耐熱性ID93 + GLAの安全性と免疫原性 - 南通組織消耗品有限公司

Nature Communications volume 14、記事番号: 1138 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

アジュバントを含むサブユニットワクチンは、結核 (TB) に対する予防法として有望ですが、現在の候補ワクチンは冷蔵保存が必要です。ここでは、ID93 + GLA-SE ワクチン候補の熱安定性凍結乾燥シングルバイアルの安全性、忍容性、免疫原性を非耐熱性 2 ワクチン候補と比較して評価したランダム化二重盲検第 1 相臨床試験 (NCT03722472) の結果を紹介します。 -健康な成人におけるバイアルワクチン投与。参加者は、56日間隔で2回のワクチンを筋肉内投与した後、一次、二次、探索的エンドポイントについてモニタリングされた。主要エンドポイントには、局所的および全身的な反応原性および有害事象が含まれました。副次評価項目には、抗原特異的抗体 (IgG) および細胞性免疫応答 (サイトカイン産生末梢血単核細胞および T 細胞) が含まれていました。どちらのワクチンも安全で忍容性が高く、強力な抗原特異的血清抗体および Th1 型細胞性免疫応答を誘発します。非熱安定性ワクチン製剤と比較して、熱安定性ワクチン製剤はより多くの血清抗体反応 (p < 0.05) とより多くの抗体分泌細胞 (p < 0.05) を生成します。この研究では、熱安定性ID93 + GLA-SEワクチン候補が健康な成人において安全で免疫原性があることを示します。

結核（TB）は罹患率と死亡率の主な感染原因であり、2020年には世界で150万人が死亡、1,000万人の新規感染を引き起こした。新規感染者の3分の2は8か国（インド、中国、インドネシア、フィリピン、パキスタン、ナイジェリア、バングラデシュ、南アフリカ）1. 100 年以上にわたり、結核疾患の予防のために広く配布されてきたワクチンは 1 つだけです (カルメットゲラン桿菌、つまり BCG)。このワクチンの結核予防効果は限定的ですが、小児における結核髄膜炎および粟粒疾患の予防に最も役立ちます2。成人に対するワクチンの有効性、または肺疾患の予防に対するワクチンの有効性はより控えめであり 3、BCG の入手可能性が限られている場合があります 4。

新しい結核ワクチンを開発する取り組みは、ほとんどの場合、ワクチンアジュバントとの組み合わせによって免疫原性を高めた抗原の合理的な選択に依存してきました5。アジュバント添加サブユニット結核ワクチン開発の分野は、第 2b 相臨床試験で M72/AS01E 候補で約 50% の有効性が達成されたことで活性化しています6。他のアジュバントを含むサブユニット結核ワクチン候補も臨床開発中です7。たとえば、ID93 + GLA-SE は、第 2a 相臨床試験で有望な安全性と免疫原性を実証しました8。このような進歩にもかかわらず、熱安定性アジュバント添加サブユニット結核ワクチン候補は臨床開発段階にない。世界中、特に東南アジアとサハラ以南のアフリカにおける結核の多大な負担を考慮すると、熱安定性ワクチンは世界的なワクチン流通に大きな利点をもたらす可能性があります9。

ワクチンの熱安定性を高めるためにさまざまな技術を使用できます10、11。ただし、アジュバントを含むワクチンに熱安定技術を適用すると、かなりの複雑さが加わります 11。たとえば、ワクチンの安定性を高めるために、凍結乾燥や噴霧乾燥などの乾燥技術がよく使用されます。しかし、エマルジョンやアルミニウム塩を含む多くのワクチンアジュバント製剤の活性に固有の粒子構造を維持するには、独自のプロセス開発と特性評価アプローチが必要です。我々は以前、37℃で保存した場合に3か月間安定性を維持したエマルジョンアジュバント添加サブユニット結核ワクチン候補ID93 + GLA-SEの製剤設計、プロセス開発、および凍結乾燥製剤の製造について説明しました12,13。

ここでは、この単一バイアルの凍結乾燥 ID93 + GLA-SE ワクチン候補の安全性、忍容性、免疫原性を評価するために設計された第 1 相ランダム化二重盲検臨床試験の結果を、以前に開発された 2 バイアルのワクチン候補と比較して示します。健康な成人被験者。我々は、ID93 + GLA-SE の耐熱性単一バイアルプレゼンテーションが、非耐熱性 2 バイアルワクチンプレゼンテーションと同様の安全性プロファイルと同等または改善された免疫原性プロファイルを引き出すことを示します。

この研究へのヒト被験者の参加は、2018年10月29日の募集から始まり、2020年6月15日までの追跡調査まで行われた。合計93名の参加者が6か月の募集期間にわたって研究対象としてスクリーニングされ、そのうち48名が試験に参加することができた。研究参加基準に従って、1:1 で 2 つの治療グループにランダム化されました (図 1)。 45 件のスクリーニング不合格のうち、最も一般的な除外理由は、スクリーニング検査値が正常範囲外であること、その他の病状、全身状態が良好でないこと、プロトコールの不遵守でした (図 1)。登録された48人の参加者全員が少なくとも1回の注射を受け（安全集団）、45人の参加者が両方の注射を受け、44人の参加者が計画に従って研究を完了しました（プロトコルごとの集団）。治療グループ 2 (非耐熱性結核ワクチン) の最初の研究注射のみを受けた 3 人の参加者のうち、2 人は追跡調査ができず、1 人は職場で別のワクチンの予防接種が必要とされていたため、対象外となった。 1回の研究注射のみを受けた参加者からのサンプルは、研究56日目以前の免疫原性データ分析に含まれ、その後は両方の研究注射を受けた参加者からのサンプルのみが免疫原性分析に含まれました。追加の研究参加者は研究70日目後に自発的に研究から離脱した。合計45名の参加者が研究421日目に長期追跡訪問を完了した（44名が両方の注射を受け、1名が1回の注射を受けた）。来院や処置の欠席など、その他のプロトコルからの逸脱については、補足情報に記載されています。表 1 は、安全集団に含まれる参加者の人口統計およびその他のベースライン特性をまとめたものです (n = 48)。参加者 48 名中 36 名 (75%) が女性、12 名 (25%) が男性でした。参加者の登録時の年齢は18歳から48歳で、中央値は23歳でした。参加者の平均肥満指数 (BMI) は 24.1 でした。人種には、白人43人（90％）、アジア人2人（4％）、混血2人（4％）、黒人またはアフリカ系アメリカ人1人（2％）が含まれていた。

スクリーニングされた93人の被験者のうち、48人が研究基準を満たし、登録され、2つの治療グループにランダムに割り当てられました。治療グループ 1 は、耐熱性シングルバイアル ID93 + GLA-SE ワクチンを受ける 23 人の参加者で構成されました。治療グループ 2 は、非耐熱性 2 バイアル ID93 + GLA-SE ワクチンを受ける 25 人の参加者で構成されました。安全集団は、少なくとも 1 回の注射を受けた参加者を表します。プロトコルごとの母集団は、計画に従って研究を完了した参加者を表します。

ID93 + GLA-SE ワクチンの両方の投与は、筋肉内 (IM) 投与後の健康な成人参加者において安全で忍容性が良好であることが確認されました。有害事象（AE）のパターン、種類、重症度、頻度は両治療群で同様でした。表 2 は、重症度、研究注射との関連性、および治療グループごとの AE を患った参加者の割合をまとめたものです。 AE は研究参加者全員の 98% で報告されました。 AEに関して報告された最高グレードは、治療グループ1と2の参加者のそれぞれ96%と92%がグレード1、22名と36%がグレード2であった。グレード 3 または 4 の AE、重篤な有害事象 (SAE)、または潜在的な免疫介在性病状 (PIMMC) は報告されませんでした。局所的および全身的な反応原性が一般的でした。ほとんどの参加者は、最も一般的な全身影響として疲労、頭痛、筋肉痛とともに、注射部位の痛みおよび/または圧痛を報告しました。一部の参加者における上気道感染症またはヘモグロビンの減少は、治療に関連しているとは考えられませんでした（補足情報、研究プロトコール）。ほとんどの AE は治療なしで解決し、AE を理由に参加を中止した参加者はいませんでした。したがって、ID93 + GLA-SE ワクチン候補の単一バイアル熱安定性提示は、健康な成人に投与される用量での 2 バイアル非耐熱性ワクチン提示と比較して、同様に安全で忍容性が高いと判断されました。

