Peli3 アブレーションはアセトアミノフェンを改善する

実験と分子医学 (2023)この記事を引用

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アセトアミノフェン (APAP) 誘発性肝損傷を支配するシグナル伝達経路は、広範囲に研究されています。しかし、APAP誘発性肝損傷の制御に必要なユビキチン修飾酵素についてはほとんど知られていない。今回我々は、E3リガーゼ活性を持つPellino3タンパク質がAPAP誘発性肝障害に必要かどうかを調べ、その後その分子機構を調べた。全身 Peli3-/- ノックアウト (KO) およびアデノウイルス媒介 Peli3 ノックダウン (KD) マウスは、小葉中心細胞死、免疫細胞の浸潤、アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) やアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼなどの肝損傷のバイオマーカーのレベルの低下を示しました。 (AST)、野生型 (WT) マウスと比較した APAP 処理時。初代肝細胞における Peli3 欠損により、ミトコンドリアおよびリソソームの損傷が減少し、ミトコンドリアの活性酸素種 (ROS) レベルが減少しました。さらに、Peli3-/- KO マウスから得た初代肝細胞では、細胞質のセリン 9 のリン酸化レベルと GSK3β のミトコンドリア転座のレベルが減少しており、これらの減少には JNK リン酸化とミトコンドリア転座の減少が伴っていました。 Pellino3 は、JNK1 および JNK2 と比較して GSK3β とより強く結合し、リジン 63 (K63) を介した GSK3β のポリユビキチン化を誘導しました。レスキュー実験では、Peli3-/- KO肝細胞における野生型Pellino3の異所性発現によりGSK3βのミトコンドリア転座が回復したが、この回復はPellino3の触媒的に不活性な変異体の発現では得られなかった。これらの発見は、GSK3βポリユビキチン化の調節を介したPellino3とAPAP誘発性肝損傷との間の機構的な関連性を示唆する最初のものである。

アセトアミノフェン (N-アセチル-p-アミノフェノール、APAP) は、世界中で一般的に使用されている穏やかな鎮痛解熱薬です。しかし、たとえAPAPが適切な治療用量で安全であると認識されているとしても、APAPの過剰摂取は重度の肝障害を引き起こし、急性肝不全や死に至る可能性があります1。過去数十年にわたって蓄積された膨大な証拠は、APAP の過剰摂取によって誘発される肝障害の主な原因として、APAP の反応性で有毒な代謝産物である N-アセチル-p-ベンゾキノンイミン (NAPQI) の蓄積を指摘しています2。肝臓のチトクロム P450 2E1 (CYP2E1) によって APAP から代謝される少量の NAPQI はグルタチオン (GSH) 結合によって解毒されますが、APAP の過剰摂取後の NAPQI の過剰形成は肝臓の GSH を急速に枯渇させ、タンパク質付加物の形成を引き起こします。特にミトコンドリアタンパク質において顕著です3,4。このミトコンドリアタンパク質付加物の形成は、ミトコンドリアスーパーオキシドの過剰な生成を誘発し、これが一酸化窒素（NO）と反応してペルオキシ亜硝酸塩を生成し、それによってタンパク質のチロシン残基のニトロ化を通じてタンパク質の機能を妨害する可能性があります5,6。スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）模倣剤 Mito-TEMPO による APAP 誘発性肝毒性に対する保護は、SOD 部分欠損マウスにおける傷害の増加とともに、このプロセスにおけるスーパーオキシドの重要性を強調しています 7,8,9。さらに、APAP 誘発性肝損傷に関するいくつかの研究では、神経細胞の一酸化窒素合成酵素 (nNOS) が NO10、11、12 の上昇に関与していることが示されています。重度の酸化ストレスやニトロソ化ストレスなど、APAP 肝毒性におけるミトコンドリアの変化は、ミトコンドリアの透過性遷移孔の開口に寄与し、ミトコンドリア膜電位の損失と DNA 損傷を引き起こすエンドヌクレアーゼの放出につながります 13。これらすべての事象は最終的に肝細胞壊死をもたらしますが、最近の研究では壊死の重要性も示唆されています 14、15、16、17、18。 APAP 肝毒性における壊死性細胞死は、ミトコンドリア DNA、核 DNA 断片、高移動性グループボックス 1 (HMGB1) タンパク質、ATP などの損傷関連分子パターン (DAMP) を放出し、無菌性炎症を引き起こします 19,20。これらの DAMP は、パターン認識受容体 (PRR) に結合することでインフラマソームシグナル伝達を活性化し、プロカスパーゼ 1 のプロセシングを促進します。その結果、その後プロ IL-1β またはプロ IL-18 がプロセシングされて活性サイトカインになります 21。これらのサイトカインは、好中球や単球由来マクロファージの肝臓への活性化と動員に関与していると考えられていますが、これらの炎症細胞が肝臓損傷を悪化させるのか、それとも再生を促進するのかについては依然として議論の余地があります 19。これらのプロセスに加えて、オートファジーが肝臓の回復と再生の促進に重要な役割を果たしていることが報告されています22、23、24。

肝損傷およびAPAPの過剰摂取によって生成される反応性代謝物に関する広範な病態生理学的研究にもかかわらず、この肝毒性を制御するシグナル伝達経路は、現在の知識よりも複雑である可能性があります。多くの研究により、主に、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）スーパーファミリーに属するセリン/スレオニンプロテインキナーゼであるc-Jun N末端キナーゼ（JNK）が、APAP誘発性肝毒性において有害な役割を果たしていることが実証されている25、26、27。 28、29、30。 APAP 過剰摂取中のサイトゾルにおける JNK のこの持続的な活性化とそのミトコンドリア移行は、APAP 媒介ミトコンドリアおよびニトロソ化ストレスを増幅すると考えられています 31。

APAP 媒介肝毒性では、JNK 活性化が GSK3β、MLK3、ASK132、33、34 などの上流シグナル伝達タンパク質によって調節されることが報告されています。しかし、最近の報告では、プロテインキナーゼ C (PKC) および受容体相互作用プロテインキナーゼ 1 (RIPK1) が、JNK 活性化を通じて APAP 肝毒性に関与していることも示されています 35,36。これらのキナーゼの中で、GSK3β は、ミトコンドリアへの移行および JNK 活性化を介して APAP 媒介肝毒性に関与する重要なメディエーターであることが知られています 32。

APAP肝毒性に関与するシグナル伝達経路に関する現在の知識にもかかわらず、APAP媒介肝損傷におけるユビキチン修飾システムは、シグナル伝達成分のリン酸化ほど理解されていません。標的タンパク質のユビキチン化は、タンパク質の安定性、シグナル伝達、エンドサイトーシス、輸送などのさまざまな細胞プロセスにとって重要であることがわかっており、この多彩な修飾は主に E3 ユビキチンリガーゼによって媒介されます 37。 Peli3 遺伝子によってコードされる Pellino3 タンパク質は、Pellino1、Pellino2、および Pellino338 で構成される Pellino ファミリーのメンバーです。 Pellino3 は E3 リガーゼ活性を持つ RING ドメインを持ち、Toll 様受容体シグナル伝達、NOD2 シグナル伝達、TNF シグナル伝達経路などの多様な炎症性シグナル伝達経路に関与しています 39、40、41、42。興味深いことに、Pellino3 タンパク質の過剰発現は、JNK や p3843,44 などの MAPK の活性化を促進することがわかっています。これらの結果は、APAP 媒介肝毒性における Pellino3 の役割の可能性を強く示唆していますが、この役割についてはこれまで対処されていませんでした。

この研究では、全身 Peli3-/- ノックアウト (KO) およびアデノウイルス媒介 Peli3 ノックダウンの使用による、ミトコンドリア転座および GSK3β のリン酸化への関与を通じて、APAP 媒介肝毒性における Pellino3 タンパク質の役割を実証します ( KD) マウスモデル。この報告は、APAP媒介肝損傷におけるGSK3βの機能を調節するE3ユビキチンリガーゼの最初の同定を提供する。

