットプロット。

凍結保存プロセスが制御性 T (Treg) 細胞のクロマチンアクセス状況を変えるかどうかを調べるために、健康な成人被験者から得た PBMC の CD4+ CD25hi CD127lo Treg 細胞に対して Omni ATAC-seq を実行しました。 PBMC サンプルは分割され、すぐに処理されるか、CD4+ Treg 分離前に極低温保管されました (補足図 2)。高いリードマッピング品質とライブラリの複雑性を実現することが知られているため、Omni ATAC-seqを採用しました33。これは、モデルデータセットでのピーク同定の独自の分析でこれを確認しました（補足図11）。回収された Treg の応答性をさらに調べるために、単離された Treg 細胞を未処理のままにするか (休止)、または Omni ATAC-seq の前に Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28 を使用して 48 時間刺激しました (シーケンス出力については補足表 1)。新鮮な（休止）サンプルの平均41,587個の再現可能なピーク、解凍された（休止）サンプルの45,534個の再現可能なピーク、新鮮な（刺激された）サンプルの88,631個の再現可能なピーク、および解凍された（刺激された）サンプルの95,670個の再現可能なピークを特定しました（補足図5a）。。新鮮なグループと凍結保存されたグループの両方で、ドナーペア間で再現可能なピークの数に有意な差はありませんでした（補足図5b）。新鮮および解凍した Treg 細胞から生成した増幅された ATAC-seq ライブラリーのフラグメントサイズ分布は、ヌクレオソームフリー領域 (NFR) または整数で保護された領域の DNA フラグメントに対応する、200 bp の周期を持つ明確で特徴的なヌクレオソームラダーリングパターンを示しました。複数のフェーズドヌクレオソーム（図2a、補足図3および4）、高品質のATAC-seqライブラリを示しています。解凍した Treg 細胞は、新鮮なサンプルと同様の構造の ATAC-seq シグナルをヌクレオソーム周囲に示します (補足図 4)。新鮮な Treg ATAC-seq プロファイルと解凍した Treg ATAC-seq プロファイルの両方が、頂点が可能な限り最短のフラグメントを表す独特の V 字型パターンを示します。ヌクレオソーム (約 117 bp) によって保護されています。 V プロットで最も濃縮された位置は、ヌクレオソームダイアッドを中心とする 143 bp のフラグメントに対応します。これは、標準的なヌクレオソームによって結合される DNA の長さです。このクロマチン構造構成のパターンは、Scep et al.34 によって得られたパターンと一致しています。新鮮なTreg細胞と解凍したTreg細胞の両方で刺激すると、休止中の対応物と比較して、より顕著なヌクレオソーム周期パターンが観察されました（補足図4）。これは、刺激によりヌクレオソームのリモデリングとクロマチンへのアクセス性が大幅に変化することを示唆しています。これらの結果は、凍結によって DNA 配列に沿ったヌクレオソームの移動や位相が妨げられなかったことを裏付けています。

解凍した Treg 細胞からの ATAC-seq の品質は、新鮮な細胞の品質をよく再現しています。 (a) 新鮮および解凍した Treg ATAC-seq ライブラリーのインサートサイズ分布。 (b) 新鮮なおよび解凍した ATAC-seq ライブラリーの完全なライブラリーの複雑さと外挿収量曲線。複雑さの測定値は、最高の複雑さ (100% 独自にマッピングされた読み取り) に対してプロットされます。 (c) ± 1.5 kb 転写開始部位 (TSS) での ATAC-seq シグナルの分布。シグナルカバレッジは、各サンプルのマップされたリード 100 万件あたりのリードから計算されます。 (d) ミトコンドリアゲノムにマッピングされたリードのパーセンテージ。濃い色は、0 (黒) から始まり最大値 (黄色) で終わる線形スケールに従う統計および範囲の最も望ましい値を表すために使用されます。すべての値は、アラインメントされたリードの全深度から決定されました。新鮮なサンプルと解凍したサンプルの差の統計的有意性は、対応のあるスチューデントの t 検定によって計算されます。ａ〜ｃに示されるデータは、３人のドナーからプールされたシーケンシングリードを代表するものである。

新鮮なライブラリーと解凍したライブラリーは、休止状態と刺激状態の両方で、同等の分子複雑性（図2b）と、ENCODE4で推奨されている信号対雑音比の重要な尺度である転写開始部位（TSS）の濃縮（図2c）を示しました。。新鮮なTreg細胞と解凍したTreg細胞から生成したATAC-seqライブラリーの間で、ミトコンドリアリードの割合に有意差は観察されませんでした（図2d）。また、凍結サンプルと比較して、新たに処理したものでは、ATAC-seq ピーク領域（FRiP）（図 3a）のマッピングされたリードの割合（図 3a）またはそのゲノム分布（図 3b）に有意な差は観察されず、凍結保存によってデータが変化しないことが示唆されました。アクセス可能なクロマチン領域での転位効率。細胞刺激後のピークあたりの読み取り値の同等の増加は、凍結保存が細胞活性化時のクロマチン組織の変化に大きな影響を及ぼさないことを示しました（図3aおよび補足図5a）。さらに、新鮮なサンプルと解凍したサンプルは、ピークシグナルの高い相関関係を示し、凍結融解が休止細胞または刺激細胞のいずれにおいてもアクセス可能なクロマチンランドスケープに大きな影響を与えなかったことを示しました（図3c〜e、補足図6）。 IL2RA（インターロイキン2受容体サブユニットアルファ）やFOXP3（フォークヘッドボックスP3）などのTregの機能と発達に不可欠な遺伝子座のクロマチンアクセスランドスケープも高度に保存されていることがわかりました（図3f、g）。まとめると、これらの観察は、凍結保存が細胞反応、クロマチンランドスケープ、およびエピジェネティックサインを乱さないこと、およびこのプロトコルが凍結保存された初代ヒトTreg細胞に適用できることを示唆しています。

クロマチンのアクセス可能性は凍結保存によって維持されます。 (a) 新鮮および解凍した Treg ATAC-seq ライブラリーのピーク内のリードの割合。新鮮なサンプルと解凍したサンプルの差の統計的有意性は、対応のあるスチューデントの t 検定によって計算されます。 (b) 注釈付きピークの割合で表した、異なるゲノム特徴にわたる ATAC-seq ピークの分布。プロモーターは、-1 kb ～ + 100 bp の TSS 領域によって定義されます。その他、3' UTR、5' UTR、miRNA、ノンコーディング RNA、および TTS (転写終結部位) の注釈が付けられたピーク。（ c 、 d ）安静中（ c ）および刺激への応答中（ d ）、新鮮なサンプルおよび解凍したサンプルから特定されたATAC-seqピークの100万あたりのリードカウント（CPM）リードの散布図。ピアソンの相関係数の値が表示されます。（ e ）この研究のために生成されたすべてのATAC-seqサンプルのCPM読み取りの関連を示す相関図。（ f 、 g ）IL2RA（ f ）およびFOXP3（ g ）遺伝子座での休止状態および刺激状態での新鮮および解凍したTreg細胞のクロマチンアクセシビリティプロファイル。 ATAC-seq シグナルは、T 細胞スーパーエンハンサー、ロードマップエピゲノミクスプロジェクトからの Treg クロマチン状態、および FOXP3 結合部位と交差します。各 ATAC-seq トラックは 3 人のドナーからプールされたシグナルを表します。ブラウザビューは UCSC ゲノムブラウザを使用して生成されました。 ag の計算は、3 人のドナーを代表するプールされたデータに対して実行されました。