ID93 に対する IgG 抗体応答を各治療グループで評価しました。血清 IgG 抗体酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) を、総 IgG、IgG1、IgG2、IgG3、および IgG4 について研究 0、14、56、70、84、および 224 日目に収集したサンプルに対して実行しました。 ID93 (Rv1813、Rv2608、Rv3619、および Rv3620) を構成するサブユニットタンパク質についても総 IgG を評価しました。 ID93 特異的 IgG 抗体の血清レベルは、治療計画ごとの平均エンドポイント力価 (MEPT) として、応答率および総 IgG の変化倍率とともに示されます (図 2a-g および補足表 1)。両方の ID93 + GLA-SE 治療グループの参加者は、ベースラインで低レベルのバックグラウンドが検出された、堅牢な ID93 特異的抗体反応を発現しました。 ID93 特異的 IgG 応答は、両方のレジメンで最後のワクチン接種後 6 か月間上昇したままでした。 ID93 特異的な IgG1 および IgG3 応答は、IgG2 および IgG4 応答よりも高かった。 ID93 サブユニット特異的な総 IgG 応答は Rv1813 で最も大きく、次に Rv2608、Rv3620、および Rv3619 が続きました (補足図 1)。すべての場合において、ピークの抗体応答は 2 回目の注射後に観察されました。 ID93 特異的総 IgG の応答率は、ベースラインからの 4 倍の増加に基づいて、研究 70 日目と 84 日目で両治療群で 90 ～ 100% でした (図 2a)。研究 224 日目では、IgG 反応率は 63 ～ 85% の範囲でした (図 2a)。熱安定性の単一バイアルによるプレゼンテーションと非耐熱性の 2 つのバイアルによるプレゼンテーションを比較すると、熱安定性のフォーマットでは、ピーク時点での複数の読み出しにおいて有意に高い抗体応答が誘発されることが示されました。例えば、非耐熱性 2 バイアル製剤と比較して、耐熱性単一バイアル製剤は ID93 特異的 IgG の変化倍率を高めました (研究 70 日目で 190.5 対 33.0 [p = 0.0023]、研究日で 97.4 対 32.2) 84 [p = 0.0495]) (図 2b)、および ID93 特異的 IgG MEPT (研究 70 日目で 10868 対 2583 [p = 0.0061]) (図 2c)。

n = 20 ～ 25 の生物学的に独立したサンプル（治療グループおよび時点に応じて）、補足表 1 を参照。血清抗体反応率は、ELISA で測定したベースラインからの ID93 特異的 IgG の少なくとも 4 倍の増加として計算されました。応答率はフィッシャーの直接確率検定を使用して比較されました。差異は両側検定に基づいて検出され、複数の時点を考慮してボンフェローニ調整を行った p ≤ 0.05 (α = 0.05) でした。 b–i データは、複数の時点を考慮してボンフェローニ調整を行ったウィルコクソン順位和検定を使用して 2 つの治療グループ間で比較されました。 b ELISAで測定した、血清中のID93特異的総IgGのベースラインからの変化倍数。 **p = 0.0023 (研究 70 日目)、*p = 0.0495 (研究 84 日目)。 c ELISAで測定した血清中のID93特異的総IgGのグループMEPTの縦方向プロット。 **p = 0.0061。 d – g ELISAで測定した血清中のグループMEPT ID93特異的IgGサブクラスの縦方向プロット。 d IgG1。 **p = 0.0032 (研究 70 日目)、**p = 0.0040 (研究 84 日目)。 e IgG2。 f IgG3。 g IgG4。 h ELISpot アッセイによって測定された、PBMC サンプル中の ID93 特異的 IgG 分泌細胞の計数。 **p = 0.0085。 i ELISpot アッセイによって測定された、PBMC サンプル中の ID93 特異的 IgG メモリー B 細胞の計数。平均値は記号で表され、エラーバーは平均値の 95% CI を示します。アスタリスクは、多重比較のための補正後のその時点での治療群間の統計的に有意な差 (*p < 0.05、**p < 0.01) を示します。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

PBMC サンプル中の ID93 特異的 IgG 抗体分泌細胞は、研究 0、7、56、および 63 日目に酵素結合免疫スポット (ELISpot) によって評価されました。両方の治療グループのほとんどの時点で反応はベースラインレベル近くに留まりましたが、注目に値するものでした。耐熱性単一バイアルワクチングループにおけるID93特異的IgG抗体分泌細胞の数の増加は研究63日目に測定されましたが、非耐熱性二バイアルワクチングループの反応は低いままでした（図2h）。末梢血単核球 (PBMC) サンプル中の ID93 特異的 IgG メモリー B 細胞も、研究 0、56、84、および 224 日目に ELISpot によって測定されました。IgG メモリー B 細胞は、2 回目の投与から 4 週間後に両方の治療グループで増加しているように見えました。注射したが、反応は研究224日目までにベースラインレベルに戻った(図2i)。したがって、前述の血清 IgG 応答で明らかなパターンと一致して、耐熱性単一バイアルワクチンの提示は、2 回目の免疫化後の非耐熱性 2 バイアルのワクチン提示と比較して、ID93 特異的 IgG 分泌形質細胞を有意に増加させました。

粘膜 ID93 特異的 IgA 応答は、研究 0、70、および 224 日目に鼻腔スワブおよび涙サンプルを使用して ELISA によって評価されました。ただし、粘膜サンプルにおける ID93 特異的 IgA 応答は、両方の治療グループのすべての時点でベースラインレベルに留まりました（補足図2a、b)。同様に、PBMCサンプル中のID93特異的IgA抗体分泌細胞およびIgAメモリーB細胞は、ベースラインレベルを超えて大幅に増加しませんでした（補足図2c、d）。したがって、どちらの治療グループも粘膜サンプルまたは PBMC において抗原特異的 IgA 抗体応答を誘発するようには見えませんでした。

ID93 に応答して PBMC サンプル中の IFN-γ および IL-10 サイトカイン分泌細胞の数を定量化するために、研究 0、14、56、70、84、および 224 日目に収集されたサンプルに対して ELISpot アッセイを実行しました。 MIMOSA 分析に基づく反応率は、両治療群とも 2 回目の注射後、研究 70 日目に 70 ～ 76% でピークに達しました (図 3a)。研究224日目では、IFN-γ反応率は53～65%の範囲でした（図3a）。両方の ID93 + GLA-SE 治療グループの参加者は、IFN-γ を産生する PBMC 100 万個あたりの合計 SFU で測定したように、堅牢な ID93 特異的 IFN-γ PBMC 想起反応を発現しました（補足表 2 および図 3b）。これらの反応は、両方のレジメンで最後のワクチン接種後 6 か月間持続しました。一方、IL-10産生細胞ではID93に対する低い反応性が見られました（補足表3および図3c、d）。 IFN-γ 分泌細胞の数が増加し、IL-10 分泌細胞のレベルが低下するこのパターンは、Th1 型免疫応答を示しています。 2 つのワクチンのプレゼンテーションを比較すると、有意な違いは示されませんでしたが、耐熱性単一バイアルワクチン形式の方がより大きな反応を引き出す傾向がありました。 ID93 サブユニットペプチドプールによって刺激された PBMC からの IFN-γ および IL-10 レベルは、ID93 刺激 PBMC について上記で説明したのと同様のパターンに従いましたが、その程度は低かった（補足図 3）。