Peli3-/- KO マウスを作製するために、Peli3 遺伝子を標的とするコンディショナルノックアウトベクターが、組み換えシステム 45 を使用して解釈されました (補足図 1a)。 Peli3エクソン2を含む5.9kbのゲノムDNA断片をpLMJ235プラスミドに挿入した。 loxP 配列とポジティブ選択マーカー (ネオマイシン耐性遺伝子) を持つ frt-loxP-Neo-frt-loxP カセットを、エクソン 2 の 117 bp 上流と 304 bp 下流にそれぞれ挿入しました。 Peli3 遺伝子に対する直線化されたターゲティングベクターを最初に 2 × 107 個の J1 マウス ESC にエレクトロポレーションしました。約 300 個の G418 および 1-(2-デオキシ-2-フルオロ-1-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードウラシル (FIAU) 耐性コロニーをランダムに選択し、これらのクローンをゲノムサザンブロット分析によってスクリーニングしました。外部プローブ。標的化された ESC を C57BL/6 (B6) 株の胚盤胞に注入しました。 ESC 培養と胚盤胞注入は標準的な方法を使用して実行されました。雄キメラをB6雌と交配させて、129/B6ハイブリッドバックグラウンドでPeli3+/3f株を確立した。 Peli3+/3f マウスと β-actin-Cre マウスを交配して、エクソン 2 が欠失した Peli31f ヌル対立遺伝子 46 を持つマウス系統を作製しました。 C57BL/6 バックグラウンドを持つ Peli3 KO マウスを生成するために、ハイブリッドバックグラウンドを持つ Peli3 KO マウスと C57BL/6 マウスを 10 世代以上戻し交配しました。野生型およびPeli3-/- KOマウスの遺伝子型を、示されたプライマーを使用したPCRによって分析しました（補足図1b）。 Peli3-/- KO マウスにおける Peli3 mRNA の発現は、補足表 1 に記載されているプライマーを使用した定量的リアルタイム RT-PCR (qRT-PCR) によっても確認されました。

ヒト胎児腎臓 293 (HEK293) 細胞は、American Type Culture Collection (米国バージニア州マナッサス) から購入しました。 HEK293 細胞は、10% ウシ胎児血清 (FBS; Thermo Fisher Scientific)、10 単位/ml ペニシリンおよび 10 mg/ml ストレプトマイシン (Thermo Fisher) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM; Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で維持されました。科学的）。 HEK293 細胞は、PCR によってマイコプラズマ汚染について定期的に検査されました。マウス初代肝細胞を、10％FBS、10単位/mlペニシリン、10mg/mlストレプトマイシン、23mM HEPES、および10nMデキサメタゾン（Sigma-Aldrich）を含むM199培地（Sigma-Aldrich）中でインキュベートした。アセトアミノフェン (APAP) は Sigma-Aldrich から購入しました。ポリエチレンイミン (PEI) を使用して、プラスミドを HEK293 細胞に一時的にトランスフェクトしました。リポフェクタミン 2000 (Thermo Fisher Scientific) をマウス初代肝細胞へのトランスフェクションに使用しました。

雄の Peli3-/- KO マウス (8 ～ 9 週齢) とその野生型同腹子を実験全体に使用し、病原体のない施設で飼育し、12 時間/12 時間の概日時計リズムを維持し、餌を与えました。スタンダードなチャウ。 APAP誘発肝損傷モデルを確立するために、水の存在下で食物のみを与えずに14時間絶食させたマウスに500 mg/kgのAPAPを経口投与した。投与前に、APAP を 55 °C で蒸留水に溶解し、37 °C まで冷却しました。対照として、蒸留水をマウスに経口投与した。 APAPの投与後、指定された時間にマウスの生存をモニタリングした。さらなる実験のために、APAP処理の24時間後に肝臓組織と血清を収集しました。非特異的 RNAi コントロール (shCON) および Peli3 特異的 shRNA (shPeli3 #3 および shPeli3 #4) を発現する組換えアデノウイルスの構築および関連する動物実験は、前述のように実行されました 47。組換えアデノウイルスで使用される内在性 Peli3 mRNA に対する特定の RNAi 配列を補足表 2 に示します。この研究は、成均館大学医学部 (SUSM) の動物管理使用委員会 (IACUC) によって審査され、承認されました。国際実験動物管理評価認定協会 (AAALAC International) 認定施設であり、実験動物資源研究所 (ILAR) のガイドラインを遵守しています。すべての動物実験において、APAP 誘発肝損傷モデルの作成のためにマウスがランダムに選択されました。

HA タグ付きヒト Pellino3a および Pellino3b 発現プラスミドは以前に記載されています 48。 HA-hPellino3a および HA-hPellino3b を特異的プライマーによる PCR のテンプレートとして使用し、Pellino3a および Pellino3b cDNA を、pcDNA-Flag ベクター (Thermo Fisher Scientific) の EcoRI および XhoI 部位、または pCS3+MTBX の XhoI および KpnI 部位にサブクローニングしました。このベクターは、CY Choi 博士 (成均館大学、韓国) のご好意により提供いただき、このプロセスにより、それぞれ Flag-hPellino3a および Flag-hPellino3b、6xMyc-hPellino3a および 6xMyc-hPellino3b が得られました。全長マウス Pellino3 cDNA をマウス初代肝細胞から増幅し、pcDNA-Flag ベクターの EcoRI および XhoI 部位、または pCS3+MTBX ベクターの XhoI および SalI 部位にサブクローニングし、Flag-mPellino3 または Myc-mPellino3 を生成しました。全長ヒト GSK3β cDNA を、HA-GSK3β49 をコードする前述のプラスミドから PCR によって増幅し、pCS3+MTBX ベクターの EcoRI および SalI 部位、または pCS5-Flag ベクターの EcoRI および NcoI 部位にサブクローニングして、6xMyc- GSK3βまたはFlag-GSK3β。全長マウス GSK3β を pCS5-Flag ベクターの EcoRV および NcoI 部位にサブクローニングし、Flag-mGSK3β を生成しました。完全長の JNK1、JNK2、および MLK3 cDNA を Addgene (米国マサチューセッツ州ウォータータウン) から購入し、PCR 増幅後に pcDNA-Flag ベクターの EcoRV および XhoI 部位にサブクローニングしました。全長ヒトMKK4およびMKK7 cDNAをHEK293細胞のcDNAから増幅し、pcDNA-FlagベクターのBamHI/XhoIおよびEcoRI/XhoI部位にサブクローニングし、それぞれFlag-MKK4およびFlag-MKK7を得た。ヒト Pellino3a および Pellion3b およびマウス Pellino3 cDNA の触媒的に不活性な変異体は、Flag-hPellino3a、Flag-hPellino3b、および Flag-mPellino3 をテンプレートとして使用し、QuikChange Mutagenesis キット (Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州、米国) を使用して生成され、Flag-hPellino3a が得られました。 -CI、Flag-hPellino3b-CI、および Flag-mPellino3-CI。マウス GSK3β-S9A 変異体も QuikChange Mutagenesis キットを使用して生成され、Flag-mGSK3β-S9A が得られました。 HA タグ付きユビキチン (HA-Ubi) および His タグ付きユビキチン (His-Ubi) をコードするプラスミドは以前に記載されています 47,48。この研究におけるすべての構築物の PCR 生成部分は、配列決定によって検証されました。この研究で PCR 増幅と部位特異的突然変異誘発に使用したプライマーの配列を補足表 3 に示します。

免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイは、以前に記載されているように実行されました 49。イムノブロッティングおよび免疫沈降に使用される抗体の会社名、カタログ番号、種、および希釈率を補足表 4 に記載します。総 RNA の単離および cDNA 合成は、前述のように実行されました 49。リアルタイム qRT-PCR に使用される Peli3、Tnf、および Ifn1 mRNA のプライマーの配列を補足表 1 に示します。リアルタイム qRT-PCR は、CFX Connect リアルタイム PCR マシンと iQ SYBR Green SuperMix ( Bio-Rad、Hercules、CA、USA) を使用して、次の条件下で遺伝子の発現を測定します: 95 °C で 10 秒間、62 °C で 10 秒間、および 72 °C で 30 秒間の 40 サイクル。再現性を確保するために、すべての反応を独立して少なくとも 3 回繰り返しました。

イムノブロットを含むすべての実験は、3 つの独立した生物学的複製を使用して実行されました。結果は平均値 ± SD として表されます。統計的有意性は、GraphPad Prism 5 ソフトウェア (GraphPad、米国カリフォルニア州ラホーヤ) を使用して、一元配置または二元配置 ANOVA によって計算されました。 P < 0.05 は統計的有意性を示すとみなされました。

