ガラス化による膵島凍結保存は、移植のための高い生存率、機能、回復および臨床的拡張性を実現します

Nature Medicine volume 28、pages 798–808 (2022)この記事を引用

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膵島移植は糖尿病を治療することができますが、十分な量の入手可能な高品質の膵島が必要です。凍結保存は、ドナー膵島の品質管理されたバンキングとプールを可能にすることで、膵島のサプライチェーンの課題を解決できる可能性があります。残念ながら、凍結保存は高い回収率、生存率、機能、拡張性を同時に提供する必要があるため、この目的は達成できませんでした。今回、我々は、凍結保護剤（CPA）組成、CPAのロードおよびアンロード条件、およびガラス化およびガラス化のための方法を包括的に最適化することにより、マウス、ブタ、ヒトおよびヒト幹細胞（SC）由来ベータ細胞（SC-ベータ）膵島においてこの目標を達成した。復温（VR）。 VR 後の膵島生存率は、対照と比較して、マウスで 90.5%、SC-β で 92.1%、ブタで 87.2%、ヒト膵島で 87.4% であり、少なくとも 9 か月の極低温保存の間、変化しませんでした。 VR 島は、正常な肉眼的、顕微鏡的、および超微細構造形態を有していた。ミトコンドリア膜電位とアデノシン三リン酸（ATP）レベルはわずかに低下しましたが、ATPを生成するための酸素消費速度（OCR）を含む細胞呼吸の他のすべての尺度は変化しませんでした。 VR 膵島は、インビトロおよびインビボで正常なグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) 機能を持っていました。ブタおよびSC-β島は異種移植モデルでインスリンを産生し、辺縁質量同系移植モデルで試験されたマウス島は移植後24〜48時間以内にレシピエントの92％で糖尿病を治癒した。優れた血糖コントロールが150日間見られました。最後に、我々のアプローチは 2,500 個の膵島を処理し、解凍後の生存率が 89% 以上で膵島回収率が 95% 以上であり、より高いスループットのために容易にスケールアップできます。これらの結果は、糖尿病を治癒する移植結果の改善に必要な膵島を供給するために凍結保存を使用できることを示唆しています。

インスリンの発見以来 100 年にわたって治療法が開発されてきたにもかかわらず、持続血糖モニター、インスリンポンプ、閉ループシステムなどの現在の糖尿病治療法は、依然として疾患の治癒ではなく、糖尿病の治療法にすぎません 1。ここ数十年で、糖尿病の潜在的な治療法としての膵島移植の開発は大幅に進歩しましたが 2、このアプローチの主な限界の 1 つは、単一のドナーからの移植ではレシピエントのインスリン非依存性を達成するには不十分な場合が多いことです 3,4。多くの場合、「典型的な」体重 70 kg のレシピエントには、合計 700,000 から 1 M 以上の膵島当量 (IEQ) に達する 2 回、3 回、またはそれ以上のドナー膵島注入が必要であり 5,6、繰り返しの外科的介入や複数回の強力な免疫抑制導入に関連するリスクが追加されます。

ドナー供給の問題を克服する戦略の 1 つは、複数のドナーからの膵島をプールし、1 回の注入で高い膵島投与量を達成し 7,8 、有効性を高めてリスクを軽減することです。いくつかのグループが長期間（数週間から数ヶ月）膵島を培養する実現可能性を示しているが9、大部分は時間の経過とともに膵島の回復が減少し、内分泌機能が失われることを報告している10,11。したがって、大規模な臨床試験では、培養を移植前 48 ～ 72 時間に制限することがよくあります 12。しかし、高品質の膵島を分離後数日以上培養または保存できないため、膵島プールは物流的に非現実的になります。 2 番目の戦略は、SC 由来膵島などの代替膵島ソースを開発することです。これは、無制限の膵島供給 13,14 と、限られたドナーの入手可能性への依存度の低下という刺激的な約束を提供します。 SC由来の島はグルコースに反応してインスリンを産生し、一部の動物移植モデルで正常血糖を回復し、ヒトでの第1相および第2相試験で試験されています。しかし、内分泌細胞組成の不均一性と機能のばらつき 13 により、バッチ間のばらつきが大きく 15 なり、各ロットの広範な移植前検証が必要となり、その間に培養中の SC 膵島が劣化します。使用前に膵島を保存できないことが、両方の戦略に共通の課題です。十分な量の膵島の入手を制限するサプライチェーンの障壁を克服し、移植前に適切な品質評価を可能にするためには、長期保存が必要です。