n = 16 ～ 25 の生物学的に独立したサンプル（治療グループおよび時点に応じて）、補足表 2 ～ 4 を参照。 ID93刺激PBMCを使用したELISpotアッセイによるIFN-γ応答率。バックグラウンドを差し引いたSFUを使用してベースラインからの変化としてMIMOSAによって計算されました。 b ELISpot アッセイによって測定された、PBMC サンプル中の ID93 刺激された IFN-γ 分泌細胞の計数。 c ID93刺激PBMCを使用したELISpotアッセイによるIL-10応答率。バックグラウンドを差し引いたSFUを使用してベースラインからの変化としてMIMOSAによって計算されました。 d ELISpotアッセイによって測定された、PBMCサンプル中のID93刺激されたIL-10分泌細胞の計数。 e CD154、TNF、IFN-γ、IL-2、IL-21、IL-4 のうちいずれか 2 つのサイトカインを発現する CD4+ T 細胞の ICS による応答率。バックグラウンドを差し引いた頻度と総数を使用し、ベースラインからの変化として MIMOSA によって計算されます。。 f ICSによって測定された、PBMCサンプル中の任意の2つのサイトカインを発現するID93刺激されたCD4+ T細胞の頻度。 g ICSにより測定した、研究70日目および84日目の単一サイトカインおよび多機能サイトカインCD4+ T細胞表現型。研究70日目および84日目における、異なる単一サイトカインおよびサイトカインの組み合わせを発現するID93刺激CD4+ T細胞の割合を中央値頻度で表す。円グラフの面積は、各読み取り値の合計中央値頻度に比例します。 a、c、e 応答率プロットは記号で表された平均値を示し、エラーバーは平均値の 95% CI を示します。応答率はフィッシャーの直接確率検定を使用して比較されました。差異は両側検定に基づいて検出され、複数の時点を考慮してボンフェローニ調整を行った p ≤ 0.05 (α = 0.05) でした。 b、d、f ドットプロットは、バックグラウンドを差し引いたすべての値を記号で表し、実線は中央値を表し、誤差バーは四分位範囲を表します。データは、複数の時点を考慮してボンフェローニ調整を伴うウィルコクソン順位和検定を使用して 2 つの治療グループ間で比較されました。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

ID93 に応答して 2 つ以上のサイトカインを産生する CD4+ および CD8+ T 細胞の割合は、研究 0、7、14、56、63、70、84 日目に収集された PBMC サンプルを使用したフローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン染色 (ICS) によって測定されました。任意の２つ以上のサイトカインを発現する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（すなわち、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－２１、および CD154) は、バックグラウンドを差し引いた値を使用して計算されました。 ID93 特異的 CD4+ T 細胞応答は、両方のワクチン提示で観察されました (補足表 4 および図 3e、f)。ピーク応答率（MIMOSAによって分析）は、両方の治療グループで研究70日目に発生しました（38〜59％）（図3e）。反応率は、最後の研究注射から6か月後の研究224日目でも26〜31％で持続しました（図3e）。 ID93特異的T細胞の単一および組み合わせサイトカインプロファイルの分析により、最も高い発現頻度はIFN-γ、TNF、および/またはIL-2に起因し、IL-4応答は低いことが示されました（図3g）。熱安定性ワクチン製剤は、より高い中央値頻度の TNF 応答を誘発する傾向がありましたが、両方のワクチン提示は多機能性の Th1 に偏った免疫応答を誘発しました。ただし、CD8 + T細胞からのID93特異的応答頻度に対するどちらの治療からも最小限の影響が観察されました（補足図4dおよび補足表5）。要約すると、個々の読み取り値の差は統計的に有意ではありませんでしたが、熱安定性ワクチンの提示では、非耐熱性ワクチンの提示と比較して CD4+ T 細胞サイトカイン応答頻度がより高い全体的な傾向が示されました。

T 濾胞性ヘルパー (Tfh) 細胞、T エフェクターメモリー細胞、T セントラルメモリー細胞などの他の T 細胞サブタイプ、およびナチュラルキラー (NK) 細胞や NK T 細胞などの他の免疫細胞の頻度は、次の方法で測定されました。 PBMC サンプルのフローサイトメトリーによる ICS。どちらの治療も、ベースラインと比較して、CD4 + T中心記憶細胞頻度を向上させましたが、エフェクター記憶細胞頻度は向上させませんでした（補足図4a、b）。耐熱性単一バイアルの提示により、ベースラインと比較して研究63日目にTfh細胞頻度のわずかな増加も誘発されました（補足図4c）。ただし、NK細胞またはNK T細胞からのID93特異的応答頻度に対するどちらの処理からも最小限の効果が観察されました（補足図4e、f）。

最後に、各治療による正味の細胞内マイコバクテリアの増殖阻害を、研究0日目、70日目、および224日目に採取した全血サンプルを使用して測定しました。ただし、陽性までの時間で示されるように、どちらのワクチン投与もマイコバクテリアの増殖阻害を改善しませんでした（補足図5）。

私たちの知る限り、この研究は臨床試験で評価される最初の熱安定性サブユニット結核ワクチン候補となります 11,14。他の疾患適応症については、3 つの凍結乾燥アジュバント添加サブユニットワクチン候補が臨床試験に入っていますが、臨床結果は 1 つの候補についてのみ公表されており、その潜在的な熱安定性特性の評価は行われていません 15、16、17、18。したがって、本報告書は、熱安定性凍結乾燥アジュバント含有ワクチン候補の分野にとって大きな前進となる。特に、熱安定性の特性を備えた一部の液体ワクチン製剤は臨床試験を経て認可まで進み、現場での使用で実証された熱安定性プロファイルにより大きな有益な影響をもたらしています11、19、20。それにもかかわらず、このようなワクチンの冷蔵温度外での安定性は一般に数日または数週間に限定されますが、ID93 + GLA-SE の熱安定性シングルバイアル提示は 37 °C で 3 か月間安定です 12,13。

現在の第 1 相試験の具体的な目的は、ID93 + GLA-SE ワクチン候補の耐熱性 1 バイアルによる安全性と免疫原性を、以前に開発された非耐熱性 2 バイアルによるプレゼンテーションと比較して評価することでした。両方のワクチンのプレゼンテーションについてここで実証された安全性プロファイルは、2 バイアルのワクチンのプレゼンテーションに関する以前の臨床試験で明らかな一般に軽度の反応原性と一致していました 8,21,22。注射部位の痛みが最も一般的な AE であり、いずれのワクチン接種でもグレード 3 または 4 の AE または SAE は確認されませんでした。したがって、熱安定性ワクチンの提示により、非熱安定性 ID93 + GLA-SE ワクチン候補の優れた安全性プロファイルが維持されました。

Th1 型 T 細胞応答は、結核菌 (M. tuberculosis) に対する防御に有利であると考えられています 23。非熱安定性の 2 バイアル ID93 + GLA-SE 提示は、強力な抗原特異的 IgG および Th1 型 CD4+ T 細胞応答を誘導することが以前に示されています 8,21,22。ここで報告された両方のワクチンの免疫原性の結果は、IFN-γ、TNF、および IL-2 を発現する多機能性 CD4+ T 細胞を含め、このプロファイルと一致していました。しかし、今回の試験で採用された複数の測定値は、粘膜分泌抗体ELISA、全血の結核菌増殖阻害アッセイ、およびT細胞およびELISpotのELISpot計数など、ID93 + GLA-SEの以前の臨床評価には含まれていなかった。 B細胞。全血における粘膜抗体反応または結核菌増殖阻害に対するワクチン提示のいずれからも最小限の影響は明らかでしたが、ID93 で刺激された PBMC サンプル中のサイトカイン産生細胞の ELISpot ベースの計数では、両方の提示が ID93 + GLA-SE であることが示されました。は、強力な IFN-γ 応答と低い IL-10 応答を誘発しました。これは、現在および以前の試験の ICS データで明らかな Th1 型応答の質と一致しています。興味深いことに、耐熱性単一バイアル治療群では、非耐熱性治療群と比較して、より高いピーク T 細胞応答の全体的な傾向が観察されました。

B 細胞および抗体の応答は結核に対する防御効果には十分ではありませんが、T 細胞媒介免疫に対するそれらの複数の補完的な役割がますます認識されており、この点に関してさらなる臨床研究が正当化されています 24、25、26。注目すべきことに、耐熱性の単一バイアルワクチンの提示は、非耐熱性の二バイアルのワクチン提示よりも、2回目の免疫の2〜4週間後に収集された血清中に有意に多くの抗原特異的IgGおよびIgG1を誘発した。さらに、PBMC サンプル中の ID93 特異的 IgG 分泌細胞の計数により、耐熱性単一バイアルワクチン提示では 2 回目の免疫後 1 週間で強力な応答が示されましたが、非耐熱性 2 バイアルワクチン提示では示されませんでした。治療群間の免疫反応の大きさの予想外の違いを具体的にどのように帰因させるのかは明らかではありません。ベースライン MEPT が高いと、ワクチン接種後の倍率変化の計算に影響を与える可能性がありますが、これは MEPT の絶対値の違いを説明するものではありません。各治療グループには同じ用量の抗原とアジュバントが投与されましたが、賦形剤組成、製造日、製造プロセスなどの他の要因は必然的に異なりました。