組織学的分析、好中球浸潤、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸ニックエンド標識 (TUNEL) アッセイ、初代肝細胞単離、グルタチオンおよび活性酸素種の測定、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)- の詳細臭化 2,5-ジフェニルテトラゾリウム (MTT) およびリソソーム活性アッセイ、サイトゾルおよびミトコンドリア抽出物の分画、イムノブロッティング、免疫沈降、in vitro ユビキチン化アッセイ、ELISA およびミエロペルオキシダーゼ (MPO) アッセイは、補足情報に記載されています。

固有の E3 リガーゼ活性を持つ Pellino3 タンパク質は、JNK や p3843,44 などの MAPK の活性化に関与していることが報告されていますが、APAP 誘発性肝損傷におけるその病態生理学的役割は不明です。 APAP誘発性肝損傷におけるPellino3の正確な機能に対処するために、我々は全身Peli3-/-KOマウスを作製した（補足図1a）。 Pellino3 タンパク質に対する市販の抗体はすべて内因性 Pellino3 発現を検出できなかったため、Peli3 遺伝子のノックアウトはジェノタイピングと定量的リアルタイム RT-PCR によって確認されました（補足図 1b、c）。全身 Peli3-/- KO マウスと野生型 (Peli3+/+ WT) マウスに高用量の APAP (500 mg/kg) を経口投与し、4 日間生存率を観察しました。 4日目では、Peli3-/- KOマウス（n = 15）は80％の生存率を示しましたが、Peli3+/+ WTマウス（n = 15）は20％の生存率を示しました（P <0.05）（図1a）。さらに、肝臓損傷のバイオマーカー、すなわち血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）のレベルは、Peli3+/+ WTマウスと比較してPeli3-/- KOマウスで有意に減少しました（図1b）。これらの結果と一致して、肝臓組織のヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色は、Peli3+/+ WT マウスでの APAP 処理によって誘発される小葉中心壊死性細胞死と免疫細胞浸潤が、Peli3-/- KO マウスでは有意に減少していることを示しました（図1c)。 Peli3-/- KO マウスの TUNEL アッセイは、肝臓における細胞死の減少を裏付けました (図 1d、e)。さらに、IL-1β、IL-6、TNFαなどの炎症促進性サイトカインのレベルは、Peli3+/+ WTマウスと比較して、Peli3-/- KOマウスの血清におけるAPAP治療により大幅に減少しました（図1f- h)。これらのサイトカインの発現の減少と一致して、好中球マーカーLy6GおよびLy6Cの免疫組織化学およびMPOアッセイは、Peli3-/- KOマウスの肝臓における好中球の浸潤の減少を示した（図1i、j）。

a Peli3-/- マウスおよび野生型 (WT) 同腹子に 500 mg/kg APAP を経口投与し、マウスの全生存率を指定の時間にモニタリングしました。グループあたり n = 15。データはログランク検定によって統計的に分析されました (**対照群、Peli3+/+ WT マウスと比較して P < 0.05)。 b 血清ALTおよびASTのレベルは、APAPの経口投与の24時間後に測定されました。グループあたり n = 5。 Sham は蒸留水 (DW) の投与を示します。データは、二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較検定によって統計的に分析されました (表示されたグループと比較して **P < 0.01 および ****P < 0.0001)。棒は平均値 ± SD を表します。 c APAPの経口投与から24時間後にPeli3-/-マウスおよびWTマウスから単離した肝臓のH&E染色。スケールバー、100 μM (元の画像)、500 μM (拡大挿入図)。 d 経口投与から24時間後のPeli3-/-マウスおよびWTマウスの肝臓のTUNELアッセイ。スケールバー、100 μm (元の画像)、500 μm (拡大挿入図)。 e TUNEL アッセイからセクション内の少なくとも 5 つのホットスポットが選択され、平均カウントが決定されました。データは、二元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定によって統計的に分析されました (**示されたグループと比較して P < 0.01)。棒は平均値 ± SD を表します。 APAPの経口投与から24時間後のPeli3-/- KOマウスおよびPeli3+/+ WTマウスの血清中の炎症誘発性サイトカインのf〜h ELISA。グループごとに n = 3。データは、二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較検定によって統計的に分析されました (表示されたグループと比較して、**P < 0.01、***P < 0.001、および ****P < 0.0001)。 i APAPの経口投与から24時間後のPeli3-/-およびWTマウスの肝臓組織切片における好中球マーカーLy6G/Ly6Cの免疫組織化学。スケールバー、100μm。 j APAPの経口投与から24時間後にPeli3-/-マウスおよびWTマウスから得られた肝臓溶解物におけるミエロペルオキシダーゼ活性。グループあたり n = 5。データは、二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較検定によって統計的に分析されました (***示されたグループと比較して P < 0.001)。棒は平均値 ± SD を表します。 (c)、(d)、および (i) では、示されている画像は 3 つの独立した実験の代表です。

APAP誘発性肝損傷におけるPeli3遺伝子の肝細胞特異的役割を実証するために、Peli3 mRNAに対する異なるshRNAを発現する2つのアデノウイルス（Ad-shPeli3 #3およびAd-shPeli3）を注射することにより、Peli3 mRNAが急性肝臓特異的に枯渇するマウスを作製した。 #4) 尾静脈経由。ネガティブコントロールとして、非特異的 shRNA を発現するアデノウイルス (Ad-shCON) を使用しました。定量的リアルタイムRT‒PCR（qRT‒PCR）分析により、コントロールアデノウイルスと比較して、Peli3 mRNAに対する各shRNAを含む組換えアデノウイルスを発現する初代肝細胞におけるPeli3 mRNAの有意な下方制御が示されました（図2a）。ナイスをこれらのアデノウイルスに72時間感染させ、その後14時間絶食させ、その後500 mg/kgのAPAPを経口投与した。 APAP治療後24時間のH&E染色は、Peli3 KDマウス（Ad-shPeli3 #3および#4）の肝臓において、小葉中心壊死細胞死などのAPAP治療によって誘発された肝損傷が大幅に減少したことを示しました（図2b）。 TUNEL アッセイでは、Peli3 KD マウスの肝臓における細胞死の減少も示されました (図 2c)。さらに、血清ALTおよびASTレベルは、対照マウスと比較してPeli3 KDマウスで有意に減少しました（図2d）。これらの結果は、肝細胞における Peli3 欠損が APAP 誘発性肝損傷を減少させることを強く示唆しています。

a マウスに、尾静脈を介して、Peli3 mRNA (Ad-shPeli3 #3 および Ad-shPeli3 #4) を標的とする shRNA を発現するアデノウイルスを感染させました。非特異的 shRNA を発現するアデノウイルス (Ad-shCON) をコントロールとして使用しました。これらのウイルスの感染後 96 時間での肝細胞における Peli3 mRNA のノックダウンは、qRT-PCR 分析によって確認されました。グループごとに n = 3。データは、二元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定によって統計的に分析されました (表示されたグループと比較して ***P < 0.001)。棒は平均値 ± SD を表します。 b、c マウスに組換えアデノウイルスを感染させ、72時間後にマウスを14時間絶食させ、その後500 mg/kgのAPAPを経口投与した。 APAP の経口投与 24 時間後に Peli3 ノックダウンマウス (Ad-shPeli3 #3 および Ad-shPeli3 #4) およびコントロールマウス (Ad-shCON) から単離した肝臓の H&E 染色 (b) および TUNEL アッセイ (c) を実行しました。スケールバー、100 μm (元の画像) および 500 μm (拡大挿入図)。画像は 3 つの独立した実験の代表です。 d 血清ALTおよびASTのレベルは、APAPの経口投与の24時間後に測定されました。グループあたり n = 5。データは、二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較検定によって統計的に分析されました (表示されたグループと比較して、**P < 0.01、***P < 0.001、および ****P < 0.0001)。棒は平均値 ± SD を表します。 b–d Sham は蒸留水 (DW) の投与を示します。