凍結保存、または超低温 (-150 °C 未満) での生体材料の安定化により、生存細胞および組織のプール、長期保存、および既製の入手可能性が実現できます 16,17。従来の凍結保存技術は、細胞外氷の存在下で生物学的物質を脱水凍結状態までゆっくりと冷却する（つまり、<1 °C min-1）ことを利用します。低濃度 (約 2 M) の CPA を添加すると、凍結保存中の細胞の安定化に役立ち、細胞の生存率が向上します。広範な調査(補足表1およびKojayanet al.18でレビューされた研究)にもかかわらず、氷に関連した傷害(すなわち、最適以下の生存率)、臨床拡張性を達成できないこと、および臨床で認められていない成分の使用により、膵島の凍結保存には課題が残っている(生存率を向上させるにはウシ胎児血清）が必要です。

既存の従来の凍結保存方法に代わる有望な方法は、氷を使用しないガラス化です。つまり、生体材料を急速に冷却してガラス状の状態にすることです19,20。氷の形成を回避するには、冷却速度とその後の温暖化速度がそれぞれ臨界冷却速度 (CCR) と臨界温暖化速度 (CWR) を超える必要があります。 CPA 濃度が増加すると (>4 M)、必要な CCR と CWR が達成可能なレベルまで低下する可能性がありますが、特に高温 (>4 °C) では細胞や組織に毒性が生じます。したがって、臨床の拡張性を維持しながら、氷による損傷と CPA 毒性による損傷の両方を回避する重要なバランスポイントが存在します。以前の膵島ガラス化戦略は、十分な冷却速度と加温速度を確保するために、膵島量が少ない小容量（CPA 溶液のマイクロリットル体積で <150 膵島、補足表 1）に限定されており、体積スケールアップにより冷却速度と加温速度が低下し、氷が形成され、生存能力が損なわれます。私たちの知る限り、臨床的に拡張可能なプロトコルで高い生存率、機能、および回復を同時に達成した出版された技術はありません（補足表1）。

この目標を達成するために、私たちはCPA（配合、濃縮、負荷と負荷）およびガラス化方法（冷却および再加温速度の向上）について系統的に検討を行い、高い回収率、生存率、機能性および拡張性を同時に達成する新しい膵島凍結保存方法を開発しました。我々は、マウス、ブタ、ヒト、およびヒトSC由来の島で我々の方法を検証しました。生存率、代謝の健康、インスリン分泌に関する広範な in vitro 評価が実施されました。最後に、同系および異種移植モデルを使用して、VR 後も膵島が生体内で生存し続け、インスリンを産生し、血糖負荷に応答し、糖尿病を治癒することを実証しました。私たちの技術の概要を図 1a にまとめます。