この研究で採用された複数の免疫学的アッセイ、サンプルの種類、および時点は、健康な成人における ID93 + GLA-SE ワクチン候補のこれまでで最も包括的な臨床免疫原性評価を表しています。それにもかかわらず、この研究にはプラセボ治療群が存在しないなどのいくつかの制限がありましたが、ID93 単独または生理食塩水プラセボと比較した ID93 + GLA-SE の以前の臨床評価により、これらは不必要であると考えられました 8,22。他の制限には、結核に対する防御に関する確立された免疫相関が存在しないこと、および参加者がBCGワクチン接種を受けていないか、結核菌に事前曝露されていないことが含まれる。したがって、ID93 + GLA-SE の免疫原性プロファイル、特に熱安定性ワクチン製剤によって誘発される応答の増強が、どのように防御効果に影響を与えるかを予測することは不可能です。最後に、この研究には主に白人女性も登録されているため、結核疾患の負担が大きい他の集団への推定は困難となっています。

ID93 + GLA-SE の熱安定性シングルバイアル製剤がワクチン製造の拡張性とコストに与える影響も、重要な考慮事項です。我々は、商業規模での熱安定性製剤の賦形剤コストは、非熱安定性組成物よりも用量あたり約 0.15 ドル高くなるであろうと推定しています。さらに、凍結乾燥処理に数日かかるため、追加コストが発生します。しかし、これらのコストの増加は、非耐熱性製剤と比較して熱安定性製剤の保管要件がそれほど厳しくないことに関連する予想されるコスト削減と無駄の削減によって軽減される可能性があります。さらに、凍結乾燥はすでに確立された医薬品加工技術であり、多くの認可されたワクチンの製造に採用されています。

要約すると、この第 1 相臨床評価は、ID93 + GLA-SE の耐熱性 1 バイアルプレゼンテーションが、非耐熱性 2 バイアルワクチンプレゼンテーションと同様の安全性プロファイルと同等または改善された免疫原性プロファイルを引き出すことを示しました。効果的な熱安定性結核ワクチンは、世界の健康への影響に大きな影響を与えるでしょう。さらに、この研究は、臨床免疫原性や安全性特性に悪影響を与えることなく、アジュバント含有ワクチンを単一バイアルの熱安定性プレゼンテーションで製剤できるという概念実証を示しています。

この研究は、凍結乾燥 ID93 + GLA-SE からなる非耐熱性 2 バイアルと比較した、凍結乾燥された単一バイアルの耐熱性 ID93 + GLA-SE の安全性、忍容性、免疫原性を評価することを目的とした第 1 相ランダム化二重盲検臨床試験でした。液体 GLA-SE を健康な成人参加者に 2 回の IM 注射として投与しました。この研究は、米国食品医薬品局（FDA）の治験新薬（IND）に基づいて実施され、プロトコル、インフォームドコンセントフォーム、およびその他の研究資料はセントルイス大学治験審査委員会によって承認されました。この臨床試験は、ClinicalTrials.gov に識別子 NCT03722472 で登録されています。

この研究は単一施設（ミズーリ州セントルイスのセントルイス大学ワクチン開発センター）で実施され、ミズーリ州セントルイスおよびその周辺地域から参加者を募集した。研究計画書 (補足情報) に従って計画どおり、18 歳から 55 歳までの一般的に健康な男女合計 48 名の参加者が登録されました。参加者は研究についてカウンセリングを受け、インフォームドコンセントのプロセスを受けました。スクリーニングには、病歴、薬歴、身体検査、安全性臨床検査、および尿検査の評価が含まれます。完全な包含基準および除外基準は、補足情報 (研究プロトコル) に示されています。適格基準には、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、B型肝炎表面抗原（HBsAg）、およびC型肝炎ウイルス（HCV）陰性で、BCGワクチン接種歴がない18～55歳の健康な男性および女性が含まれた。すべての適格基準を満たした参加者は、1:1 で 2 つの治療グループに無作為に割り付けられました。研究注射は、研究0日目と56日目に実施されました。一般的な安全性は、各参加者について0日目、7日目、56日目、63日目、および84日目に評価されました。スクリーニング当日および研究 7 日目および 63 日目に、安全性検査室分析 (血液学および血清化学) のために血液を評価しました。すべての参加者は、各研究注射後の 7 日間の局所および全身の反応原性 AE を求める参加者記憶補助書を記入しました。望ましくない AE は、研究 84 日目（最後の研究注射から 28 日後）まで記録されました。 SAE の発生と PIMMC の発症は、研究期間 (約 421 日) を通して記録されました。免疫原性は、研究0日目（投与前）および研究7、14、56、63、70、84、および224日目に評価されました。参加者には、研究訪問1回につき75ドル、電話訪問1回につき10ドルの報酬が支払われました。

参加者 48 名のサンプルサイズは、第 1 相試験として妥当なものによって決定され、より大規模な試験への移行に関連する予備的な安全性と免疫原性の情報のみが許可されます。 ID93 + GLA-SE の非耐熱性症状に関するこれまでの臨床経験に基づいて、グループあたり 24 人の参加者のサンプルサイズにより、耐熱性症状グループにおける全身性副作用頻度の > 32.5% の増加を検出できると推定しました。片側信頼区間95%、出力80%で非耐熱性提示群と比較し、非耐熱性提示群と比較して耐熱性提示群での血清抗体反応率の>10%の低下の検出90% の検出力、95% の片側信頼区間で。この研究には、性別に関係なく、包含/除外基準を満たすすべての健康な成人が含まれていました。性別は自己申告に基づいて決定されました。この研究はこの側面に適切に対処するのに十分な力を持って設計されていなかったため、性別またはジェンダーに基づく分析は実行されませんでした。主要評価項目には、(1) 各研究注射後 7 日以内に誘発性の局所注射部位反応を経験した参加者の数、(2) 各研究注射後 7 日以内に誘発性の全身反応を経験した参加者の数、(3)研究０日目から研究８４日目までにＡＥを自発的に報告した参加者、および（４）研究期間中のいずれかの時点で報告された研究注射に関連すると考えられるＳＡＥの数。二次評価項目には、(1) ELISA によるアッセイでベースライン (研究 0 日目) と比較して、研究 14、56、70、84、および 224 日目に ID93 に対する IgG 抗体反応が少なくとも 4 倍増加した参加者の割合。（２）ＥＬＩＳＡによりアッセイした、ベースライン（研究０日目）に対する研究１４、５６、７０、８４、および２２４日目のＩＤ９３に対するＩｇＧ抗体応答のベースラインからの平均変化倍数。（３）ＥＬＩＳｐｏｔによってアッセイされた、ベースライン（研究０日目）と比較した研究１４、５６、７０、８４、および２２４日目のＩＤ９３に応答したＰＢＭＣサンプル中のＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０サイトカイン分泌細胞の数；（４）研究０日目、７日目、１４日目、５６日目、６３日目、７０日目、８４日目、および２２４日目にＰＢＭＣのフローサイトメトリーを用いてＩＣＳによって測定された、ＩＤ９３に応答して２つ以上のサイトカインを産生するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。探索的エンドポイントには、(1) 研究 0、14、56、70、84、および 224 日目の ID93 に対する IgG サブクラス抗体応答が含まれます。（２）研究０日目、７０日目、および２２４日目の全血を使用した結核菌の正味の細胞内増殖阻害。（３）研究０日目、７０日目、および８４日目にＥＬＩＳＡによって測定された粘膜分泌物（鼻腔スワブおよび涙液採取物）中のＩＤ９３に対するＩｇＡ抗体反応。（４）研究０日目、７日目、５６日目、および６３日目に短培養Ｂ細胞ＥＬＩＳｐｏｔによってアッセイされたＰＢＭＣ中の抗体分泌細胞の数。（５）研究０日目、５６日目、８４日目、および２２４日目に長期培養Ｂ細胞ＥＬＩＳｐｏｔによってアッセイされたＰＢＭＣ中の抗原特異的記憶Ｂ細胞の数。（６）研究０日目、７日目、１４日目、５６日目、６３日目、７０日目、８４日目、および２２４日目に免疫表現型検査フローサイトメトリーによって測定されたＰＢＭＣ中のＴｆｈ細胞およびＴ細胞ホーミングマーカーの割合。