免疫細胞は、クロマチンドメインの再プログラミングによって常に環境刺激に応答し、その結果、特殊な機能を持つ免疫応答遺伝子の誘導を駆動する転写プログラムが生成されます。 T 細胞刺激に特異的なゲノム領域には、IBD や RA などの自己免疫疾患に関連する GWAS-eQTL または SNP、および T 細胞サブセット特異的エンハンサーが豊富に含まれており、疾患に関連する調節因子を特定するために刺激下にある免疫細胞をプロファイリングすることの重要性が強調されています。要素とメカニズム35、36。以前の研究 35,36 によれば、刺激によりクロマチン変化が全体的に増加します。古典的な Treg シグネチャ遺伝子 37 を含め、ゲノム全体のクロマチンアクセシビリティの変化と TF 占有率の高い一致が、刺激に応答した新鮮および解凍した Treg 細胞で観察されました (図 4a、補足図 7 および補足表 2)。アクセス可能なプロモーターは活性な遺伝子発現を示すというのが一般的なコンセンサスであるため、我々はこの分析を拡張して、プロモーターアクセス可能性シグナルと、全細胞RNA-seqを使用して解凍したTreg細胞から生成された対応する遺伝子発現との間の相関を評価しました。他の研究38,39と一致して、プロモーターのアクセス可能性とそれぞれの遺伝子発現との相関関係は有意であり（図5aおよび補足表2）、凍結がTreg細胞における活性化応答性エピゲノムおよび遺伝子発現の誘導を損なわないことを示唆しています。

解凍した Treg 細胞は、新鮮な細胞と同等の TF 活性を示します。 ATAC-seqは、選別された静止および刺激された新鮮な解凍Treg細胞に対して実行されました。（ a ）新鮮なTreg細胞と解凍したTreg細胞における刺激応答性のクロマチンアクセシビリティ変化の相関関係（休止状態と刺激状態の間のピークのリードの変化倍数として表されます）。静止状態と刺激状態の間で差次的にアクセス可能なゲノム遺伝子座は、FDR が 0.05 未満で、対数倍変化が 1.2 より有意に大きい (赤) または小さい (青) (条件間の 2.3 倍の差に相当) を持つ遺伝子として定義されました。。 ATAC-seq ピークは最も近い TSS に注釈が付けられ、対数倍変化が 4 より有意に大きい/小さい共通の差次的にアクセス可能なピークには遺伝子記号で注釈が付けられました。差次的にアクセス可能な一般的な Treg シグネチャー遺伝子の上位 20 個 (Ferraro et al. 37) が緑色で強調表示されています。（ b – d ）休止状態（ c ）および刺激状態（ d ）中のFOXP3（ b ）、CTCF、RUNX1、CREB1、GATA3、IRF1およびYY1結合モチーフでの新鮮なサンプルと解凍したサンプルのフラグメントを比較するヒストグラム。 TF占有シグナルは、JASPARデータベースから得られた対応するモチーフと一致するゲノムワイドATAC-seqフットプリントに基づいて計算されます。ヒストグラムは、3 人のドナーを代表するプールされた配列決定データから計算された Treg クロマチンアクセシビリティシグナルから生成されます。

ヒト Treg 細胞におけるクロマチンアクセシビリティとトランスクリプトーム動態の並行測定。 RNA-seqは、細胞全体から単離されたRNA、または解凍したTreg細胞から調製されたATAC-seq反応から回収された上清（細胞質）画分を使用して実行されました。（a）解凍した全Treg細胞における刺激応答性クロマチンアクセス性と遺伝子発現変化の相関関係（休止状態と刺激状態の間の倍率変化として表す）。休止状態と刺激状態の間で異なってアクセス可能なプロモーター/発現遺伝子は、0.05未満のFDRおよび1.5より有意に大きいまたは小さい対数倍変化を有する遺伝子として定義された。刺激によるクロマチンへのアクセス性と発現変化が異なるプロモーターが強調表示されます。青い線は、分布への黄土の適合を示します。 (b) ATAC-seq 上清 (細胞質) 画分および Treg 細胞全体から生成されたトランスクリプトームプロファイルの差分分析。差次的に発現される遺伝子は、0.05 未満の FDR および 1.5 より有意に大きい (赤色) または小さい (青色) 対数倍変化を有する遺伝子として定義されました。差次的にアクセス可能な上位 20 個の遺伝子には、遺伝子シンボルの注釈が付けられます。 (c) ATAC-seq 上清画分と細胞全体から生成されたトランスクリプトームプロファイルの相関関係。各遺伝子の発現は、シーケンシングリードの 100 万あたりのログ数 (CPM) で表されます。差次的に発現される遺伝子は赤色で強調表示されます。示された結果は 4 人のドナーを代表するものです。

アクセス可能なクロマチン内では、転写因子 (TF) に結合した DNA 配列は Tn5 切断に対して選択的に耐性があり、保護された DNA またはフットプリントの短い領域が生じます。 Omni ATAC-seq のフットプリント解析は、ヌクレオソームフリー領域 (NFR) および 1 つのヌクレオソーム (1N) に結合した領域を表すプールされたアクセス可能なフラグメントを使用して実行されました40。合計 551 個の TF フットプリントが Treg ATAC-seq データで発見されました (補足表 3)。静止状態および刺激に応答した新鮮および解凍したTreg細胞から特定された、アクセス可能な領域で明確で個別のTFフットプリントを観察しました（図4b〜d）。新鮮および解凍したTregサンプルに関連するゲノムワイドフットプリントシグナルを重ね合わせると、Treg細胞のマスターTFであるFOXP3を含む、広範囲のTFの予測TF結合部位の位置の周囲で同様のアクセシビリティレベルが観察されたことが示されました（図4b））、CTCF、RUNX1、CREB1、GATA3、IRF1、YY1などのT細胞で重要な役割を持つTFも同様です（図4c、d）。これらのデータは、新鮮な Treg 細胞と解凍した Treg 細胞のオープンクロマチン領域における区別できないクロマチンランドスケープと TF 占有を強く示しており、凍結またはバイオバンキングは単一塩基対の TF 占有のアクセシビリティパターンを解決する能力に影響を与えず、TF に全体的な影響を及ぼさなかったことを示しています。 -DNA相互作用。

同じ細胞プール内のクロマチンのアクセス可能性とトランスクリプトームの並行プロファイリングにより、制御要素と遺伝子発現プログラムの間の複雑な関係を解明することができます。このアプローチは、クロマチンのアクセシビリティとトランスクリプトームのプロファイリングに使用されるライブラリーが同じ細胞集団に由来し、いつでも集団内の異なる細胞における確率的遺伝子変動を制御するため、単一細胞実験を補完します。このワークフローは、凍結保存された希少ヒト細胞集団の使用など、投入材料が限られている実験に特に有益です。 ATAC-seq ワークフローでは、全細胞溶解物が遠心分離によって核画分と細胞質画分に分離されます。核をATAC-seqに供する一方、RNAは上清成分から単離してRNA-seqに供しました。細胞質由来 ATAC-seq 上清 (ATAC-SN) から回収した RNA を使用する可能性を評価する際に、我々は最初に、無傷のヒト Treg 細胞から単離された全 RNA と比較して、ATAC-SN の全体的な遺伝子発現パターンを評価しました。 ATAC-SN と全細胞画分は、転写物の存在量に関して有意に高い相関関係 (R = 0.94; p 値 < 2.2 × 10-16) を示し、トランスクリプトームの 90.7% (11,548 個の遺伝子のうち 10,472 個) は有意に変化していませんでした。両方のコンパートメント（図5b、cおよび補足表2）。有意性の基準は、0.05 未満の偽発見率 (FDR) として定義されました。これらは、この方法によって導入されるバイアスが最小限であることを確認します。