Pellino3 は、Toll 様受容体シグナル伝達、NOD2 シグナル伝達、TNF シグナル伝達経路などの多様な炎症性シグナル伝達経路の調節に必要であることが示されている 39,40,41,42 ため、次に、TNFα などの標的遺伝子の発現を調べました。 Pellino3 が同じ標的遺伝子の制御を通じて APAP 肝毒性を媒介するかどうかを理解するために、肝細胞の I 型インターフェロンを調べます。 Peli3欠損は、骨髄由来マクロファージにおいてNOD2リガンドによって誘導されるTNFαの発現を阻害し、ポリ(I:C)によって誘導されるIFNβの発現を増強するが39,41、肝細胞におけるPeli3欠損は、 APAP治療との関連におけるTNFαおよびIFNβ mRNA（補足図2a、b）。対照的に、全肝臓抽出物のqRT-PCR分析は、APAP処理時のTNFαとIFNβの両方の発現レベルが、Peli3+/+ WTマウスと比較してPeli3-/- KOマウスで減少していることを示しました（補足図2c、d）。この不一致は、免疫細胞と肝細胞を含む全肝臓抽出物の特性によるものと思われます。したがって、APAP 肝毒性における Pellino3 の機構的な役割は、炎症性シグナル伝達経路における Pellino3 の役割とは異なる可能性があります。ただし、APAP 治療の状況における IFNβ 発現レベルが、NOD2 シグナル伝達に関する以前の所見と反対であることは注目に値します 39。これは、Pellino3 が現在の知識に基づいて特定されていないメカニズムを通じて APAP 肝毒性に寄与している可能性を示唆しています。ペリーノ3について。

次に、APAP過剰摂取の発症後のPeli3枯渇が治療効果を示すかどうかを調査しました。この目的を達成するために、我々はまず、APAP 治療中の初代肝細胞における Peli3 mRNA の発現レベルを調べました。リアルタイムqRT-PCR分析は、肝細胞におけるPeli3発現が初期および後期の時点でAPAP治療による影響を最小限に抑えていることを示しました（図3a）。 Peli3 mRNA に対する shRNA を発現する組換えアデノウイルスが内因性 Peli3 mRNA レベルを低下させる時点を決定するために、Peli3+/+ WT マウスに尾静脈を介して組換えアデノウイルス (Ad-shPeli3 #3) を注射しました。示された時点で初代肝細胞を分離した後、Peli3 mRNA の発現を qRT-PCR によって分析しました。内因性 Peli3 mRNA 発現は、Ad-shPeli3 #3 ウイルスの注射後 24 時間では影響を受けませんでしたが、注射後 72 時間で最初に顕著な減少が検出されました (図 3b)。これらの結果に基づいて、WT マウスに組換えアデノウイルスを感染させ、14 時間絶食させ、500 mg/kg APAP を経口投与し、その後の生存を観察しました（図 3c）。組換えアデノウイルスによるPeli3の枯渇は、対照アデノウイルス（Ad-shCON）を注射したWTマウスの生存率と比較して、APAP過剰摂取の発症後72時間および96時間の両方で生存率を有意に増加させました（図3c）。これらの結果は、Peli3 KD が APAP 誘発性肝損傷の治療において治療可能性を持っている可能性があることを示唆しています。

a APAP 処理後の指定の時点での正常な初代肝細胞における Peli3 mRNA の発現は、qRT-PCR 分析によって確認されました。 b Peli3 特異的 shRNA (Ad-shPeli3 #3) を発現する組換えアデノウイルスに感染した初代肝細胞における Peli3 mRNA 発現の減少が、示された時間で qRT-PCR 分析によって確認されました。 a、b データは 3 つの独立した実験の代表であり、二元配置分散分析とそれに続く Sidak の多重比較検定によって統計的に分析されました (表示されたグループと比較して ***P < 0.001)。 ns; 重要ではありません。棒は平均値 ± SD を表します。 c Peli3+/+ WT マウスに、Peli3 特異的 shRNA を発現する組換えアデノウイルス (Ad-shPeli3 #3 および Ad-shPeli3 #4) または非特異的 shRNA を発現する対照アデノウイルス (Ad-shCON) を感染させ、その後 14 時間絶食させました。 APAP (500 mg/kg) を経口投与し、指定された時間でマウスの全生存率をモニタリングしました。グループあたり n = 14 または 15。データはログランク検定によって統計的に分析されました (**対照群 Ad-shCON と比較して P < 0.05)。

Peli3 欠損は APAP 誘発性肝損傷を減少させるため、Pellino3 が APAP 代謝に影響を与える可能性があります。この可能性を確認するために、APAP を代謝する肝チトクロム P450 2E1 をコードする CYPE21 遺伝子の発現を調査しました。イムノブロット分析により、Peli3-/- KO肝細胞におけるCYP2E1遺伝子の発現がPeli3+/+ WT肝細胞における発現と類似していることが示され、Peli3欠損がAPAP代謝に影響を及ぼさないことが示された（図4a）。次に、GSH 枯渇が APAP 誘発肝毒性の主要な要素であるため、Peli3-/- KO マウスの肝臓における GSH レベルを Peli3+/+ WT マウスと比較して調べました2。この目的を達成するために、本発明者らは、Peli3+/+ WT マウスおよび Peli3-/- KO マウスから初代肝細胞を単離し、続いてそれらを 20 mM APAP で 2 時間処理した。予想通り、酸化型グルタチオン（GSSG）と還元型グルタチオン（GSH）の両方を含む総GSHレベルは、APAP処理によりPeli3+/+ WTマウスの初代肝細胞で減少しました（図4b）。しかし、その後、Peli3-/- KOマウスにおける総GSHレベルは、Peli3+/+ WTマウスほどには減少しなかった(図4b)。これらの結果と一致して、酸化型グルタチオン（GSSG）レベルおよびGSHに対するGSSGの比率は、Peli3+/+ WTマウスの初代肝細胞で増加し、Peli3-/- KOマウスでは大幅に減少しました（図4c、d）。これらの結果は、Peli3 欠損が APAP 誘発性肝損傷における GSH 枯渇の減少につながることを示しました。

a Peli3-/- KO マウスおよび Peli3+/+ WT マウスの初代肝細胞における肝シトクロム P450 2E1 (CYP2E1) タンパク質の発現を、20 mM APAP での指定時間の処理中にモニタリングしました。 b〜d Peli3-/-およびWTマウスの初代肝細胞における総グルタチオン（b：GSH + GSSG）および酸化型グルタチオン（c：GSSG）のレベル、およびGSSG対GSH比（d）は、2で測定されました。 20 mM APAP 処理後の時間。グループごとに n = 3。 e 初代肝細胞の活性酸素種 (ROS) は、H2-DCFDA を使用したフローサイトメトリーによって測定され、定量されました。グループごとに n = 3。 f Peli3-/- KO マウスおよび Peli3+/+ WT マウスの初代肝細胞を MitoSOX Red 色素とインキュベートし、20 mM APAP で 4 時間処理し、フローサイトメトリーで MitoSOX 蛍光を分析しました。グループごとに n = 3。 g Peli3-/- KO マウスおよび Peli3+/+ WT マウスの初代肝細胞におけるスーパーオキシドジスムターゼ 2 (SOD2) の発現を、20 mM APAP での指定時間の処理中にモニタリングしました。 h 2匹の独立したPeli3-/- KOマウスおよびPeli3+/+ WTマウスから得られた初代肝細胞におけるヒストンH2AXのリン酸化を、示された時間にイムノブロットによってモニタリングした。（ｉ）ミトコンドリア機能の評価のために、ＡＰＡＰで４時間処理した後に収集したＰｅｌｉ３−／−ＫＯマウスおよびＰｅｌｉ３＋／＋ＷＴマウスの初代肝細胞のＭＴＴアッセイを行った。グループごとに n = 3。 j 自己消光基質を使用したリソソーム活性アッセイを、APAP で 8 時間処理した後の Peli3-/- KO マウスおよび Peli3+/+ WT マウスの初代肝細胞を用いて実施しました。グループごとに n = 3。 b–f、i、j データは、二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較検定によって統計的に分析されました (*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、および ****P < 0.0001)示されたグループと比較)。棒は平均値 ± SD を表します。 (a)、(g)、および (h) に示されている画像は、3 つの独立した実験の代表です。