a. 凍結保存は膵島サプライチェーンの基礎となり、移植前のプール、バンキング、および品質管理を可能にします。これを調査するために使用されるモデル系には、マウス、ブタ、ヒトの膵島および SC-β 膵島が含まれます。高い回収率、生存率、機能、拡張性を同時に達成するために、CPA の毒性、氷の形成、VR 凍結保存中の冷却および加温速度などの相互関連パラメーターの体系的な最適化がこれらの島システムで実行されました。達成された冷却速度と温暖化速度により、CPA の毒性と氷の形成の間のバランスを調整できます。 VR 凍結保存後に、膵島の形態、生存率、代謝の健全性、および in vitro および in vivo の機能を評価しました。 hESC、ヒト胚性幹細胞。 b、cryomesh VR の概略図 (縮尺は一定ではありません)。 CPA負荷後、懸濁液中の膵島をクライオメッシュに移し、液体窒素(LN2)に浸す前に過剰なCPA溶液を除去した。 c、クライメッシュ VR の代表的な測定温度プロファイル。挿入図は、達成された冷却速度と温暖化速度です (n = 6、データは個々のデータポイントの平均値 ± SD として表示されます)。 d. CWR と CPA 濃度の相関関係 (補足資料の式 (S2)) は、クライメッシュ VR を使用して致死的な氷を回避するには約 44 wt% の CPA が最小限必要であることを示し、他の研究が適切な CWR を備えた CPA を使用して失敗したことを示しています。熱性能条件下では氷を避けてください。

この研究では、マウス、ブタ、ヒト、SC-β 島の凍結保存と加温後の機能をテストしました。 SC-β 島は、3D 浮遊培養中に非遺伝的プログラミングを使用して 6 段階でヒト胎児 SC 系統 (HUES8) を分化させることによって生成されたクラスターでした 21。補足図1は、分化の各段階におけるSCベータ細胞固有の特性評価の例を示しています。初期開発にはマウス膵島と SC-β 膵島が使用され、その後、ヒトおよびブタの膵島を使用してアプローチが検証されました。

まず、さまざまな VR アプローチをスクリーニングし、冷却、再加熱、拡張性におけるパフォーマンスを評価しました。一般的に使用される 3 つの液滴ベースの VR 戦略を比較しました: (1) 銅皿冷却と対流加熱、(2) 銅皿冷却とレーザーナノ加熱 (レーザー照射時に熱を生成するために液滴に金ナノロッドが追加されました)、および (3) 対流クライオトップ装置を使用した冷却と加温（補足図2;詳細は方法）。簡単に説明すると、2 μl 液滴中の 10 ～ 20 個の膵島をガラス化し、その後再加温しました。直接測定またはモデリングによる推定によって、冷却速度と温暖化速度を評価しました（補足表 2）16。解凍後の生存率は、アプローチ 1、2、および 3 を使用すると、それぞれ 56%、62%、および 55% でした。全体として、これらのアプローチのそれぞれは、実行可能性が最適ではなく、拡張性において潜在的な課題を抱えていました (詳細は補足の結果と考察を参照)。

これらの液滴ベースの制限を克服するために、次に、キイロショウジョウバエの胚を首尾よく凍結保存できるクライオメッシュシステムをテストしました 22。クライオメッシュは、プラスチックのハンドルに取り付けられたナイロンメッシュ (孔径 38 µm) で構成されています。懸濁中にCPAを膵島にロードした後、膵島をクライオメッシュ支持体に移し、余分なCPA溶液をウィッキングによって除去した。これは、システム内の熱質量の大部分を減らし、最小限の CPA に囲まれたクライオメッシュ上に島の薄い層を残すため、重要なステップです (図 1b)。この過剰な流体を除去することにより、対流冷却/加温中の冷却速度と加温速度はそれぞれ5.4 × 104 °C min−1 と30.9 × 104 °C min−1 におよそ一桁増加します（図1c）。 CPA を除去すると、液滴と比較してシステム内の島の密度も増加します。たとえば、2 cm × 2 cm のナイロンメッシュ上に密に詰まった膵島の単層 (つまり、1.7 × 104 個の膵島) は、クライオメッシュ上の体積の >95% ですが、2 μl 液滴中の 20 個の膵島はわずか 1.8% を占めます。総量のうち。補足表 2 は、クライオメッシュ、ドロップレット、およびクライオトップ VR アプローチのパフォーマンスをまとめたもので、冷却速度と昇温速度の向上とクライオメッシュのスケールアップ能力の両方を強調しています。