遺伝子のごく一部 (9.4%) は、細胞全体のコンパートメントと比較して、細胞質由来の ATAC-SN で差次的に濃縮されました。発現レベルの違いを説明する遺伝子の大部分は、ATAC-SN 画分で下方制御された遺伝子でした。遺伝子オントロジー (GO) 濃縮分析は、ATAC-SN 画分で大幅に豊富または枯渇した遺伝子に対して実行されました。 ATAC-SNで過小評価されていた転写物は、核分裂、ヒストン修飾、核分裂、染色体構成、糖タンパク質などの核生物学的プロセスと分子機能に関連していました（補足図8a、c）。さらに、我々の結果は、細胞分画全体と比較してATAC-SNでより低いレベルで検出された遺伝子が、ヒトHapMapリンパ芽球様細胞株（LCL）におけるRNA安定性の低下と関連していることも示しました41（補足図9）。。対照的に、ATAC-SN画分に豊富に含まれる転写物は、膜への共翻訳タンパク質ターゲティング、小胞体（ER）へのタンパク質ターゲティング、細胞質翻訳、ミトコンドリア組織化、リボソームなどの膜関連プロセスに関与していた。生物発生（補足図8b、d）。これらの結果は、核および細胞質コンパートメントにおける mRNA 分子の異なる濃縮を特定した他の組織での研究と高い重複を示しています 42、43、44。例えば、Zaghlool et al.44 では、多くの核コード型ミトコンドリアタンパク質 (NEMP) mRNA が、さまざまなヒト組織タイプにわたって細胞質コンパートメントに大幅に濃縮されていることが実証されました。 NEMPs mRNA がヒト T 細胞の ATAC-SN 画分にも優先的に局在しているかどうかを確認するために、Mitocharta2.045 からミトコンドリア局在に関連するタンパク質をコードする遺伝子の完全なリスト (n = 1158) を取得し、差次的に発現する遺伝子の濃縮分析を実施しました。 ATAC-SN 画分およびヒト NEMP で上方または下方制御される遺伝子。以前の研究と一致して、細胞質コンパートメントに豊富なNEMP転写物が観察されました。我々の結果は、細胞質由来のATAC-SNで有意に上方制御された合計71個（20.6％）の遺伝子がヒトNEMPデータセットと重複していたのに対し、ATAC-SNで下方制御された遺伝子はわずか13個（1.6％）のみNEMPであったことを示しています（補足図）。 10a)。 NEMPは、ATAC-SN画分でのみ有意に濃縮されており（p値= 6×10-10）、全細胞抽出物では濃縮されていないことが示され（補足図10b）、ATAC-SN画分が主にサイトゾル由来であることと一致しています。全体として、ATAC-SN と細胞全体に由来するトランスクリプトームは高度な一致 (> 90%) を示し、ATAC-SN は希少細胞集団などの低入力リソースからの全体的な遺伝子発現パターンの研究に使用できると結論付けています。または臨床サンプル。我々の発見は、NEMPの濃縮によって確認されたように、ATAC-SNが細胞質に濃縮されたmRNAの細胞内局在を保存していることも示しています。

凍結保存は PBMC の生存率と機能に影響を与える可能性があり 46、47、凍結融解サイクルの繰り返しは細胞の生存率と機能に悪影響を与える 48 と仮定されていますが、大規模なコホートまたは縦断的研究からの新鮮なサンプルの使用はバッチ効果に関するいくつかの課題を引き起こします。、そしてバイオバンキングはこれらを軽減します。下流のアッセイで交絡変数が導入される可能性は、バッチ処理された凍結保存サンプルと比較して、長期間にわたって処理された新鮮サンプルの方が高くなります。さらに、新鮮なサンプルのみに依存すると、将来の研究による検証研究へのアクセスが妨げられます。 ATAC-seq は新たに処理されたサンプルに広く適用されており、クロマチン構造に対する凍結保存の影響をベンチマークする研究は限られた数しか行われていません 13,14。この研究では、ATAC-seq を使用して、凍結保存されたヒト末梢血から回収された初代制御性 T 細胞 (Treg) の全体的なクロマチンアクセシビリティ状況を評価するために確実に使用できることを実証しました。これは、他の T 細胞または免疫サブタイプにも適用できる可能性があります。私たちは、凍結保存が T 細胞の生存率や集団の複雑さに大きな影響を及ぼさないことを初めて実証しました。 ENCODE コンソーシアム 4 が推奨する基準を使用して、解凍した細胞から調製した ATAC-seq ライブラリーが、新たに処理した細胞から調製したライブラリーと同等の高い S/N 比を実現することを実証しました。さらに、ライブラリーの複雑さ、TF占有率、刺激に対する細胞応答性に関して、凍結保存したTreg細胞の高品質なクロマチンアクセシビリティデータを観察しました。これは、新たに単離した細胞で得られた結果と非常に類似していました。最後に、この研究の結果は、Tregの活性化と機能に不可欠な遺伝子座のアクセシビリティシグナルとTF占有フットプリントが、凍結保存から回収された細胞でよく保存されていることを示し、このプロセスがトランスクリプトームの制御に重要なエピジェネティックなサインを破壊しなかったことを強化している。 Treg細胞。これらの発見は、初代B細胞および乳がん細胞株におけるScharerら13およびFujiwaraら14の発見を反映しており、新鮮な標本とバイオバンクされた標本の間のシグナル対ノイズ比、アクセシビリティレベルおよびTFフットプリントパターンの高い相関関係も発見した。新鮮細胞と凍結細胞の間の高い相関関係は、PBMC サンプルから生成された単一細胞 ATAC-seq プロファイルでも観察されています 49。

これまでの研究は、定常状態の細胞におけるゲノム全体のクロマチン構造に対する凍結の影響に焦点を当てていたが、我々の結果は、バイオバンクに保存されたPBMCサンプルから分離された休止状態のT細胞における区別できないクロマチンのアクセス可能性とTF占有を実証することでこれに基づいて構築されたものである。細胞刺激に大きく反応します。刺激はクロマチンのアクセスしやすさに全体的かつ大規模な変化をもたらすことが示されています 35,36。免疫恒常性と活性化の調節不全は、がんや自己免疫に関与していることが知られており、数百の遺伝子変異が、T 細胞における刺激特異的な転写制御と遺伝子発現に関連している 50,51。ゲノム全体のクロマチンのアクセス可能性のレベルでは、新鮮な Treg ATAC-seq ライブラリーと解凍した Treg ATAC-seq ライブラリーの間で捕捉された差異は最小限であり、新鮮なサンプルと解凍したサンプルの両方で静止時と刺激を比較すると、より顕著な変化が検出されたことは注目に値します (補足図5および6）。この研究の結果は、凍結保存された PBMC から回収された Treg サンプルの活性化に対する応答性が新鮮なサンプルとほとんど区別できないことも示しており、バイオバンキングプロセスが細胞の活性化およびエピジェネティックな再プログラミングに対する応答に対する細胞の感受性を損なわないことを裏付けていることも心強いことです。免疫反応。重要なことに、凍結保存されたサンプルのクロマチンへのアクセス可能性は、標的遺伝子の発現と正の相関があった。これにより、トランスクリプトームプロファイルだけでは不可能な、制御ネットワークに関する貴重な洞察が得られます。総合すると、このことは、バイオバンクに保存されたサンプルを確実に使用して、遺伝的またはエピジェネティックな要因を特定し、免疫調節異常に起因する疾患メカニズムを明らかにできることを裏付けています。