APAP肝毒性におけるGSH枯渇はROSの生成に関連しているため、次に、H2-DCFDA色素を使用したフローサイトメトリー分析によって、20 mM APAP処理時のPeli3+/+ WTおよびPeli3-/- KOマウスの初代肝細胞におけるROSレベルを測定しました。。 APAP処理の4時間後、ROSレベルはPeli3+/+ WTマウスの肝細胞で増加し、Peli3-/- KOマウスの肝細胞では有意に減少しました（図4e）。細胞内 ROS に加えて、MitoSOX 染色は、Peli3+/+ WT 肝細胞と比較して、Peli3-/- KO 肝細胞では APAP 処理によりミトコンドリア ROS のレベルが大幅に低下したことを示しました（図 4f）。さらに、ROSを排除するスカベンジャータンパク質として機能するミトコンドリアスーパーオキシドジスムターゼ2（SOD2）の発現は、Peli3-/- KOマウスのAPAP処理初代肝細胞では維持されていたのに対し、Peli3+/+ WTマウスでは発現の低下が観察された。 (図4g)。 APAP 肝毒性における酸化ストレスとニトロソ化ストレスは DNA 損傷とミトコンドリア機能不全を誘発することが知られているため、次に、Peli3+/+ WT から得た肝細胞における二本鎖切断 (DSB) の特徴であるヒストン H2AX (pH2AX) のリン酸化を調べました。およびＡＰＡＰ処置時のＰｅｌｉ３−／−ＫＯマウス。ヒストンH2AXのリン酸化は、Peli3-/- KOマウスにおいて有意に減少した(図4h)。 Peli3-/- KO マウスのミトコンドリア機能を評価するために、MTT アッセイによってミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性を評価しました。 Peli3+/+ WT 肝細胞のミトコンドリア機能は、APAP 処理後に著しく損なわれましたが、Peli3-/- KO 肝細胞ではそうではありませんでした（図 4i）。次に、自己消光基質を使用して、APAP で 8 時間処理した後の Peli3-/- KO および Peli3+/+ WT マウスの初代肝細胞における in situ リソソーム酵素活性を定量しました。リソソーム酵素活性は、APAP処理後に引き起こされたリソソーム損傷を反映して、Peli3+/+肝細胞においてAPAPによって増加しましたが、酵素活性はPeli3-/-肝細胞では減少しました（図4j）。これらの結果は、Peli3欠損がAPAP治療時の酸化ストレスを減少させることによってミトコンドリアおよびリソソーム損傷の抑制に寄与することを示す強力な証拠を提供する。

次に、APAP 誘発性肝損傷における Pellino3 タンパク質の分子機能を調査しました。 Pellino3の活性がJNK43の活性化を引き起こすことがわかっているため、手がかりを見つけるために、我々はまずPellino3タンパク質とAPAP誘発性肝障害に関与する多様なキナーゼとの相互作用を調べた。ヒトでは選択的スプライシングによって生成される Pellino3 タンパク質には Pellino3a と Pellino3b43 の 2 つの形式が存在しますが、マウスでは単一形式の Pellino3 が見られます。この研究で使用したヒト Pellino3 タンパク質とマウス Pellino3 タンパク質は、それぞれ hPellino3 と mPellino3 と呼ばれます。

免疫共沈降アッセイにより、より長い形態であるヒトPellino3aタンパク質はMAP3KであるGSK3βおよびMLK3に強く結合するが、JNKには弱く結合することが明らかになった（図5a）。同様に、短い形式の hPellino3b も GSK3β および MLK3 に結合しました (補足図 3a、b)。これらの結果により、我々は、E3 リガーゼ活性を持つヒト Pellino3 タンパク質が GSK3β と MLK3 のユビキチン化を誘導するかどうかを調査するようになりました。 HA-GSK3βおよびHis-Ubiをコードするプラスミドを、野生型Flag-hPellino3、Flag-hPellino3b、またはhPellino3aまたはhPellino3bの活性部位内のシステイン残基がアラニンに変異した触媒不活性変異体の存在下でHEK293細胞にコトランスフェクトしました。次に、Ni-NTA プルダウンアッセイを実行しました。 GSK3βのポリユビキチン化は両方のヒトPellino3タンパク質で観察されましたが、hPellino3aおよびhPellino3bの触媒的に不活性な変異体では観察されませんでした（図5b）。さらに、GSK3βタンパク質のポリユビキチン化は野生型Flag-mPellino3でも見出されましたが、mPellino3の触媒的に不活性な変異体では見られませんでした（図5c）。 GSK3βとは異なり、MLK3タンパク質はhPellino3aおよびhPellino3bによってポリユビキチン化されませんでした（補足図4）。これらの結果は、ヒトとマウスの Pellino3 の両方が、GSK3β のポリユビキチン化を通じて APAP 誘発肝損傷を特異的に制御している可能性を示しました。 Pellino3 が MLK3 との相互作用を通じて APAP 肝毒性を調節する可能性を排除するわけではありませんが、Pellino3 を介した GSK3β のポリユビキチン化に基づいて、APAP 誘発性肝障害の分子機構の同定に焦点を当てました。マウス初代肝細胞における Pellino3 と GSK3β の内因性相互作用をさらに確認するために、免疫沈降アッセイを実行しました。しかし、Pellino3 に対する市販の抗体はすべて内因性 Pellino3 発現を検出しなかったため、2 つのタンパク質間の内因性相互作用を確認することはできませんでした。これらの問題にもかかわらず、我々は、Flag-mPellino3をコードするプラスミドをPeli3-/- KO初代肝細胞にトランスフェクトした。示された期間のAPAP処理後、抗Flag抗体を用いて免疫沈降アッセイを実施した。 Peli3-/- KO肝細胞で異所的に発現したFlag-Pellino3タンパク質は、APAP処理後2時間で内因性GSK3βと特異的に相互作用した（図5d）。

a HA-hPellino3 をコードするプラスミドを、示された Flag タグ付きプラスミドとともに HEK293 細胞に同時トランスフェクトしました。細胞溶解物を抗Flag抗体で免疫沈降(IP)し、続いて抗HAおよび抗Flag抗体で免疫ブロット(IB)しました。全細胞溶解物 (TCL) を、示された抗体で免疫ブロットしました。 b Flag-hPellino3a、Flag-hPellino3a-CI、Flag-hPellin3bおよびFlag-hPellino3b-CIの非存在下または存在下で、野生型His-UbiをコードするプラスミドをHA-GSK3βとともにHEK293細胞にコトランスフェクトした後、Ni-NTA-媒介プルダウンアッセイを実施した。 TCL を指定の抗体で免疫ブロットしました。 c 6xMyc-GSK3βおよびHA-Ubiをコードするプラスミドを、野生型Flag-mPellino3またはFlag-mPellino3の触媒不活性（CI）変異体（Flag-mPellino3-CI）をコードするプラスミドとともにHEK293細胞にコトランスフェクトしました。 GSK3βのユビキチン化は、1% SDS変性条件下での抗Myc抗体を用いた免疫沈降および抗HA抗体を用いた免疫ブロッティングによって調べた。 TCL を指定の抗体で免疫ブロットしました。 d Flag-mPellino3をコードするプラスミドをPeli3-/- KO肝細胞にトランスフェクトし、続いて20mMで示された時間処理した。細胞溶解物を抗Flag抗体で免疫沈降し、続いて抗GSK3β抗体で免疫ブロットした。 TCL を指定の抗体で免疫ブロットしました。 e 内因性GSK3βタンパク質のユビキチン化のために、Peli3-/-マウスおよびWTマウスの初代肝細胞を20mM APAPで2時間または4時間処理した。細胞溶解物を 1% SDS 変性条件下で抗 GSK3β 抗体で免疫沈降し、その後抗ユビキチン (FK2-HRP) 抗体で免疫ブロットしました。 TCL を指定の抗体で免疫ブロットしました。陰性対照として、細胞溶解物を抗 IgG 抗体で免疫沈降しました。 f 野生型ユビキチン (HA-Ubi-WT) または K48 結合型 (HA-Ubi-K48) または K63 結合型 (HA-Ubi-K63) ポリユビキチン化のみを媒介するユビキチン変異体をコードするプラスミドを 6xMyc で HEK293 細胞にトランスフェクトしました。 -GSK3β と Flag-hPellino3a を指定の組み合わせで使用します。細胞溶解物を抗 Myc 抗体で免疫沈降 (IP) し、続いて抗 HA 抗体で免疫ブロット (IB) しました。 TCL を指定の抗体で免疫ブロットしました。 g HA-GSK3βをコードするプラスミドをHEK293細胞に同時トランスフェクトし、Flag-hPellino3aの発現を用量依存的に増加させました。細胞溶解物を、示された抗体で免疫ブロットしました。すべてのイムノブロットでは、β-アクチンの発現をローディングコントロールとして使用しました。この図の画像は、少なくとも 3 つの独立した実験を表しています。