参加者は、以下の手順に従って 2 つの治療グループに無作為化して登録されました。スクリーニングされたすべての参加者のマスターログが維持されました。スクリーニングでは、インフォームドコンセントフォームに署名し、すべての包含基準および除外基準をいずれも満たさない参加者が、研究に登録する資格があると特定されました。適格な参加者には、研究 0 日目にクリニックを訪れたときに連続した識別番号が割り当てられました。DF/Net Research (シアトル、ワシントン州) の統計担当者は、ランダム化された治療割り当てのリストを作成し、それをインタラクティブ Web ランダム化システムの登録モジュールに組み込みました。 (IWRS)、DFexplore ソフトウェアに統合されています。臨床現場の研究コーディネーターまたは指定者は、DFexplore を使用して登録とランダム化を実行しました。適切なサイズのブロックのランダム化を使用して、2 つのグループのそれぞれに 1:1 の比率で登録のバランスをとりました。研究施設の指定された個人には、治療コードと実際の治療割り当てをリンクする治療キーが提供され、安全な場所に保管されました。

研究は二重盲検試験として実施されました。参加者、研究者、研究注射後に研究関連の評価を行う研究職員、および免疫学的アッセイを行う研究室職員には、治療の割り当てが知らされていなかった。 DF/Net Research からのランダム化スキームは、非盲検の研究担当者 (つまり、研究製品の調製を行う施設薬剤師および非盲検の研究製品管理者) に提供されました。

ID93は組換えサブユニット抗原であり、GLA-SEは合成Toll様受容体4アゴニストであるグルコピラノシルリピドA（GLA）を含むスクアレンエマルジョンです8,27。これは、ID93 + GLA-SE ワクチンがヒト参加者に投与された 5 回目の臨床試験でしたが、耐熱性単一バイアルによる投与では初めてでした (NCT01599897、NCT01927159、NCT02465216、NCT02508376、および NCT03722472)。以前の試験の結果により、用量選択 (ID93 2 μg および GLA-SE 5 μg) およびこの試験のスケジュールが決まりました8。 ID93 + GLA-SE の熱安定性シングルバイアル凍結乾燥プレゼンテーションは、賦形剤含有量の最適化、凍結乾燥プロセスエンジニアリング、および包括的な物理化学的および効力安定性モニタリングを含む、前述のように開発および製造されました 12,13。凍結乾燥された熱安定性シングルバイアル ID93 + GLA-SE は、投与前に注射用滅菌水 (WFI) で再構成されました。非熱安定性ツーバイアルプレゼンテーションは、凍結乾燥したID93タンパク質を滅菌WFIで再構成し、投与前に液体GLA-SEと1:1 v:vで混合することによって調製した。 2 バイアルのプレゼンテーションでは、ID93 はアイオワ大学生体触媒および生物処理センター (CBB、アイオワ州コーラルビル) によって製造され、凍結乾燥はアイオワ大学製薬学部 (アイオワ州アイオワ市) によって実行されました。液体 GLA-SE は、現在は Access to Advanced Health Institute (AAHI) となっている感染症研究所 (IDRI、ワシントン州シアトル) によって製造されました。シングルバイアルのプレゼンテーションでは、原薬 ID93 と GLA-SE はそれぞれ CBB と IDRI で製造され、最終医薬品は Lyophilization Technology, Inc (ペンシルバニア州ウォーミンスター) で製造されました。すべての治験製品は、スポンサー (IDRI) によって治験責任医師 (セントルイス大学のダニエル F. ホフト) に提供されました。 ID93 + GLA-SE、ID93、および GLA-SE のバイアルは輸送され、研究現場で 2 ～ 8 °C で保管されました。輸送中および保管中の温度は継続的に監視されました。無菌 WFI は研究施設によって提供されました。

ワクチンの希釈と 2 つの投与群の混合を含む治験ワクチンの調製は、治験ワクチン投与と同日、投与の 2 時間以内に無菌技術を使用して非盲検施設の薬剤師によって行われました。再構成すると、両方の治療グループ (1 バイアルと 2 バイアルのプレゼンテーション) のワクチンは同一に見えました。研究注射の管理を任命された担当者には、参加者識別番号と病院が要求する識別データのラベルが貼られた充填済み注射器が提供されました。準備時間と投与時間はソース文書に記載されています。すべての研究注射は体積0.5 mLで、利き腕ではない腕の三角筋に筋肉内投与されました。

すべてのサンプルは研究施設（ミズーリ州セントルイスのセントルイス大学ワクチン開発センター）で収集され、記録され、追跡されました。安全性サンプルは、収集と同日に処理のために Quest Diagnostics (旧 LabOne (カンザス州レネクサ)) に発送されました。二次エンドポイントおよび探索的エンドポイントの免疫サンプルはセントルイス大学で処理されました。各参加者からの血清と PBMC サンプルは研究が完了するまでここに保管され、その時点でサンプルはサンプル損失のリスクを軽減するために、アッセイと分析のために Advanced Bioscience Laboratories (ABL Inc.、メリーランド州ロックビル) に 2 回に分けて発送されました。温度の変動によるもの。 PBMC は液体窒素を充填したドライシッパーを使用して輸送され、血清サンプルはドライアイスで輸送されました。

マイコバクテリア増殖指示管 (MGIT) アッセイでは、滅菌ヘパリンナトリウム採取管を使用して血液を採取しました。安全な血液学検査のために、血液は EDTA を含むチューブに採取されました。安全性化学および抗体分析用の血清サンプルを取得するために、血清分離管 (SST) を使用して血液を収集しました。抗体分析の場合、周囲温度、750 ～ 930 × g で 10 ～ 15 分間遠心分離した後、上清を収集しました。それぞれ約 500 µL の血清サンプルを分割し（プライマリバイアル 2 つとバックアップバイアル 2 つ）、事前に冷却した 9 × 9 クライオボックスに入れ、-70 °C ± 10 °C で直ちに凍結し、-70 °C で直立位置で保管しました。 ABL への出荷までは °C ± 10 °C。

PBMC サンプルを取得するために、血液を 8 mL CPT チューブ (BD Biosciences、ニュージャージー州フランクリンレイクス) に採取しました。水平ロータースイングヘッド遠心分離機で周囲温度、1800 × g で 30 分間遠心分離した後、血漿を吸引し、ピペットを使用してチューブから細胞層を収集し、コニカル遠心分離管に移しました。次に細胞を洗浄し、リン酸緩衝食塩水 (PBS) に再懸濁しました。続いて、PBMC サンプルを、凍結バイアルあたり 1 mL の凍結培地 (10% ジメチルスルホキシド (DMSO) を含むウシ胎児血清 (FBS)) に 8 × 106 ずつ分注しました。 PBMC は、CoolCell (Corning、ニューヨーク州コーニング) または Mr. Frosty (Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) コンテナ内で -70 °C ± 10 °C で直ちに凍結されました。各参加者の PBMC バイアルは、冷凍庫内で直立した状態で事前に冷却された 2 つの別々の (プライマリとバックアップ) 9 × 9 クライオボックスに分配され、その後 1 週間以内に液体窒素または気相極低温冷凍庫に移され、出荷されるまでそこで保管されました。 ABL。

鼻サンプル収集では、同じ滅菌 PurFlock スワブ (Puritan Medical Products、メイン州ギルフォード) を鼻中隔に沿って各鼻腔に挿入し、各方向に 360° 回転させ、各回転後に 5 秒待ってから慎重にスワブを取り外しました。両方の鼻孔をサンプリングした後、スワブの先端を、15 mL 遠心分離管内の 5 mM l-グルタミン酸および 10% スクロースを含むダルベッコ PBS (DPBS) を含む緩衝液 (pH 7.2) 3 mL に入れました。綿棒アプリケータースティックを取り外し、綿棒をチューブ内に残しました。鼻腔スワブサンプルは、凍結するまで濡れた氷上または 2 ～ 8 °C の冷蔵庫内に最大 2 時間保持されました。サンプルは -70 °C ± 10 °C で凍結され、処理まで少なくとも 24 時間、ただし 1 か月以内、この温度で保管されました。サンプル処理は、チューブを 1 分間ボルテックスし、次に取り出す前にチューブの側面にスワブを押し付けることから構成されていました。次に、残りのサンプルをクライオチューブに小分けし、セントルイス大学での分析まで -70 °C ± 10 °C で保存しました。