ゲノミクスの適用可能性を低細胞数のバイオバンクサンプルや血液中の希少細胞にも拡張するために、同じ 50,000 細胞集団内のクロマチンアクセス性とトランスクリプトームの並行プロファイリング用に設計されたワークフローも開発しました。このワークフローは、小児臨床サンプルや希少細胞タイプの使用など、限られた投入材料に制約された実験を可能にするように設計されています。疾患の文脈では、ATAC-seq と RNA-seq のブリッジングは、エピジェネティクスがどのように変化するかを理解するのに役立つだけでなく、調節要素が疾患の病理に寄与する分子機構についての洞察も提供します。 ATAC-seq プロトコールでは、細胞溶解時に遠心分離により、溶解された細胞物質が 2 つの画分に分離されます。1) ATAC-seq での Tn5 転位に使用される無傷の核を含むペレット、2) 由来のライセートを含む上清主に細胞質と非核細胞小器官からのものです。我々は、核ライセート上清（「ATAC-SN」）からのトランスクリプトームをプロファイリングするプロトコールを確立し、ATAC-SN由来の転写産物と初代ヒトTreg細胞の全細胞抽出物の相対分布に高い相関があることを明らかにした。これらの結果は、トランスクリプトームの大部分が両方のコンパートメントで一致しており、高い割合の遺伝子が同様の量で検出されたことを裏付けています。 RNA-seq やマイクロアレイなどのトランスクリプトーム解析は、主に細胞全体から抽出された RNA を使用して行われてきましたが、RNA 分子の細胞内レパートリーを調査し、細胞内での分布を支配する空間的次元を理解することの重要性が強調される証拠が増えています 52,53。 54、55。 ATAC-SN 画分の大部分は細胞質 RNA で構成されており、研究により、細胞質トランスクリプトームが全細胞トランスクリプトームと強い相関があることが実証されています 42,56。細胞質画分は定常状態の mRNA のより正当な表現を提供することが示唆されているため、細胞質 RNA はタンパク質レベルのより適切な代用である可能性があります 43,57。 Trask et al.43 は、遺伝子発現を正確かつ再現性よく定量化するには、核成分を除外するか、少なくとも細胞質画分とは別に分析する必要があると述べています。全 RNA の 10 ～ 15% に相当する核 RNA が含まれると 42、mRNA プロファイルが歪み、かなりのレベルの偽陽性に寄与することが報告されています。その研究では、変動性または確率的発現を伴う核転写産物のサブセットを除外することにより、全細胞画分を使用した場合には見逃されていた、または統計的に有意ではなかったであろう差次的に発現された遺伝子が回収されたと主張した。

全体として、細胞全体と ATAC-SN 画分の比較 (FDR < 0.05) 内で、トランスクリプトームの高い重複 (90.7%; R = 0.94) が検出されました。これは全トランスクリプトームの小さな割合に相当しますが、私たちはその違いの要因を調査しました。全細胞画分と比較して、核が存在しないATAC-SNには全体的により多くの下方制御された遺伝子が存在した。 ATAC-SN で枯渇した少数の転写物は、核分裂、核膜、ヒストン修飾、染色体構成、糖タンパク質など、核に関連する生物学的プロセスと分子機能の過剰表現を示します。これは驚くべきことではありませんが、そのコンパートメントは技術的に除外されているため、DE として表示されますが、これらの転写物にリンクされたプロセスが存在します。核から細胞質への輸送速度は、両方のコンパートメントで検出される転写物のレベルに影響を与える可能性があり、タンパク質の生産に直ちに必要ではない mRNA 分子は核内に保持されることが報告されています 57,58。哺乳動物における転写は、mRNA 生成の確率的バーストとそれに続くプロモーター静止の間隔を伴うパルス的なプロセスであることが証明されており 59、mRNA の区画化は細胞質におけるこれらの転写変動、そして最終的にはタンパク質レベルを緩衝するように作用します 58。不完全にスプライスされた 60、成熟またはハイパー編集された mRNA 61 の核保持も、遺伝子制御において重要な役割を果たし、細胞がストレス、ウイルス感染、または変化する環境刺激に迅速に応答できるようにします 62,63。提案された核内滞留モデルは、ATAC-SN 画分における転写物の適度な減少を説明できる可能性がある。さらに、細胞質内で本質的に分解速度が高い転写物は、全細胞画分よりも細胞質内で検出される量が少ない場合があります。同様に、細胞分画全体に対する ATAC-SN の転写物の濃縮は、細胞質内での高い安定性と低い転写速度に起因すると考えられます。逆に、Zaghlool et al.44 と一致して、サイトゾル由来の ATAC-SN 画分には、核にコードされたミトコンドリアタンパク質 (NEMP) の濃縮が示されました。 NEMP の mRNA は、ミトコンドリアで翻訳が必要になるまで細胞質に蓄積することが知られており 64、他のタンパク質をコードする転写物と比較して著しく長い mRNA 半減期を有しており、このことは NEMP が ATAC-SN に優先的に長時間局在することを裏付けています。それにもかかわらず、我々のデータは、転写産物の大部分が 2 つのコンパートメントにおける存在量の同等の表現を示すことを強く示唆しています。私たちの結果は、ATAC-SN に由来するトランスクリプトームが全細胞ライセートのトランスクリプトームを世界レベルで厳密に再現していることを示しており、ATAC-SN と RNAseq を組み合わせたワークフローを使用して遺伝子制御と発現レベルを高解像度で表示する実現可能性と信頼性を実証しています。バイオバンク化された細胞。これは、ほとんどの転写産物について、選択的な細胞局在化も RNA の安定性も細胞内での分布を損なわないことを示しています。

適度なサンプルサイズがこの研究の潜在的な制限である可能性があることを我々は認識していますが、バイオバンク材料から回収されたヒト初代細胞に対してATAC-seqを使用してクロマチンアクセス可能性をプロファイリングする高い実現可能性と信頼性を実証します。これらの実験は 50,000 個の細胞を使用して実行されましたが、他の研究では 25,000 個という少ない細胞を使用して同様の結果が得られました (データは示されていません)。さらなる制限は、健康な個人からのサンプリングの倫理的影響により、正常組織サンプルに対するこれらのオミクスアプローチの再現性を調べることができなかったことであり、おそらく腫瘍生検がこれをテストするための代替リソースを提供し、代替となるでしょう。しかし、私たちの研究は、凍結保存が凍結保存された初代Treg細胞の細胞応答、クロマチンランドスケープ、およびエピジェネティックサイン（遺伝子アクセス可能性シグナルおよびTF占有）を損なわないことを示しており、このプロトコルは同様の細胞を扱う研究グループによって使用できることを示しているため、重要です。興味の種類。

結論として、これらの発見は、限られた入力材料を使用してリソースからクロマチンのアクセス可能性とトランスクリプトームを同時に取得することを目的とした研究に重要な意味を持ち、単一細胞技術に関連する深さ、分解能、およびコストがバルクアプローチと同じになるまで、依然としてバイオバンク化された材料を使用し、並行して発見を実行できるワークフローが必要になる可能性があります。凍結材料からのデータが新たに単離された細胞を正確に反映していることがわかっているため、これらの技術を疾患コホートのバイオバンク材料に適用することで、この発見が疾患の分子プロファイルに関する貴重な機構に関する洞察を提供し、新しい治療標的や個別化医療への扉が開かれるという確信が得られます。