次に、APAP誘発性肝障害におけるPellino3媒介GSK3βポリユビキチン化の重要性を検証するために、内因性GSK3βのポリユビキチン化がPellino3によって調節されているかどうかを調べた。 Peli3+/+ WT および Peli3-/- KO マウスから肝細胞を単離し、APAP で指定の時間処理し、1% SDS 変性条件下で内因性 GSK3β タンパク質に対する抗 GSK3β 抗体で免疫沈降し、内因性 GSK3β ポリユビキチン化をイムノブロッティングで観察しました。抗ユビキチン抗体を使って。 Peli3+/+ WT肝細胞では、APAP処理後最大4時間まで、内因性GSK3βのポリユビキチン化の増加が観察されました（図5e）。しかし、内因性GSK3βのポリユビキチン化は、Peli3-/- KO肝細胞では大幅に減少しました（図5e）。ポリユビキチン化プロセスには特定の基質への E3 リガーゼの結合が必要であるため、我々の結果は、Pellino3 が GSK3β への直接結合を介して APAP 誘発性肝障害における GSK3β のポリユビキチン化に関与していることを強く示しています。

これらの発見に基づいて、次に、ヒト Pellino3 による GSK3β のポリユビキチン化パターンを調査しました。野生型ユビキチン（HA-Ubi）、リジン48残基を除く6残基がアルギニンに置換されたK48ユビキチン変異体（HA-Ubi-K48）、リジンのみが置換されたK63ユビキチン変異体（HA-Ubi-K63） 63 は無傷のままで、Flag-hPellino3a の非存在下または存在下で 6xMyc-GSK3β とともに HEK293 細胞に同時トランスフェクトされました。 K63結合GSK3βポリユビキチン化はPellino3によって増加したが、K48結合は増加しなかった（図5f）。 K63 結合ポリユビキチン化は、シグナル伝達、タンパク質輸送、タンパク質間相互作用、DNA 修復などのさまざまな細胞活動に関与していることが知られているため、Pellino3 による K63 結合 GSK3β ポリユビキチン化が GSK3β 媒介シグナル伝達に影響を与える可能性があります。 APAP 誘発性肝損傷に影響を与えず、GSK3β タンパク質の安定性に影響を与えません。実際、ヒト Pellino3 の発現は GSK3β の安定性に用量依存的な影響を与えず、このプロセスは K48 結合ポリユビキチン化によって媒介されます (図 5g)。

我々の今回の発見は、Pellino3 が E3 リガーゼとして作用して GSK3β のポリユビキチン化を誘導することを強く示しています。 GSK3β は細胞質内で構成的に活性であり、その活性はチロシン 216 のリン酸化によって増強されるか、セリン 9 (Ser9) のリン酸化によって阻害されます 53,54。興味深いことに、APAP 治療は、GSK3β の活性型と阻害型の両方のリン酸化を増加させ、リン酸化された GSK3β タンパク質と総 GSK3β タンパク質の両方のミトコンドリアへの移行を引き起こすことが知られています 32。しかし、なぜAPAP媒介性肝損傷においてGSK3βの阻害型が増強されるのか、またGSK3βがどのようにミトコンドリアに移行するのかは依然として不明である。

したがって、我々は次に、Pellino3 が APAP 誘発性肝損傷において GSK3β の機能をどのように調節するかを調べました。この目的のために、本発明者らは、APAPを経口投与されたPeli3+/+ WTおよびPeli3-/- KOマウスから得られた肝細胞におけるGSK3βのリン酸化およびミトコンドリア転座を調査した。 GSK3βのSer9でのリン酸化レベルはPeli3-/- KOマウスで有意に減少したが、チロシン216（Tyr216）のリン酸化はPeli3欠損の影響をほとんど受けなかった（図6a）。細胞質およびミトコンドリア分画アッセイにより、Peli3+/+ WT 肝細胞において、総 GSK3β および Ser9 でリン酸化された GSK3β の両方のミトコンドリア転座が APAP 処理の 1 時間後に開始されることが明らかになりました。対照的に、GSK3βのミトコンドリア転座およびSer9でのリン酸化は、Peli3+/+ WTマウスと比較して、Peli3-/- KOマウスでは有意に減少した(図6b)。しかし、Peli3-/-肝細胞のミトコンドリア画分におけるSer9におけるGSK3βのリン酸化の減少は、総GSK3βのミトコンドリア転座の減少によるものと思われる。

a 500 mg/kg APAPの経口投与後の指定の時間にPeli3-/-およびWTマウスから単離した全肝臓溶解物を、指定の抗体で免疫ブロットし、GSK3βのリン酸化を調べた。 b Peli3-/-およびWTマウスから単離した初代肝細胞を20 mM APAPで指定の時間処理し、その後細胞質抽出物とミトコンドリア抽出物に分画しました。両方の抽出物を、Ser9 でリン酸化された GSK3β および総 GSK3β に対する指定の抗体を用いて免疫ブロットしました。チューブリンおよびCOX IVの発現を、それぞれ細胞質マーカーおよびミトコンドリアマーカーおよび負荷コントロールとして使用しました。 c 500 mg/kg APAPの経口投与の4時間後にPeli3-/-およびWTマウスから得られた全肝臓溶解物を抗体で免疫ブロットし、リン酸化およびJNKの総レベルを検出した。 d Peli3-/-およびWTマウスから単離した初代肝細胞を20 mM APAPで2時間または4時間処理し、その後細胞質抽出物とミトコンドリア抽出物に分画しました。両方の抽出物を、示された抗体で免疫ブロットしました。 e レスキュー実験のために、野生型 Flag-Pellino3 または Pellino3 の触媒不活性 (CI) 変異体を、Peli3-/- マウスから得た初代肝細胞にトランスフェクトしました。対照として、モックベクターを野生型マウスから得た初代肝細胞にトランスフェクトした。両方の肝細胞セットを 20 mM APAP で 2 時間処理した後、それらを細胞質抽出物とミトコンドリア抽出物に分画し、続いて指定の抗体で免疫ブロットして、Ser9 残基における GSK3β のリン酸化と GSK3β の総レベルを検出しました。 (d) と (e) では、チューブリンと COX IV を細胞質およびミトコンドリアのマーカーとローディングコントロールとして使用しました。 f 野生型Flag-mGSK3β、Flag-mGSKβ-S9A変異体およびHA-Ubiをコードするプラスミドを、示された組み合わせに従ってMyc-mPellino3をコードするプラスミドとともにHEK293細胞に同時トランスフェクトした。 GSK3βのユビキチン化は、抗Flag抗体を使用した免疫沈降および抗HA-HRP抗体を使用した免疫ブロッティングによって検査されました。全細胞溶解物 (TCL) を、示された抗体で免疫ブロットしました。 g Peli3+/+ WT マウスの初代肝細胞を野生型 Flag-mGSK3β または Flag-mGSK3β-S9A 変異体でトランスフェクトし、続いて APAP で 8 時間処理しました。細胞抽出物を抗リン酸 H2AX 抗体および抗 Flag 抗体で免疫ブロットしました。 h HA-Ubi-WT、HA-Ubi-K48、および HA-Ubi-K63 をコードするプラスミドを、示された組み合わせに従って Peli3+/+ WT および Peli3-/- KO 肝細胞にトランスフェクトした後、細胞を 20 mM APAP で 1 時間処理しました。 2 時間放置し、細胞抽出物を指定の抗体で免疫ブロットしました。 a、c、f、g、h β-アクチンの発現をローディングコントロールとして使用しました。この図のすべての免疫ブロット画像は、少なくとも 3 つの独立した実験の代表です。