涙サンプルは、最初に参加者の目の上で直接オレンジ色の皮を絞ることによって収集されました。その後、参加者は涙が出るまで数回まばたきをしました。涙液 (目標量 125 μL) を毛細管を使用して収集し、スクリューキャップ収集マイクロチューブに排出しました。次いで、罹患した眼を洗眼液および市販の点眼液で洗浄した。涙液サンプルを濡れた氷上に最大 2 時間保持した後、約 4 °C、20,000 × g で 5 分間遠心分離して処理しました。上清を 15 µL ずつ収集し、0.5 mL 保存バイアルに入れ、セントルイス大学での分析まで -70 °C ± 10 °C で保存しました。

すべての AE の発生は研究 84 日目まで記録されましたが、SAE および PIMMC は研究 421 日目までモニタリングされました。AE は重症度 (すなわち、グレード 1、2、または 3) および研究注射との関係 (すなわち、グレード 1、2、または 3) によって等級分けされました。、おそらく、おそらく、または間違いなく関連している）研究計画書（補足情報）で提供される定義によると。報告目的では、国立アレルギー感染症研究所 (NIAID) のガイドラインに従って、間違いなく、おそらく、そしておそらく関連する AE が研究注射に関連していると考えられました。関連しない AE は無関係であるとみなされました。 SAEは、死亡に至るAE、生命を脅かすとみなされるAE、入院または入院の延長を必要とするAE、持続的または重大な障害/無能力をもたらすAE、または研究参加者の子孫に先天異常/先天性欠損症をもたらすAEと定義されました。。

局所注射部位反応を、研究注射当日（注射前および注射後60分）、および研究注射後7日間、痛み、紅斑、および硬結を段階的に評価することによって評価した。誘発性全身反応は、各研究注射後 7 日間の頭痛、関節痛、悪寒、食欲不振、発熱、疲労、および/または筋肉痛の発生として定義されました。これらの症状は、グレード 1 (軽度)、グレード 2 (中等度)、またはグレード 3 (重度) として特徴付けられました。各研究注射後の 7 日間にわたる局所的および全身的な AE 情報を収集するために、記憶補助小冊子が各参加者に配布されました。すべての参加者は、注射当日の夕方と研究注射後の6日間毎日ほぼ同じ時間に、口腔温度と局所的および一般的な兆候と症状を個々の記憶補助具に記録するように指示されました。付属の測定ツールを使用して、注射部位の紅斑と硬結を測定し、等級付けしました。参加者はまた、服用した薬を記録するよう求められた。記憶補助具は、各注射の 7 日後に再検討のために予定された訪問日に診療所に持参され、研究 7 日目と 63 日目に研究研究スタッフによって回収されました。記憶補助具は、治験責任医師および/または被任命者が参加するのに役立つツールでした。注射後に発生した可能性のある有害事象について参加者と会話します。

脈拍、口内温度、呼吸数、収縮期血圧と拡張期血圧を研究0、7、56、63、84日目に評価しました。各注射の7日後に安全性臨床検査（血液学および血清化学）を実施しました。グレード 1 以上を満たすバイタルサインまたは臨床検査値の変化は、AE として記録されました。尿妊娠検査は、市販の検査薬を使用して研究クリニックで実施されました。 HIV、HBsAg、HCV、および QuantiFERON-TB Gold の血清学はスクリーニング時に実施されました。予定外の追跡臨床検査は、研究臨床医の裁量で行われました。すべての血清学、血液学、化学検査は Quest Diagnostics で実施されました。

この臨床試験では、被験者の安全性と研究中止基準を監視するために安全監視委員会（SMC）を利用しました。 SMC は試験開始から 1 年後に会合を開き、現在の研究状況を確認し、これまでの安全性概要報告書について議論しました。その時点では、重大な安全上の懸念は確認されていませんでした。したがって、SMC は、研究を変更せずに計画どおりに進めることを推奨しました。

血清および PBMC サンプルに対するすべての免疫原性評価は ABL によって実行されました。血清 ELISA は、精製 ID93 またはサブユニットタンパク質 (RV1813、RV2608、RV3619、または RV3620) を 1 mL あたり 1 μg でコーティングした高結合 384 ウェル ELISA プレートを使用して、周囲温度で 2 時間コーティングして実行しました。次にプレートを洗浄緩衝液 A (Teknova, Hollister, CA) を使用して 3 回洗浄し、ブロッキング緩衝液 (PBS 中の 1% w/v ウシ血清アルブミン [BSA] および 0.05% w/v ポリソルベート 20) を用いて周囲温度で 4 時間ブロックしました。）。次いで、ブロッキング緩衝液を廃棄し、サンプルを各ウェルに加えた。対照血清を、ＰＢＳ中の０．０５％ポリソルベート２０を含む０．１％ＢＳＡでの最初の１：１００希釈から始めて４倍に希釈し、適切なウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを７回洗浄した後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（特定の抗体および希釈については補足説明を参照）を、実行される特異的ＥＬＩＳＡに従って適切なウェルに添加し、周囲温度で１時間インキュベートした。次いで、プレートを７回洗浄し、ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［ＫＰＬ］、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を加えて比色分析し、周囲温度で約１０分間インキュベートし、１Ｎ硫酸の使用を停止した。光学密度（OD）は、プレートリーダー（Molecular Devices）を使用して450および570 nmで定量化されました。差し引いた OD データ (450 ～ 570 nm) を使用して、その後のデータ分析を実行しました。エンドポイント力価は、各希釈での OD 値を 4 つのパラメーターの最小二乗シグモイド曲線に最小二乗フィッティングすることによって計算されました。カットオフ値は、すべての希釈におけるネガティブコントロール血清の平均に、抗体アイソタイプに応じて標準偏差の 6 倍または 3 倍を加えたものとして計算されました。カットオフよりも低いOD値を有するサンプルには、最低希釈の0.5倍の対数変換を表す1.699の終点力価が割り当てられた。

分泌型免疫グロブリン A (sIgA) ELISA は、研究 0、70、および 22428 日目に採取した鼻腔スワブと涙サンプルを使用して実施しました。抗原特異的 sIgA ELISA の場合、Immulon 2 プレートを 1 mL あたり 1 μg の精製 ID93 タンパク質 (AAHI) でコーティングしました。、シアトル、ワシントン州）を PBS で希釈し、4 °C、5% CO2 で一晩インキュベートしました。次いで、プレートをＰＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０で洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで３７℃で約１時間ブロックした。ブロッキングに続いて、プレートを洗浄し、鼻腔スワブおよび涙サンプルを、サンプルの種類ごとにあらかじめ決められた最適な希釈率で複製ウェルに加え、プレートを4℃で一晩インキュベートしました。次いで、プレートをＰＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０で洗浄し、ビオチン結合精製ヤギ抗ヒトＩｇＡ（カタログ番号５２６０－００２７、ＫＰＬ、ＳｅｒａｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を５００倍希釈で添加して、１．５時間インキュベートした。光を避けて室温で。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０で洗浄し、ホスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＫＰＬ）を添加し、プレートを光から保護して室温で１．５時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、ｐＮＰＰ（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴｐ－ニトロフェニルリン酸錠剤、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）基質溶液を調製し、次いでプレートをＰＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０で洗浄し、基質溶液を添加した。基質溶液を含むプレートを（室温で光から保護して）50分間インキュベートし、AP停止液（KPL）を添加し、405/550二重波長で吸光度を読み取った。総 sIgA ELISA は、IgA (ヒト) ELISA キット (Abnova、台湾、台北、#KA2110) プロトコールに従って実施されました。