全血サンプルは、36 歳から 57 歳までの 4 人の健康な成人男性ドナーからインフォームドコンセントを得て収集されました。サンプルは特定不可能であり、研究の一環として個人情報は収集されませんでした。この研究は、女性と子供の健康ネットワーク-ヒト研究倫理委員会 (WCHN-HREC) によって承認されました (承認コード: HREC/19/WCHN/65、承認日: 2019 年 6 月 11 日)。すべての方法は関連する規則に従って実行されました。ガイドラインと規制。 PBMC は、Ficoll-Paque 溶液を使用した密度勾配遠心分離によって、健康な成人ドナーから得た新鮮な全血から単離されました。簡単に説明すると、ヘパリン含有チューブに採取した血液サンプルをリン酸緩衝生理食塩水で 1 倍に希釈し、希釈した血液サンプル 35 mL を 50 mL Falcon チューブ内の Ficoll-Paque™ PLUS 15 mL に重ね、800 xg で遠心分離しました。ブレーキをオフにしたスイングバケットローターで20分間。間期の単核細胞層を50 mLコニカルチューブに移し、PBSを最終体積50 mLまで補充した。ＰＢＭＣを、ブレーキをオンにして室温で５００×ｇで１０分間遠心分離することによって２回洗浄した。 PBMC は 2 つのグループに分けられ、半分は新鮮な処理用、もう半分は凍結/バイオバンキング用でした。凍結するサンプルを 1 mL の凍結培地 (10% DMSO を含む熱不活化 FCS) に 1 × 107 細胞/mL の濃度で再懸濁し、2 mL クライオバイアルに移し、Mr. Frosty™ 凍結コンテナに置きました。 -1 °C/分の速度で - 80 °C まで徐々に凍結します。次に、長期保存のためにクライオバイアルを液体窒素に移しました。

凍結保存した PBMC を液体窒素から取り出し、37 °C の水浴で 10 分間解凍しました。解凍した PBMC を 10 mL コニカルチューブに移し、あらかじめ温めておいた完全 X-VIVO 15 培地 (2 mM HEPES pH 7.8、2 mM L-グルタミンおよび 5% 熱を添加した X-VIVO 15 無血清培地) で希釈しました。不活化ヒト血清）を 1 mL/5 秒の速度で加えます。細胞懸濁液を含む10 mLコニカルチューブを静かに反転させて混合し、室温で10分間500 xgで回転させ、合計2回洗浄した。次に細胞を、あらかじめ温めておいた完全 X-VIVO 15 培地に 3 ～ 4 × 106/mL で再懸濁しました。解凍後、FACS の前に、PBMC を 24 ウェル培養プレート内の完全 X-VIVO 15 培地で一晩かけて回復させました。

培養物中で一晩放置した後、新たに単離または解凍したPBMCを、2% FCSを補充したPBS中で500 xg、室温で10分間洗浄した。細胞を以下の蛍光色素結合抗ヒトモノクローナル抗体で標識しました:抗 CD4 (BD Biosciences、BUV395 マウス抗ヒト)、抗 CD25 (BD Biosciences、BV421)、抗 CD127 (BD Biosciences、PE-CF594) FACS 分析用の生存率色素 (BD Biosciences、BD Horizon Fixable Viability Stain 700)。 BD FACSAria Fusion フローサイトメーターを使用して、Treg 細胞を CD4+ CD25hi CD127dim 集団として単離しました。分離された集団の一部をフローサイトメトリーによって細胞純度について分析しました。細胞選別後、Treg 細胞を 96 ウェル U 底プレートにウェルあたり 100,000 細胞でプレーティングし、完全 X-VIVO 15 培地 (2 mM HEPES pH 7.8、2 mM L-グルタミンを補充した X-VIVO 15 培地) で維持しました。 ATAC-seq および RNA-seq 実験のための細胞調製前に、500U/mL 組換えヒト IL-2 の存在下、加湿 5% CO2 インキュベーター内で 37 °C で 2 時間培養しました。

ソーティング後の 2 時間の回復後、Treg 細胞を未処理のまま放置するか、完全 X で抗 CD3 および抗 CD28 抗体を結合させたビーズ (Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28、Gibco no. 11141D、Life Technologies) で刺激しました。 - 500U/mL 組換えヒト IL-2 の存在下、細胞/ビーズ比 1:1 で 48 時間 VIVO 15 を培養。 48時間後、Dynabeadsを磁気分離により培地から除去した。

新鮮なサンプルと解凍したサンプルを以下の蛍光結合抗体 (CD25-BV421、CXCR3-BV650、CCR6-BV786、CCR10-BB515、CD127-PE-CF594、CCR4-PE-Cy7、FOXP3-AF647 (PCT)、CD45RA-) で染色しました。 APC-H7）とLIVE/DEAD識別色素dye-AF700。その後、新鮮なサンプル (n = 4) および解凍したサンプル (n = 4) からの生存可能な CD4+ T 細胞イベント (280,000) が t-SNE 分析用にエクスポートされました。使用されるマーカーは、ケモカイン受容体を使用して従来型 T (Tconv) 細胞と制御性 T (Treg) 細胞の両方の異なる部分集団を決定するように設計された、定義された表現型パネルです。 Treg 細胞は、CD25+、CD127lo、および FOXP3+ の発現から定義されました。 CD45RA は、ナイーブ T 細胞 (CD45RA+) とメモリー T 細胞 (CD45RA-) を識別するために使用されます。ケモカイン受容体 CXCR3、CCR4、CCR6、CCR10 は、ヘルパー系統亜集団 Th1、Th2、Th17、Th22 で発現することが知られており、同様のパターンで Treg 細胞でも見られることが知られているため含まれます。ファイル連結前に、FOXP3 発現を平均蛍光強度 (MFI) から各ファイルの最大 MFI のパーセンテージ (「PCT」と指定) に変換しました。 CD25、CXCR3、CCR6、CCR10、CD127、CCR4、FOXP3(PCT)、CD45RA の MFI は、合計 (1.12 × 106) CD4+ T 細胞イベントデータセットに対する t-SNE 機械学習に使用されました。データセットは、次の設定のパープレキシティ 50 および Barnes-Hut 近似 0.5 で tSNE 方程式を 700 回反復する前に、100,000 イベントまでインターバルダウンサンプリングされました。ダウンサンプリングの結果生じる非サンプリングのイベントが推定され、100,000 のイベントでプロットされました (FCS Express v6)。これにより、非サンプリングイベントを最も近いサンプリングイベントにマッピングして、t-SNE 計算に参加できるようになります。細胞集団クラスターは、蛍光マーカーの分布と組み合わせから決定されました。

Omni ATAC-seq は、若干の変更を加えて前述のように実行されました 32。簡単に言うと、ATAC-seq実験の前に、細胞を200U/μLのDNase（Worthington）で37℃で30分間前処理しました。血球計数器を使用して手動で細胞数を計測し、50,000 個の Treg 細胞を 0.1% NP40、0.1% Tween を添加した 50μL の冷再懸濁緩衝液 (RSB: 10 mM Tris-HCl pH 7.4、10 mM NaCl、および 3 mM MgCl2) に溶解しました。２０、および０．０１％ジギトニンを氷上で３分間放置した。溶解直後、反応物を、4℃、500×gで10分間遠心分離することにより、0.1% Tween-20を含むATAC-seq RSB 1 mLで洗浄しました。核のペレット化後、上清を収集し、3 倍量の TRIzol LS 試薬 (Invitrogen、10296010) を上清に添加し (5 本の 1.5 mL エッペンドルフチューブに分割)、RNA-seq 実験のために -80 °C で保存しました。核を50μLの転位混合物(30μLの2×TD緩衝液、3.0μLのTn5トランスポザーゼ、16.5μLのPBS、0.5μLの1%ジギトニンおよび0.5μLの10%Tween-20)に再懸濁した。 TD バッファーと Tn5 トランスポザーゼは Illumina Inc. から購入しました。転移反応は、1000 rpm で混合するサーモミキサー内で 37 °C で 45 分間インキュベートしました。反応物は、Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (D4014) キットを使用して精製しました。その後の ATAC-seq ライブラリーの調製は、記載どおりに実行されました 32。すべてのライブラリーを合計 9 PCR サイクルで増幅し、配列決定前に 100 ～ 800 bp のフラグメントサイズウィンドウを含めるために SPRIselect (Beckman Coulter) を使用してサイズ選択を実行しました。バーコード化ライブラリをプールし、ペアエンド 75 サイクル Illumina NextSeq 550 高出力プラットフォームで、サンプルあたり 3,720 万リード (± 600 万) の平均読み取り深度までシーケンスしました (補足表 1)。