次に、JNK の活性化は APAP 肝毒性中に GSK3β の下流であり、JNK もミトコンドリアに移行することが報告されているため、APAP 誘発性肝障害における JNK の活性化に対する Peli3 欠損の影響を調べました 27,34。 APAPを経口投与された独立したPeli3+/+ WT（n = 5）およびPeli3-/- KO（n = 3）マウスから肝細胞を単離した後、イムノブロッティングによりJNKのリン酸化を分析しました。 APAP処理すると、JNKのリン酸化は3匹の独立したPeli3+/+ WTマウスで増加し、Peli3-/- KOマウスでは大幅に減少しました（図6c）。さらに、細胞質からのリン酸化JNKおよび総JNKのミトコンドリア移行は、Peli3+/+ WTマウスと比較して、Peli3-/- KOマウスにおけるAPAP処理により有意に減少した（図6d）。 GSK3βについて見出された結果と同様に、Peli3-/-肝細胞のミトコンドリア画分におけるJNKのリン酸化の減少は、JNKのミトコンドリア転座の減少によって引き起こされるようである。これらの結果は、Pellino3 が GSK3β のリン酸化とミトコンドリア転座を制御する上流シグナル伝達成分であり、その後、APAP 誘発肝傷害における細胞質の JNK リン酸化と JNK のミトコンドリア転座を制御することを示唆しています。

次に、GSK3βのリン酸化とミトコンドリア転座におけるPellino3のE3リガーゼ活性の重要性を明確に評価するためにレスキュー実験を実施しました。 Peli3-/- KO マウスおよび Peli3+/+ WT 肝細胞から得られた肝細胞をそれぞれ野生型 mFlag-Pellino3 または Pellino3 の触媒不活性変異体 (Flag-mPellino3-CI) でトランスフェクトし、肝細胞を APAP で 1 分間処理しました。 2 時間放置し、その後細胞質画分とミトコンドリア画分に分離しました。我々の以前の結果（図６ａ、ｂ）と同様に、ＧＳＫ３βミトコンドリア転座およびＳｅｒ９リン酸化は、Ｐｅｌｉ３＋／＋ＷＴ肝細胞と比較して、Ｐｅｌｉ３−／− ＫＯ肝細胞において減少した（図６ｅ；レーン２、４、１０、１２）。興味深いことに、Peli3-/- KO肝細胞における野生型mPellino3の異所性発現は、ミトコンドリア転座とGSK3βのSer9リン酸化を有意に回復させたのに対し（図6e;レーン4、6、12、14）、触媒的に不活性な変異体の発現は回復した。 Pellino3 (Flag-mPellino3-CI) ではこの効果は得られませんでした (図 6e; レーン 6、8、14)。これらの結果は、Pellino3 の E3 リガーゼ活性が APAP 誘発性肝損傷における GSK3β の制御に重要であることを示唆しています。

我々の現在の発見は、GSK3β Ser9リン酸化にはPellino3のE3リガーゼ活性が必要であることを示していますが（図6a、b）、Ser9でのGSK3βのリン酸化がPellion3媒介GSK3βのユビキチン化に必要である可能性があります。この可能性をテストするために、Ser9 残基がアラニンに置換された GSK3β-S9A 変異体のユビキチン化を調べました。 GSK3β-S9A変異体は、野生型GSK3βと同様に、野生型Pellino3タンパク質によってポリユビキチン化された（図6f）。我々の現在の発見と併せて考えると、これらの結果は、Pellino3媒介によるGSK3βのユビキチン化がAPAP肝毒性に必須であるGSK3β Ser9リン酸化の上流にあり、Ser9でのGSK3βのリン酸化がPellino3によるGSK3βユビキチン化の前提条件ではないことを示している。実際、APAP肝毒性におけるSer9でのGSK3βのリン酸化の重要性は、Peli3+/+ WT肝細胞におけるGSK3β-S9A変異体の異所性発現がAPAP処理時にヒストンH2AXのリン酸化を増加させなかったという結果によって確認されました（図6g））。

さらに、我々は、GSK3βのSer9リン酸化およびそのミトコンドリア転座における、Pellino3によるGSK3βのK63結合ポリユビキチン化の重要性を調べた。 K48 (HA-Ubi-K48) または K63 (HA-Ubi-K63) ユビキチン変異体をコードするプラスミドを Peli3+/+ WT または Peli3-/- KO 初代肝細胞に一時的にトランスフェクトし、その後細胞を APAP で 2 時間処理しました。。対照として、野生型ユビキチン (HA-Ubi-WT) も初代肝細胞にトランスフェクトされました。 Peli3+/+ WT 肝細胞における GSK3β の Ser9 リン酸化とそのミトコンドリア転座は、野生型ユビキチン (HA-Ubi-WT) および K48 ユビキチン変異体 (HA-Ubi-K48) の存在下での APAP 処理によって基本的に増加しました (図6hおよび補足図5）。対照的に、K63 ユビキチン変異体 (HA-Ubi-K63) の発現は、HA-Ubi-WT および HA-Ubi-K48 で得られた結果と比較して、APAP 処理による内在性 GSK3β の Ser9 リン酸化とそのミトコンドリア転座をさらに増加させました (図6hおよび補足図5）。 HA-Ubi-K63の存在下でのSer9でのGSK3βリン酸化およびそのミトコンドリア転座のこの有意な増加は、Peli3-/- KO初代肝細胞では観察されませんでした（図6hおよび補足図5）。したがって、これらの結果は、Pellino3 による GSK3β の K63 結合ポリユビキチン化が、APAP 誘発性肝損傷における GSK3β の Ser9 リン酸化とミトコンドリア転座に必要であるという現在の発見を裏付けています。

APAP媒介性肝損傷の病態生理学とこの肝毒性を支配するシグナル伝達経路は過去数十年にわたって広範囲に研究されてきたが、APAP誘発性肝臓におけるシグナル伝達成分の翻訳後修飾を調節するユビキチン修飾システムについては明確に理解されていない。けが。小胞体ポリトープ gp78/AMFR (自己分泌運動因子受容体)、パーキン、HOIP などの E3 リガーゼが、ノックアウトマウスまたは RNA 干渉技術を使用した APAP 誘発性肝損傷に関与していることを示唆している研究はわずか 55、56、57 です。

本研究では、Pellino3タンパク質がAPAP誘発性肝障害における新規E3ユビキチンリガーゼであること、およびPellino3によるGSK3βのK63結合ポリユビキチン化が細胞質のSer9におけるGSK3βリン酸化およびミトコンドリア転座を引き起こすことを実証した。リン酸化されたGSK3βは、ミトコンドリアROS、ミトコンドリアの機能不全、DNA損傷のレベルの増加に寄与し、最終的には壊死性細胞死につながります（補足図6）。さらに、Peli3 mRNA 発現が APAP 処理によってほとんど影響を受けないという所見は、APAP 肝毒性においては、Pellino3 と GSK3β の相互作用が Peli3 mRNA の調節よりも重要であることを示しています。したがって、これは、肝細胞においてGSK3βを標的とするE3ユビキチンリガーゼとしてPellino3を同定し、APAPを経口投与されたPeli3-/- KOマウスにおけるその病態生理学的役割を明らかにした最初の研究である。

この研究では、Pellino3 が c-Jun および Elk-1 の活性化を促進し、異なる基質を標的とすることで多様な炎症シグナル伝達経路に関与していることが確認されているため、Pellino3 が APAP 誘発性肝障害において重要な役割を果たしている可能性があるという仮説を立てました 25,43 。本明細書において、本発明者らは、全身Ｐｅｌｉ３−／−ＫＯマウスおよび肝細胞特異的Ｐｅｌｉ３枯渇マウスの両方において、ＡＰＡＰ誘発性肝損傷の減少を明らかに示した。 APAP 肝毒性における Peli3 欠損のこの保護効果は、ミトコンドリア ROS の減少と機能不全および DNA 損傷を伴う、GSK3β のリン酸化およびミトコンドリア転座の減少によるものと考えられます。実際、APAP 治療によって引き起こされる悲惨な変化には GSK3β および JNK のリン酸化とそれらのミトコンドリア転座が必要であり、GSK3β は JNK32,58 の上流にあることを示す証拠が増えています。 Peli3-/- KO マウスに関する我々の現在の発見は、肝細胞における Pellino3 を介した GSK3β のユビキチン化が、APAP 肝毒性におけるミトコンドリア損傷に重要な Ser9 および GSK3β ミトコンドリア転座における GSK3β のリン酸化に必須のステップであることを示す強力な証拠を提供します。しかし、Pellino3 は多様な炎症シグナル伝達経路に関与していることが報告されているため、炎症細胞内の Pellino3 が未確認の方法で APAP 肝毒性に寄与している可能性を排除することはできません。