ICSは以下の手順で実施した。研究参加者からの PBMC を解凍し、最大濃度 2 × 106 細胞/mL の R10 培地 (10% FBS、1% l-グルタミン、および 1% ペニシリン-ストレプトアビジンを含む RPMI 1640) 中で 37 °C および 5 ℃で一晩静置しました。 % CO2。次に、PBMC を 10 × 106 細胞/mL の濃度に再懸濁し、1 mL あたり 1 × 106 細胞がそれぞれ 0.25 μg/mL のブドウ球菌エンテロトキシン B (SEB) または 10 μg/mL ID93 または 0.3% DMSO で刺激されるように分配しました。 CD28/CD49d 共刺激カクテルもそれぞれに追加されました。 PBMC を 37 °C、5% CO2 で 2 時間インキュベートした後、1X ブレフェルジン A を添加して分泌タンパク質 (サイトカインやインターロイキンなど) を細胞内に保持しました。活性化は、湿ったタオルを入れた密閉ビニール袋中で細胞をインキュベートし、37 °C、5% CO2 でさらに 10 時間継続しました。細胞数および生存率は、Guava EasyCyte フローサイトメーター (Luminex、テキサス州オースティン) を使用してモニタリングしました。次に、細胞を多段階で染色して、領域/ゾーンに分割された標的を検出しました。細胞を別々に染色しました。最初に生存率色素 (ヒト CD14 BV510、カタログ番号 301842、BioLegend) の 500 倍希釈液を使用して周囲温度で 20 分間、続いて 5 μg/mL のヒト Fc ブロックで周囲温度で 10 分間染色しました (環境から保護)光）、次に細胞外表面マーカーカクテルを用いて周囲温度で 20 分間反応させます。使用した抗体、希釈液、およびその他の試薬の完全なリストは補足ノートに記載されています。次に、細胞を BD CytoFix/CytoPerm (BD Biosciences) で透過処理し、周囲温度 (光から保護) で 10 分間固定し、その後 1X Perm/Wash バッファーで洗浄しました。最後に、細胞を細胞内マーカーカクテルで周囲温度で 30 分間染色し (光から保護)、1X BD Stabilizing Fixative で周囲温度で 20 分間固定し、染色後 16 時間以内に BD LSRFortessa フローサイトメーターで分析しました。細胞集団数および頻度に関するデータは、FlowJo v10.8.1 ソフトウェア (BD Biosciences) を使用して収集されました。

循環抗体分泌細胞の頻度を検出するために、短期 B 細胞 ELISpot アッセイを実行しました。プレートを 35% アルコールで活性化し、適切なウェルを ID93 捕捉抗原または IgG/IgA 捕捉抗体 (それぞれクローン MT91/145、カタログ番号 3850-3-1000、またはクローン MT57、カタログ番号 3860-3-1000) でコーティングしました。 MabTech) を 100 倍に希釈し、4 °C で一晩インキュベートしました。次いで、Ｒ１０培地を使用してプレートをブロックした。 PBMC を解凍し、37 °C、5% CO2 で 2 時間インキュベートし、ブロックされたウェルに播種する前に計数しました (ID93 の場合は 1 ウェルあたり 5 × 105 細胞、IgG/IgA の場合は 1 ウェルあたり 1 × 105 細胞)。細胞は 37 °C、5% CO2 で 18 ～ 22 時間培養されました。次にプレートを洗浄し、抗 IgG または抗 IgA 検出抗体 (それぞれクローン MT78/145、カタログ番号 3850-6-250、またはクローン MT20、カタログ番号 3860-6-250、MabTech) と 500 倍でインキュベートしました。室温で 2 時間希釈し、洗浄し、抗ビオチンストレプトアビジンアルカリホスファターゼ (AP) 二次抗体 (カタログ番号 3310-9-1000、MabTech) とともに室温で 1 時間インキュベートし、洗浄し、最後にニトロメタンを使用して現像しました。青色テトラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3'-インドリルホスフェート (NBT/BCIP) を周囲温度で 7 分間処理した後、蒸留水で停止します。現像後 2 日以内に、ImmunoSpot アナライザー (Cellular Technology Limited、Cleveland、OH) を使用してプレートをスキャンし、計数し、品質管理を行いました。

メモリー B 細胞を検出するための長期 B 細胞 ELISpot アッセイは、PBMC を最初にヒト B-Poly-S ポリクローナル B 細胞レシキモド/IL-2 を添加した R10 培地で 3 日間培養したことを除いて、上記と同じ手順に従って実施しました。刺激装置（Cellular Technology Limited）で播種し（ID93 の場合はウェルあたり 2 × 105 細胞、IgG/IgA の場合はウェルあたり 5 × 104 細胞）、それぞれ 4 日目と 5 日目に発色させました。

IFN-γおよびIL-10 T細胞ELISpotアッセイは以下の手順に従って実施した。プレートを 35% アルコールで活性化し、IFN-γ または IL-10 (それぞれクローン 1-D1K、カタログ番号 3420-3-250、またはクローン 9D7、カタログ番号 3430-3-250) に対する捕捉抗体でプレートをコーティングしました。 MabTech) を 100 倍に希釈し、4 °C で一晩インキュベートしました。研究サンプルの PBMC とサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス、および破傷風毒素 (CEFT) ドナー対照 PBMC を解凍し、計数し、37 °C、5% CO2 で一晩インキュベートしました。次に、R10 培地を加えてプレートをブロックし、37 °C、5% CO2 で 2 ～ 4 時間保存しました。研究サンプルと対照 PBMC を再計数し、適切な濃度に再懸濁しました。以下の密度に従って、細胞を 96 ウェルのポリフッ化ビニリデン (PVDF) プレートに播種しました。すべての研究サンプルは、両方の T 細胞 ELISpot アッセイでウェルあたり 2 × 105 細胞で播種されました。ドナーコントロール PBMC を、フィトヘマグルチニン (PHA) 刺激 (IL-10 アッセイ) の場合は 1 ウェルあたり 2 × 105 細胞、CEF 刺激 (IFN-γ アッセイ) の場合は 1 × 105 細胞のいずれかで播種しました。刺激物質を以下の濃度で対応するウェルに添加しました: 10 μg/mL ID93; RV1813、RV2608、RV3619、または RV3620 ペプチド 1 mL あたり 1 μg。 PHA 1 mL あたり 1 ～ 10 μg。または 1 μg/mL CEF。組み立てたプレートを 37 °C、5% CO2 で 18 ～ 22 時間一晩インキュベートしました。次にプレートを洗浄し、1 mL あたり 1 μg の抗ヒト IFN-γ または抗ヒト IL-10 検出抗体 (クローン 7-B6-1、カタログ番号 3420-6-250、またはクローン 12G8、カタログ番号 3430) とともにインキュベートしました。それぞれ、-6〜250、MabTech）1000倍希釈で周囲温度で2.5時間、洗浄し、ストレプトアビジン-HRPとともに周囲温度で1時間インキュベートし、洗浄し、最後にNovaRED（Vector Laboratories、カリフォルニア州ニューアーク）を使用して現像しました。蒸留水で停止する前に、周囲温度で約 15 分間放置します。開発後 1 ～ 2 日以内に、ImmunoSpot アナライザーを使用してプレートをスキャンし、計数し、品質管理を行いました。

殺菌活性は、以前に記載されているように、0、7、および 224 日目の全血培養物で研究されました 29。簡単に説明すると、L-グルタミンと HEPES (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸) を含む RPMI 1640 培地を使用してヘパリン添加全血サンプルを希釈し、次にこれらの希釈した全血サンプルを 2 mL チューブに添加しました。 BCG (重複) としっかりと蓋がされています。次に、チューブを回転装置に置き、37 °C で 72 時間連続回転させました。インキュベーション後、チューブを 13,000 × g で 10 分間遠心分離し、上清を除去しました。各チューブからの残りのペレットを、PANTA を添加したマイコバクテリア増殖指示チューブ (MGIT) 培地 (BD) に再懸濁し、十分にボルテックスした後、蛍光分析用 MGIT (BD) に移しました。サンプルを含む MGIT にしっかりと蓋をし、Bactec MGIT 320 機器 (BD) に置きました。 MGIT の陽性までの時間 (TTP) は自動的に追跡および記録されました。

免疫学分析は、Prism 9.3 以降 (GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ)、SAS 9.4 (SAS Institute、ノースカロライナ州ケーリー)、または R 4.03 (R Foundation、オーストリア、ウィーン) のいずれかを使用して実行されました。カテゴリデータは、2 つ以上のカテゴリ間でペア比較が行われる場合は常に、フィッシャーの直接確率検定とボンフェローニ調整による有意水準 0.05 (α = 0.05) を使用して分析されました。

Shapiro-Wilk 検定によるとどのデータセットでも正規性の仮定が満たされなかったため、Wilcoxon 順位和検定を使用して 2 つの治療グループ間で連続データを比較しました。応答率はフィッシャーの直接確率検定を使用して比較されました。差異は、複数の時点間でペアごとの比較が行われるたびに、両側検定およびボンフェローニ調整による p ≤ 0.05 (α = 0.05) に基づいて検出されました。比較には、各グループの点推定値と 95% 信頼区間 (CI) が伴われました。欠損データは完全にランダムに欠損している (MCAR) と仮定され、利用可能なデータに対して分析が実行されました。