RNA-seq プロファイルは、4 人の個体の Omni ATAC-seq 溶解反応 (ATAC-SN) からの 50,000 個の全細胞 (休止および刺激された Treg 細胞) および上清画分 (刺激された Treg 細胞のみ) から収集され、そのうち 3 人は一致する ATAC-seq を持っていました。プロフィール。 TRIzol LS試薬(Invitrogen、10296010)を使用してサンプルをホモジナイズし、miRNeasy Micro Kit(Qiagen、カタログ番号217084)を使用して全RNAを抽出した。 RNA の完全性は、Agilent バイオアナライザーを使用する Agilent RNA 6000 Pico Kit によって測定されました。 RNA 完全性数 (RIN) > 7.5 のサンプルを mRNA シーケンスに使用しました。 Illumina (New England) 用 NEBNext Ultra Directional II RNA ライブラリー調製キットを使用して cDNA ライブラリーを生成する前に、NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (New England Biolabs #E7490) を使用して RNA サンプルの Poly(A) RNA を濃縮しました。 Biolabs #E7760S）製造元のプロトコールに従ってください。バーコード化されたライブラリーをプールし、ペアエンド 150 サイクル Illumina Hiseq X シーケンサーでサンプルあたり 3,750 万リード (± 1,600 万) の平均読み取り深度までシーケンスしました。

ATAC-seq データ解析には次のツールとバージョンを使用しました。 FastQC ver. 0.11.7、Samtools バージョン 1.3.1、ピカード版。 2.2.4、Bowtie2 バージョン 2.2.9、MACS2 バージョン 2.1.2、BEDTools バージョン 2.25.0、ベッドマップver 2.4.36、サブリードver. 1.5.2.

シーケンスデータの品質は、FastQC (バージョン 0.11.7) を使用して決定され、続いて Cutadapt (バージョン 1.14) を使用して Nextera アダプターをトリミングしました。トリミングされたリードは、「-X 2000」設定の Bowtie2 (ver. 2.2.9) を使用して GRCh37 ゲノムにアラインメントされました。各サンプルについて、Samtools ver. 2 を使用して、オプション '-q 10' を使用して、マップされていないリードと非プライマリマップされたリードをオプション '-F 2828' でフィルタリングして、品質トリミングを実行しました。 1.3.1. 次に、Picard ver. を使用して、一意にマッピングされたペアリードをフィルタリングして PCR 重複を除外しました。 2.2.4. BEDTools を使用して、ミトコンドリアのリード、ENCODE hg19 ブラックリスト領域 (複数のゲノムアッセイおよび細胞タイプにわたって異常な高シグナルを持つ領域) およびミトコンドリアのブラックリスト領域 (ミトコンドリアゲノムとの配列相同性による核ゲノム上の高シグナル領域) へのリードマッピングを除外しました。バージョン 2.25.0。フィルタリング後、サンプルあたり 2,800 万リード (± 300 万) リードの中央値が得られました。ピークコーリングおよび TF フットプリントについては、Tn5 トランスポザーゼ結合イベントの中心を表すように読み取り開始部位を調整しました。 Tn5 トランスポザーゼは二量体として結合し、9 bp65 離れた 2 つのアダプターを挿入するため、順方向鎖にアラインメントするすべてのリードは + 4 bp オフセットされ、逆方向鎖にアラインメントするすべてのリードは - 5 bp オフセットされます。

静止 Treg サンプルと刺激 Treg サンプル間のアクセスの違いを考慮して、静止 Treg サンプルと刺激 Treg サンプルのいずれかからの新鮮サンプルと凍結サンプルを表す処理済み ATAC-seq リードを連結しました。ピークは、MACS2 バージョンを使用してマージされた bam ファイルから呼び出されました。 2.1.266 パラメータ「callpeak -f BAMPE -g hs -nolambda -min-length 100 -max-gap 50 -call-summits -bdg -keep-dup all -p 0.1」。各ピークセットについて、重複するピークは BEDTools ver. を使用してマージされました。 2.25.0 を使用し、各ピークへの個々のサンプル/ドナーマッピングのリード数は、両端が正常に位置合わせされたフラグメント (-B) と、最大のオーバーラップを持つフィーチャに割り当てられた複数のフィーチャと重複するリードを持つフラグメントのみを考慮して、featureCounts67 を使用して計算されました ( -最大のオーバーラップ)。次に、カウントデータを R にインポートし、edgeR68 を使用して処理し、3 つを超えるサンプルで 100 万あたり 3 カウント未満のピークを除去しました。カウントはサンプルライブラリサイズに対して正規化され、共通分散、傾向分散、およびタグごとの分散が計算されました。差分アクセシビリティ分析は、limma package69 の voom を使用して実行されました。有意な差次的アクセシビリティは、Benjamini-Hochberg FDR が 0.05 未満であり、倍率変化が 1.5 を超える領域として定義されました。 IGV版 2.5.2 (Broad Institute) および UCSC ゲノムブラウザ (University of California Santa Cruz) を、ATAC および RNA-seq トラックの視覚化に使用しました。 ChIPpeakAnno70を使用して、ピークに最も近いTSSに注釈を付けました。 HINT-ATAC40 は、パラメーター「-atac-seq -paired-end -organism = hg19」を使用して、ATAC-seq データから ATAC-seq ピークの下のフットプリントを呼び出すために使用されました。

すべての RNA-seq サンプルは、デフォルトのパラメーターを使用して FastQC v0.11.7 (Babraham Institute) を使用して、一貫した品質について最初に検証されました。パラメータ「-minquality 30 -minlength 50」を指定したAdapterRemoval/2.2.1を使用して、生の読み取りをトリミングしてアダプターと低品質の塩基を削除しました。続いて、アダプターおよび品質でトリミングされたリードを、パラメータ「-b 50 および -fr-steaded」を指定した Kallisto を使用して GRCh38 ヒトゲノムに対して擬似アラインメントしました。簡単に言うと、生のカウントをインポートしてフィルタリングし、発現が低いか発現していない遺伝子 (すべての実験グループで 100 万あたり 2 カウント未満) を除去しました。差次的発現は、limma package69 の voom を使用して計算され、Benjamini-Hochberg 誤発見率 (FDR) が 0.05 未満であり、倍率変化が 1.5 を超える遺伝子は (特に指定がない限り) 有意であると見なされます。データは ggplot2 (ver. 3.0.0) を使用して視覚化されました。

現在の研究中に生成および分析されたデータセットは、アクセッションコード PRJEB55015 で European Nucleotide Archive (ENA) リポジトリから入手できます。

Ｃ．Ｙ．ブラウンら。制御性 T 細胞の自己、環境、宿主組織への適応に関する分子的洞察: 自己免疫疾患における可塑性または機能喪失。フロント。イムノール。 1269 年 11 月 (2020 年)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Klemm, SL、Shipony, Z. & Greenleaf, WJ クロマチンのアクセシビリティと調節エピゲノム。ナット。ジュネ牧師。 20(4)、207–220 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

サーマン、RE 他。アクセス可能なヒトゲノムのクロマチンランドスケープ。 Nature 489(7414)、75–82 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ダナム、I.ら。ヒトゲノムの DNA 要素の統合百科事典。 Nature 489(7414)、57–74 (2012)。

記事 ADS CAS Google Scholar

ブエンロストロ、JD et al. ATAC-seq: ゲノム全体のクロマチンのアクセス可能性をアッセイする方法。カー。プロトック。モル。バイオル。 109、21–29 (2015)。