GSK3βはミトコンドリア活性の重要な調節因子として注目されており、マウスにおけるAPAP治療はGSK3βの活性化とミトコンドリア転座を引き起こすことが知られているが32,58、肝細胞におけるGSK3βのミトコンドリア転座の正確な機構はまだわかっていない。 GSK3βがどのようにミトコンドリアに移行するのかについての手掛かりは、以前に報告されたH9c2心筋芽細胞での実験から得られる可能性がある59。これらの細胞において、GSK3βは、Ser959におけるGSK3βのリン酸化に依存する形で電位依存性陰イオンチャネル2（VDAC2）と相互作用することにより、酸化ストレス下でミトコンドリアに移行する。この以前の発見に基づくと、Pellino3 による GSK3β の K63 結合ポリユビキチン化は、APAP 誘発肝損傷における GSK3β とミトコンドリア膜上の特定の因子との相互作用にとって重要である可能性があります。したがって、我々の研究は、APAP治療時のGSK3βのミトコンドリア転座のメカニズムについての我々の知識をさらに拡大するための手がかりを提供する可能性がある。

しかし、GSK3βにおけるPellino3の機能は、GSK3βのミトコンドリア転座を超えて拡大する可能性がある。 Peli3+/+ WT マウスと比較して、細胞質内の GSK3β Ser9 リン酸化は Peli3-/- KO マウスで有意に減少しましたが、チロシン 216 リン酸化の変化は検出されませんでした。一般に、GSK3β活性はチロシン216リン酸化により増強されるか、Ser9リン酸化により阻害されることが知られている。しかし、その理由は現在まで解明されていないにもかかわらず、APAP 治療は GSK3β の活性型と阻害型の両方のリン酸化を増加させると報告されています 32。 GSK3βのSer9でのリン酸化を直接リン酸化するキナーゼは報告されていないため、Pellino3のE3リガーゼ活性がGSK3βのSer9でのリン酸化を制御する特定のキナーゼを調節している可能性がある。この点で、APAP 治療により MLK3 KO マウスの肝臓抽出物中で GSK3β の発現と GSK3β の基質であるグリコーゲン合成酵素 (GS) のリン酸化が減少したことは注目に値します。これは、MLK3 がAPAP 誘発性肝損傷における正のフィードバックループを介した GSK3β 33。しかし、MLK3 が GSK3β の Ser9 をリン酸化するキナーゼであることを示す直接的な証拠はありません。 Pellino3 が E3 リガーゼ活性とは無関係に MLK3 に結合するという我々の発見を考慮すると、Pellino3 による GSK3β の K63 結合ポリユビキチン化が、MLK3 または未知のキナーゼによる GSK3β Ser9 のリン酸化を促進するかどうかを調査する価値があります。発見の概要と以前の報告で詳述された結果に基づくと、Pellino3 媒介 K63 結合による GSK3β のポリユビキチン化は細胞質における GSK3β の Ser9 リン酸化と決定的に関連しており、Ser9 でのリン酸化は APAP 肝毒性における GSK3β のミトコンドリア転座を促進します。この推測は、H9c2 心筋芽細胞における GSK3β のミトコンドリア転座が Ser9 リン酸化に依存しているという以前の発見によって部分的に裏付けられる可能性があります 59。

さらに、Peli3 欠損により ROS 生成と肝臓の GSH レベルが低下するという我々の結果は、Pellino3 が未確認の方法で APAP 誘発酸化ストレスに関与している可能性を強く示しています。したがって、Pellino3 がスーパーオキシドジスムターゼ 2 (SOD2) などの抗酸化酵素の発現に関連している可能性があります。したがって、Pellino3 が APAP 肝毒性において SOD2 などの抗酸化酵素の発現を特異的に調節する根本的な機構は、今後の関心のあるテーマとなるはずです。

Pellino3 が異なる結合強度で MAP キナーゼ GSK3β、MLK3、および JNK1 に結合するという我々の発見は、Pellino3 が APAP 肝毒性を制御するシグナル伝達経路において足場活性を持っている可能性があることを示唆しています。この推測は、Pellino3 が足場タンパク質として機能するという以前の発見と一致します 43。さらに、我々の研究は、APAPを経口投与されたマウスの生存率の増加が、Peli3特異的shRNAを発現する組換えアデノウイルスによる内因性Peli3 mRNA発現の減少と相関していることを示し、これはAPAPの肝毒性発症後のPeli3枯渇が肝臓の毒性を減少させることができることを示唆しているダメージ。この発見は、APAP 肝毒性の開始と進行における Pellino3-GSK3β 軸の重要性を強調しています。実際、我々の今回の発見は、Ser9でのGSK3βのリン酸化とGSK3βのミトコンドリア転座をもたらすPellino3媒介GSK3βのユビキチン化が、APAP誘発性肝障害の病理学的プロセスにとって重要であり、Peli3欠損によりミトコンドリアの細胞内転移が減少することを示している。 ROS と損傷、およびリソソーム損傷。結論として、これらの所見は、肝細胞におけるPellino3-GSK3β軸がAPAP誘発性肝損傷にとって重要であることを強く示唆しており、Pellino3によるGSK3βユビキチン化の遮断がAPAP肝毒性の治療にとって重要なレジメンとなり得ることが強調される。

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この研究は、科学情報通信省が資金提供する韓国国立研究財団助成金 (SRC 2017R1A5A1014560) と、韓国国立研究財団からの助成金 (SHP への 2020R1A2C3009643) によって一部支援されました。

キム・ジュンヒョン

現在の住所: KoBio Labs、城南、13488、大韓民国

ジェウォン・リー、ジフン・ハ、ジュンヒョン・キムの著者も同様に貢献しました。

成均館大学生物科学部、水原、16419、大韓民国

イ・ジェウォン、ハ・ジフン、キム・ジュンヒョン、ソ・ドンヨプ、キム・ミンボム、イ・イェリン、パク・ソンシル、パク・ジンソク、ジョン・スミョン、ペ・ヨンス、パク・ソクヒ

高麗大学校生命科学科、ソウル、02841、韓国

チェ・ダヒ＆ク・スンホイ

嘉泉大学医学部生化学教室、仁川、21999、大韓民国

イ・ヨンジェ＆ホン・スンテク

亜州大学医学部薬理学教室、水原、16499、大韓民国

ヤン・シヨン

SRC 非リンパ系臓器免疫研究センター、成均館大学、水原、16419、韓国

ヤン・シヨン、ペ・ヨンス、パク・ソクヒ

Medpacto Inc.、ソウル、06668、大韓民国

ヤン・ギョンミン＆キム・ソンジン

GILO Institute、GILO Foundation、ソウル、06668、大韓民国

キム・ソンジン

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JL、JH、JHK は研究を計画し、実験作業を実行し、データを分析して原稿を執筆しました。 DS、MK、YL、SSP、および JSP は実験作業を実行し、データを分析しました。 DC は組換えアデノウイルスを生成しました。 YJLとSHはノックアウトマウスを作製し、研究デザインに参加した。 SY、KMY、SMJ、SHK、YSB が研究デザインに参加し、データを分析し、研究を調整しました。 SJK と SHP は研究を設計および概念化し、実験作業を監督し、データを分析し、原稿を執筆しました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

キム・ソンジンまたはパク・ソクヒへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Lee、J.、Ha、J.、Kim、JH. 他。 Peli3 アブレーションは、GSK3β リン酸化とミトコンドリア転座の阻害を通じてアセトアミノフェン誘発性肝損傷を改善します。 Exp Mol Med (2023)。 https://doi.org/10.1038/s12276-023-01009-w

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受信日: 2022 年 8 月 15 日

改訂日: 2023 年 2 月 7 日

受理日: 2023 年 3 月 15 日

公開日: 2023 年 6 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s12276-023-01009-w

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