ID93 抗原に対する IgG 抗体応答 (合計 IgG、IgG1、IgG2、IgG3、および IgG4) を、所定の参加者から収集した血清を使用して ELISA によって測定しました。各時点で、重複から計算された MEPT が報告されました。注射後の各時点で、次のポスト:プレ比が計算されました。

参加者は、所定の ELISA のシステム適合性基準が満たされ、その時点での Post:Pre Ratio が 4 以上であった場合、所定の時点で抗体陽性反応者とみなされます。

ID93 タンパク質に対する細胞応答は、ELISpot アッセイおよびフローサイトメトリーを備えた ICS によって PBMC におけるサイトカイン産生を測定することによって評価されました。 IFN-γ および IL-10 ELISpot アッセイを研究 0、14、56、70、84、および 224 日目のサンプルに対して実行し、ID93 による刺激または非刺激に応答して IFN-γ または IL-10 を産生する PBMC の割合を決定しました。 (PBS)。分析のために、バックグラウンドを差し引いたスポット形成単位 (SFU) 値を計算しました。注射後の各時点で、ベースラインからの変化は、所定の時点からベースラインでのバックグラウンドを差し引いたSFU値を減算することによって計算されました。バックグラウンドを差し引いたSFUとベースラインSFUからの変化の両方を、各参加者および訪問日ごとに要約しました。各時点での応答者のステータスは、誤検出率を 0.1% に制御するベイジアン統計フレームワークである MIMOSA モデルを使用して決定されました30。マルコフ連鎖モンテカルロ (MCMC) 設定では、デフォルトのハイパーパラメーターが使用されました。具体的には、非応答者と応答者の両方の確率がベータ分布に従うと仮定され、ハイパーパラメータには平均 1000 のあいまいな指数事前確率が与えられました。応答者の未知の割合は、0 から 1 までの一様な分布から抽出されると仮定されました。 MCMC の実行では、50,000 回のバーンイン反復の後、200,000 回の反復が使用されました。次に、各治療グループ内で分析された参加者の総数に基づいて反応率が計算されました。

PBMC ICS を研究 0、7、14、56、63、70、84、および 224 日目のサンプルに対して実行し、IFNγ、TNF、IL-1 のさまざまな組み合わせを産生する単一および多機能の CD4 および CD8 T 細胞の割合を決定しました。 2、ID93 刺激に応答した IL-4、IL-21、および CD154。ゲートは各機能マーカーに適用され、他のマーカーの共発現は考慮されませんでした（補足図6〜10）。その後、マーカーのさまざまな組み合わせを発現する細胞を識別するために示されたゲートに基づいてブールゲートが作成されました。我々は、IFN-γ、TNF、IL-2、IL-4、IL-21、および CD154 のうち少なくとも 2 つの免疫マーカーに対して陽性であった任意の 2 つ以上のサイトカインについて T 細胞集団を分析しました。また、6 つの免疫マーカーの選択された組み合わせを発現する T 細胞も評価しました。バックグラウンドを差し引いた負の値はすべてゼロに設定されました。バックグラウンドを差し引いた頻度 (%) は、ID93 刺激サンプルから非刺激サンプルを引いた (バックグラウンドを差し引いた) サイトカイン陽性 T 細胞の頻度として計算されました。

注射後の各時点で、ベースラインからの変化は、所定の時点からベースラインでのバックグラウンドを差し引いた頻度 (%) を引くことによって計算されました。バックグラウンドを差し引いた頻度とベースライン頻度からの変化の両方が、参加者および訪問日ごとに要約されました。 MIMOSA モデルを使用して、各参加者、訪問日、および T 細胞サブセットの応答ステータスを決定しました。次に、各治療グループ内で分析された参加者の総数に基づいて反応率が計算されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。ただし、インフォームドコンセントにこれが明示的に含まれていないため、個々の参加者のデータは利用できません。研究プロトコール、研究参加者の性質、およびプロトコールの逸脱は補足情報に含まれています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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著者らは、安全監視委員会のメンバー (W. Henry Boom、Fiona Smaill、Kathleen M. Neuzil)、独立安全監視員 (John Richard と Marie Philipneri)、および Medical Monitor のメンバー (Stuart Kahn) に感謝したいと思います。彼らの優れた監督とフィードバック。著者らはまた、Larry Wolfraim、Carol Ostrye、Onyinye Erondu、Mohamed M. Elsafy、マモディコエ・マケン、ジョナサン・マキニス、ミシェル・ワイルドマン、カマル・ヴェルムルガン。著者らは、Prerana Ranjitkar 氏、Elyse Beebe 氏、Sandra Sivananthan 氏、Elise Larson 氏、Jannabeth Bannister 氏、および Tre Argerious 氏からのプロジェクト管理および管理上の支援にも感謝しています。ヴァレリー・ソーザによる編集協力。この研究は、契約 #HHSN272201400041C (CBF) に基づいて、NIAID、NIH、保健福祉省からの連邦資金によって支援されました。 NIAID は研究設計、分析、原稿執筆に参加しました。

フレボルを聞く

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ブリジット・フィッシャー

現在の住所：米国ワシントン州シアトル、ブリストル・マイヤーズスクイブ

トレイシー・デイ

現在の住所：ヤンセンワクチン社、ライデン、オランダ

ジュリー・ベルガラ

現在の住所: Universal Cells、シアトル、ワシントン州、米国

米国ワシントン州シアトルの Advanced Health Institute (旧感染症研究所) へのアクセス

ザカリー・K・佐川、クリスティーナ・ゴーマン、オード・フレヴォル、ブリジット・フィッシャー、トレイシー・デイ、ラオドー・モハマス、ジュリー・ベルガラ、アラン・ルー、アンナ・マリー・ベックマン、コーリー・キャスパー、クリストファー・B・フォックス

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アズラブラゼヴィッチ、ジャニステナント、ダニエル F. ホフト

Advanced Bioscience Laboratories (ABL), Inc.、米国メリーランド州ロックビル

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DF/Net Research, Inc.、米国ワシントン州シアトル

ジョー・ジャン & リサ・オンドレイチェク

ワシントン大学グローバルヘルス学部、シアトル、ワシントン州、米国

コーリー・キャスパー & クリストファー・B・フォックス

ワシントン大学医学部、シアトル、ワシントン州、米国

コーリー・キャスパー

ワクチンおよび感染症部門、フレッド・ハッチンソンがんセンター、シアトル、ワシントン州、米国

コーリー・キャスパー

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AMB、BF、CBF、CC、DFH、TD、ZKS がこの研究を発案しました。 AL、AMB、CBF、DFH、FL、JT、LO、および SJ が研究を監督しました。 AL、AMB、CBF、DFH、FL、JT、および SJ がプロジェクトを管理しました。 AMB、AB、DFH、RM がリソースを提供しました。 CBFは資金を獲得した。 AMB、AF、AB、CBF、CC、CG、DFH、IK、JT、JV、LT、RM、SJ、ZKS が調査に貢献しました。 AMB、AB、BF、CBF、DFH、JV、RM、SJ、TD、ZKS がこの方法論に貢献しました。 AF、AB、CBF、CG、SJ、ZKS がデータを厳選しました。 CBF、JJ、LO がデータを分析しました。 CBF、JJ、LO、ZKS がデータを視覚化しました。 CBF と ZKS は原稿の初稿を書きました。 AF、AB、BF、CBF、CC、CG、DFH、FL、IK、JJ、LT、SJ、TD、ZKS が原稿をレビューし、編集しました。

クリストファー・B・フォックスへの通信。

CBF は競合する非財務的利益を宣言しませんが、以下の競合する財務的利益を宣言します。 CBFは、WO/2015/103167、シングルバイアルワクチン製剤、およびWO/2013/119856、TLR4アゴニストを含む改良されたアジュバント製剤およびその使用方法の優先権を主張する特許の共同発明者である。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

佐川、ZK、Goman、C.、Frevol、A. 他健康な成人における熱安定性 ID93 + GLA-SE 結核ワクチン候補の安全性と免疫原性。 Nat Commun 14、1138 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36789-2

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受信日: 2022 年 12 月 23 日

受理日: 2023 年 2 月 16 日

公開日: 2023 年 3 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36789-2

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