論文 PubMed Central Google Scholar

ブエンロストロ、JD et al. 開いたクロマチン、DNA 結合タンパク質、ヌクレオソームの位置の迅速かつ高感度なエピゲノムプロファイリングのためのネイティブクロマチンの転位。ナット。メス。 10(12)、1213–1218 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

クサノビッチ、DA et al. 組み合わせ細胞インデックスによるクロマチンのアクセス可能性の多重単一細胞プロファイリング。サイエンス (ニューヨーク州ニューヨーク) 348(6237)、910–914 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

ブエンロストロ、JD et al. 単一細胞クロマチンのアクセス可能性は、制御変動の原理を明らかにします。 Nature 523(7561)、486–490 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マサラット、AR et al. バルクおよび単一細胞の ATAC-seq から単一ヌクレオチドのバリアントとインデルを発見します。核酸研究所 49(14)、7986–7994 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moore, LD, Le, T. & Fan, G. DNA メチル化とその基本機能。神経精神薬理学 38(1)、23–38 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Gibney、ER & Nolan、CM エピジェネティクスと遺伝子発現。遺伝 105(1)、4–13 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アフマディ、M.ら。自己免疫疾患のエピジェネティック修飾およびエピジェネティックに基づく薬物療法の実施。バイオメッド。薬剤師。 87、596–608 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

シャラー、CD et al. バイオバンク化された標本上の ATAC-seq は、ナイーブ SLE B 細胞における独特のクロマチン接近構造を定義します。科学。議員 6、27030 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

藤原伸ほか凍結保存された乳房細胞株および組織から回収された高品質の ATAC-seq データ。科学。議員9(1)、516-516 (2019)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

ミラニ、P.ら。ヒト人工多能性幹細胞由来の運動ニューロンのATAC-Seqに適した細胞凍結プロトコル。科学。議員第 6 号、25474 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ハルステッド、MM et al. 家畜組織からの凍結保存された核標本中の開いたクロマチンをプロファイリングするための ATAC-seq の体系的な変更。科学。議員 10(1)、5230 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barwick、BG et al. クロマチンのアクセシビリティにより、多発性骨髄腫における遺伝子発現と疾患の転帰を予測する制御要素が特定されます。クリン。がん研究所 27(11)、3178–3189 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シャノン、J.ら。新鮮なおよび凍結保存されたヒト卵胞からのクロマチンアクセシビリティ分析。モル。ハム。リプロド。 28(6)、gaac020 (2022)。

記事 Google Scholar

ロックス、D. et al. マウスおよびヒトの脳における細胞型特異的なクロマチンアクセシビリティ分析。エピジェネティクス 17(2)、202–219 (2022)。

記事 MathSciNet PubMed Google Scholar

Cretney, E.、Kallies, A. & Nutt, SL Foxp3 エフェクター制御性 T 細胞の分化と機能。トレンド免疫。 34(2)、74–80 (2012)。

論文 PubMed Google Scholar

グルザンカ、J. et al. FoxP3、Helios、および SATB1: 制御性 T 細胞における役割と関係。内部。免疫薬。 16(3)、343–347 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Fu、W.ら。多重冗長遺伝子スイッチは、制御性 T 細胞の転写サインを「ロックイン」します。ナット。イムノール。 13(10)、972–980 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ミルズ、KHG 制御性 T 細胞: 感染に対する免疫における敵か味方か? ナット。イミュノール牧師。 4(11)、841–855 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アギリ、B.ら。 1 型糖尿病における制御性 T 細胞のサプレッサー機能の変化。イラン。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 12(4)、240–251 (2015)。

MathSciNet PubMed Google Scholar

Ohl, K. & Tenbrock, K. 全身性エリテマトーデスにおける制御性 T 細胞。ユーロ。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 45(2)、344–355 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hori, S.、野村, T. & 坂口, S. 転写因子 Foxp3 による制御性 T 細胞発生の制御。サイエンス 299(5609)、1057–1061 (2003)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Alzabin, S. & Williams, RO 関節リウマチにおけるエフェクター T 細胞: 動物モデルからの教訓。 FEBSレター。 585(23)、3649–3659 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

健康、ヒトバイオバンクのためのGOWADOガイドライン、遺伝子研究データベースおよび関連データ。 2010年; http://www.health.wa.gov.au/circularsnew/circular.cfm?Circ_ID=12748 から入手できます。

コッポラ、L. et al. ヘルスケアにおけるバイオバンキング: 進化と将来の方向性。Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．医学。 17(1)、172 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ペンノ、MAS et al. 膵島自己免疫の環境決定因子 (ENDIA): 1 型糖尿病のリスクのある小児を対象とした妊娠から幼少期までのコホート研究。 BMC小児科。 13(1)、124 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ホープ、CM 他血液処理と低細胞数サンプルの末梢血単核球凍結保存の最適化。内部。Ｊ．Ｍｏｌ．科学。 22(17)、9129 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corces, MR et al. 改良された ATAC-seq プロトコルによりバックグラウンドが低減され、凍結組織の検査が可能になりました。ナット。方法 14、959 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corces, MR et al. 改良された ATAC-seq プロトコルによりバックグラウンドが低減され、凍結組織の検査が可能になりました。 Nat Meth 14(10)、959–962 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

シェップ、ANら。構造化ヌクレオソームフィンガープリントにより、調節領域内のクロマチン構造の高解像度マッピングが可能になります。ゲノム研究所 25(11)、1757–1770 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ゲート、RE 他ヒト全体の活性化 T 細胞における同時アクセス可能なクロマチン領域の遺伝的決定因子。ナット。ジュネット。 50(8)、1140–1150 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Calderon, D. et al. 多様なヒト免疫細胞にわたる刺激応答性クロマチンの状況。ナット。ジュネット。 51(10)、1494–1505 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

フェラーロ、A. et al. ヒト制御性 T 細胞の個人差。手順国立アカド。科学。 111(12)、E1111–E1120 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スタークス、RRら。異なるプロモーターへのアクセス性と遺伝子発現プロファイルを組み合わせた解析により、組織特異的な遺伝子と積極的に抑制されたネットワークが特定されます。エピジェネット。クロマチン 12(1)、16 (2019)。

記事 Google Scholar

Reske、JJ、Wilson、MR、Chandler、RL ATAC-seq 正規化手法は、差分アクセシビリティ分析と解釈に大きな影響を与える可能性があります。エピジェネット。クロマチン 13(1)、22 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

リー、Ｚら。 ATAC-seqを用いた転写因子結合部位の同定ゲノムバイオル。 20(1)、45 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Duan、J. et al. ヒトリンパ芽球様細胞株における RNA 安定性の個人差のゲノムワイドな調査。科学。議員 3(1)、1318 (2013)。

記事 ADS MathSciNet PubMed PubMed Central Google Scholar

Barthelson、RA et al. ヒト細胞における全体的な遺伝子発現に対する核および細胞質コンパートメントの寄与の比較。 BMC ゲノミクス 8(1)、340 (2007)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

トラスク、HWら。細胞質 RNA と全細胞 RNA のマイクロアレイ分析により、かなりの数のミスポジティブ mRNA と偽陽性 mRNA が明らかになります。 RNA 15(10)、1917–1928 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zaghlool、A. et al. ヒトの脳組織における核およびサイトゾルのトランスクリプトームの特性評価により、RNA 転写物の細胞内分布についての新たな洞察が明らかになりました。科学。議員 11(1)、4076 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Calvo、SE、Clauser、KR、Mootha、VK MitoCarta20: 哺乳類ミトコンドリアタンパク質の最新の目録。核酸研究所 44(D1)、D1251-7 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