クライオメッシュシステムの熱性能を確立した後、毒性を最小限に抑えながら氷の形成を回避する CPA 配合とロード/アンロードプロトコルを模索しました。 CPA濃度とCWRの相関関係（式（S2））により、30.9×104℃での再加温中の失透（氷の形成）を回避するには、膵島内部の最小CPA濃度は42〜44重量％である必要があると推定しました。クライオメッシュを使用した min−1 (図 1d)。 CPA の毒性は、化学的損傷と浸透圧損傷の両方によって発生する可能性があります。損傷を避けるために、ロードおよびアンロード中の浸透圧損傷（つまり、60％未満の極端な体積収縮または153％を超える体積膨張）を最小限に抑えるために段階的なCPA添加をテストし、ステップ期間とさまざまなCPA配合物の関数として化学毒性も評価しました。。

最適化されたロードおよびアンロード CPA プロトコルを開発するために、浸透圧不活性体積 (Vb)、膜水透過性 (Lp)、および CPA 透過性 (ω) を含む島の生物物理学的パラメーターを測定するためのマイクロ流体デバイスを最初に作製しました。Ｖｂは、様々な濃度の高張ＮａＣｌ溶液中の島の最終平衡体積を記録することによって測定した（図２ｂ、下パネル）。ボイル・ヴァン・ホフプロットは、マウスおよびSC-ベータ島の浸透圧不活性体積がそれぞれ0.5および0.4であることを示しています（図2c）。膜透過性パラメーター (Lp、ω) は、15 wt% プロピレングリコール (PG)、エチレングリコール (EG) およびジメチルスルホキシド (DMSO) を含む CPA 溶液に 4 ℃で曝露したときの島の特徴的な収縮 - 膨潤挙動を記録することによって決定されました。 Cおよび21°C（補足図3）。「収縮」は、最初の CPA 曝露時の高い水透過性により発生し、島からの水の流出を促進します。この収縮に続いて、透過性CPAが細胞膜を横切って拡散し、水がゆっくりと膵島に再進入するため「膨潤」が起こります（図2b、上のパネル）。 Lp と Ps (=ωRT、R は気体定数、T は絶対温度) に基づく 2 パラメーターモデルを使用して、実験的な収縮-膨潤曲線をフィッティングしました (詳細は「方法」を参照)。図2eに示すように、水（Lp）とCPA透過性（ω）は、マウス島とSCベータ島の両方で、より高い温度でより大きな値を持ちます。マウス膵島と SC-β 膵島の間の細胞組成の違いにより、2 つの膵島タイプ間の透過性値の違いが生じたと考えられます。上記では荷重時の収縮と膨張について説明していますが、他の場所で述べたように、除荷時にはその逆が発生し、膨張の後に収縮が続きます23。