トラック、J. et al. 末梢血単核球 (PBMC) の凍結保存が抗原特異的メモリー B 細胞 ELISpot の変動に及ぼす影響。ハム。ワクチン。免疫力のない人。 10(8)、2490–2496 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ワインバーグ、A.ら。 T 細胞の機能的および表現型の特性評価のための、凍結保存された末梢血単核球の使用の最適化と制限。クリン。ワクチン免疫。 CVI 16(8)、1176–1186 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

セラ、V.ら。複数回の凍結融解サイクルがヒト初代リンパ球の生存と機能に及ぼす悪影響を定量化します。内部。Ｊ．Ｍｏｌ．科学。 https://doi.org/10.3390/ijms24010634 (2023)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

サトパシー、AT et al. ヒト免疫細胞の発生と腫瘍内 T 細胞枯渇の、大規模に並行した単一細胞クロマチンの状況。ナット。バイオテクノロジー。 37(8)、925–936 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シュミーデル、BJ et al. ヒト免疫細胞の遺伝子発現に対する遺伝子多型の影響。セル 175(6)、1701-1715.e16 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

そう、CJら。ヒト T 細胞活性化における集団変異と自己免疫遺伝学の交差点。サイエンス 345(6202)、1254665 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Taliaferro, JM、Wang, ET & Burge, CB RNA 局在のゲノム解析。 RNAバイオル。 11(8)、1040–1050 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Martin, KC & Ephrussi, A. mRNA 局在化: 空間次元での遺伝子発現。セル 136(4)、719–730 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuersten, S. & Goodwin, EB 3' UTR の力: 翻訳制御と開発。ナット。ジュネ牧師。 4(8)、626–637 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang, T. et al. RNALocate: RNA の細胞内局在に関するリソース。核酸研究所 45(D1)、D135–D138 (2017)。

ADS CAS PubMed Google Scholar

パストロ、L.ら。核区画化は、クルーズトリパノソーマにおける病期特異的な遺伝子発現制御に寄与する。フロント。セル開発バイオル。 5、8 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ソルネスタム、BW et al. 全 mRNA と細胞質 mRNA を比較すると、核保持と miRNA による全体的な制御が明らかになります。 BMC ゲノミクス 13、574–574 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bahar Halpern、K. 他哺乳類組織における mRNA の核内滞留。 Cell Rep. 13(12)、2653–2662 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Darzacq, X. et al. RNA ポリメラーゼ II 転写の in vivo ダイナミクス。ナット。構造体。モル。バイオル。 14(9)、796–806 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boutz, PL、Bhutkar, A. & Sharp, PA 滞留イントロンは、転写後にスプライシングされたイントロンの新規で広く普及しているクラスです。遺伝子開発 29(1)、63–80 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, LL & Carmichael, GG ヒト胚性幹細胞における逆方向反復を含む mRNA の核内保持の変化: 核非コード RNA の機能的役割。モル。細胞。 35(4)、467–478 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

プラサント、KV et al. RNA 核保持による遺伝子発現の制御。セル 123(2)、249–263 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

宮本裕也ほか細胞ストレスはインポーチンアルファの核内蓄積を誘導し、従来の核内輸送ブロックを引き起こします。Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ． 165(5)、617–623 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Couvillion、MT et al. 同期したミトコンドリアおよびサイトゾル翻訳プログラム。 Nature 533(7604)、499–503 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adey、A. et al. 高密度インビトロ転位によるショットガンフラグメントライブラリの迅速、低入力、低バイアス構築。ゲノムバイオル。 11(12)、R119–R119 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gaspar, J.、MACS2 によるピークコールの改善。 2018年。

Liao, Y.、Smyth, GK & Shi, W. featureCounts: シーケンスリードをゲノム特徴に割り当てるための効率的な汎用プログラム。バイオインフォマティクス 30(7)、923–930 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Robinson, MD、McCarthy, DJ & Smyth, GKedgeR: デジタル遺伝子発現データの差次的発現解析のための Bioconductor パッケージ。バイオインフォマティクス (イギリス、オックスフォード) 26(1)、139–140 (2010)。

CAS PubMed Google Scholar

ロー、CW et al. voom: 精密重みにより、RNA-seq リード数の線形モデル解析ツールが利用可能になります。ゲノムバイオル。 15(2)、R29 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

朱、ＬＪら。 ChIPpeakAnno: ChIP-seq および ChIP-chip データに注釈を付けるための Bioconductor パッケージ。 BMCバイオインフォーム。 11(1)、237 (2010)。

記事 Google Scholar

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採血にご協力いただいた Benjamin Ramoso、Alison Gwiazdzinski、Sarah Beresford (ENDIA Study、WCH) に感謝します。この研究のために血液を提供することに同意してくださったボランティアの皆様に感謝いたします。細胞単離とフローサイトメトリーの専門知識については Randall Grose 博士 (SAHMRI Research and Core Facilities)、Stephen Wilcox 博士 (WEHI Genomics Hub)、および Illumina シーケンスについては Genewiz に感謝します。また、ATAC-seq ライブラリーの調製とシーケンスの実験手順を改善するための専門知識とアドバイスをくださった Kristian Handler 博士 (DZNE) と Simone Picelli 博士 (IOB) にも感謝します。この研究の一部は、膵島自己免疫の環境決定因子 (ENDIA) 研究によって支援されました。 ENDIA 研究は、オーストラリア連邦の Medical Research Future Fund の下での加速研究助成金の受領者である JDRF Australia によって支援され、The Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust (助成金番号 3-SRA-2020) からの資金提供を受けました。 -966-MN)。さらに、この助成金の一部は、女性と小児病院研究財団の助成金 (サドロンおよびバリー) からも資金提供されました。

アデレード大学ロビンソン研究所、アデレード、オーストラリア

イン・Y・ウォン、ジェシカ・E・ハービソン、クリストファー・M・ホープ、バトジャルガル・グンサンブー、キャサリン・A・ブラウン、スーン・W・ウォン、シェリル・Y・ブラウン、ジェニファー・J・クーパー、ジミー・ブリーン、ニン・リウ、スティーブン・M・ペダーソン、ティモシー・サドロン& サイモン・C・バリー

ドイツ神経変性疾患センター、ボン大学、ボン、ドイツ

マレン・コーン、カトリン・クレー、ヨアヒム・シュルツェ、マルク・バイエル

女性および小児病院、ノース・アデレード、オーストラリア

ジェシカ E. ハービソン、クリストファー M. ホープ、シェリル Y ブラウン、ジェニファー J. クーパー、ティモシーサドロン & サイモン C. バリー

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YYW は NGS データの取得、解釈、原稿の執筆に貢献しました。 CMH は、フローサイトメトリー免疫細胞表現型データの取得と解釈に貢献しました。 JEH と JJC はバイオバンキング手法に貢献しました。 BG と CB は、細胞培養方法とデータの解釈に貢献しました。 YYW は、JB、NL、SMP、SWWKAB の支援と指導を受けてデータ分析を実行し、原稿の改訂に貢献しました。 MB、JS、MK、KK は、ATAC-seq ライブラリーの準備とデータ分析のトレーニングを提供しました。 TS と SCB は実験を監督し、データの解釈と原稿の重要な改訂に貢献しました。 SCB はプロジェクトを指揮し、資金調達やその他のリソースを提供しました。

サイモン・C・バリーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

ウォン、YY、ハービソン、JE、ホープ、CM 他凍結ヒト制御性 T 細胞からのクロマチンアクセシビリティと遺伝子発現ダイナミクスの並行回収。 Sci Rep 13、5506 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-32256-6

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受信日: 2022 年 7 月 15 日

受理日: 2023 年 3 月 24 日

公開日: 2023 年 4 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32256-6

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凍結ヒト制御性 T 細胞からのクロマチン アクセシビリティと遺伝子発現ダイナミクスの並行回復

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