a、膵島の生物物理学的特性を測定するために使用されるマイクロ流体デバイスの概略図（縮尺は一定ではありません）。膵島の形態学的変化を顕微鏡で記録した。 PDMS、ポリジメチルシロキサン。 b、上: 4 °C で 15 wt% DMSO にさらされると、膵島は最初に収縮し、次に膨潤します。高張CPAに曝露されると、水が細胞から出て、膵島が収縮します。その後、CPA は細胞膜を通って拡散し、続いて水が細胞に再侵入し、初期状態に向かって膨潤します。下: 細胞は塩を通さないため、膵島は NaCl 溶液中で収縮したままです。スケールバー、100 μm。 c、マウスおよびSC-ベータ膵島のボイル・ヴァント・ホフプロットは、正規化された膵島体積（V / V0）を等張および高張NaCl溶液の浸透圧比（π0/π）の関数として表示します。浸透圧応答に関与しない浸透圧不活性体積 (Vb) は、直線近似を π0/π = 0 に外挿することで推定できます。詳細については、「方法」を参照してください (SC ベータ島の場合は n = 4、n = 8)マウス島の場合）。 d、マウスおよびSC-ベータ島の正規化体積対時間。21℃で15重量％DMSOに曝露したときの収縮-膨張挙動を示します（マウス島ではn = 3、SC-ベータ島ではn = 9）。 e、4°Cおよび21°CでのマウスおよびSC-ベータ島の水（Lp）およびCPA（ω）透過性の要約表（n = 3〜9;正確なサンプルサイズは補足図3で見つけることができます）。赤色はパネル c、d、g、h のマウス島を表し、パネル e では残りのパネルとの一貫性を維持するために使用されます。 f、膵島に対する 22 wt% EG + 22 wt% DMSO の段階的なローディング (ステップ 1 ～ 3) およびアンロード (ステップ 4 ～ 7)。 g、測定された生物物理学的特性を使用して、CPAのロード/アンロード中のモデル化された島の正規化された体積変化。マウスおよびSC-β島の体積は両方とも安全領域内に留まりました。 h、マウスおよびSC-β島におけるモデル化されたCPA濃度。 c～e については、データは平均値 ± 標準偏差として表示されます。

これらのパラメーター (Vb、Lp、および ω) を使用して、多段階のロードおよびアンロード中の細胞内 CPA 濃度、島体積、および化学毒性がモデル化されました (方法の式 (2) および (3)、補足方法の式 S1)。最適化後、CPAローディングプロトコルは次の10分ステップ間隔を使用しました：1.3Mで21℃、3.2Mで4℃、6.5Mで4℃（図2f;詳細は補足結果と考察）。マウスおよびSC-β島の体積変動は、浸透圧許容範囲内に留まりました（図2g）。モデルは、CPA濃度がマウス膵島内部で6.2 M、SC-β膵島では6 Mであると予測しました（図2h）。

CPA配合を最適化するために、PG、EG、DMSOまたは混合物からなる3つの全体的なCPA濃度(33%、44%、および54%)をテストしました。定性的および定量的な生/死染色を使用して、ロードおよびアンロード後（図2f）、およびVR後に各CPAのSCベータ島の生存率を測定しました。定性的測定は、アクリジンオレンジ（AO）およびヨウ化プロピジウム（PI）で染色した後の無傷の膵島の共焦点イメージングによって決定されました（図3a）。定量的測定のために、VRの有無にかかわらずCPAで処理した島を単一細胞に解離し、AO / PIで染色し、生細胞（AO + / PI -）の割合をカウントしました（図3b）。ロードおよびアンロード後に測定された生存率は、CPA の毒性を反映していました。 VR 後の生存率のさらなる低下は、おそらく冷却および再加温中の氷に関連した損傷を反映していると考えられます。

a、AO (シアン) と PI (赤色) で染色した SC-β 島の生きたコントロールと死んだコントロールの共焦点顕微鏡画像。 b、CPA処理（CPAローディングおよびアンロードのみ）およびVR処理（CPAローディング、VRおよびCPAアンロード）SC-β島の共焦点顕微鏡画像（AO/PIマージ）。さまざまな CPA 配合物を検討しました。 c、CPAのみで処理した(シアン)、VRで処理した(緑)、およびライブコントロール(赤)のSC-ベータ島の細胞生存率。膵島を単一細胞に解離し、生存率を測定しました。 b、c の黄色のテキストは、最適な条件を強調するために使用されます。 Tukey 事後検定による一元配置分散分析 (ANOVA) を使用してグループを比較し、有益なペアごとの比較からの P 値を示します (n = 4)。 d、e、マウス（d）およびSC-ベータ（e）の場合、CPAのみの治療後、およびVR治療後のさまざまな培養時間（0、3、および24時間）後の膵島細胞の生存率。 Tukey 事後検定による一元配置分散分析を使用してグループを比較し、有益なペアごとの比較を示します (n = 4)。スケールバー、100 μm。データは個々のデータポイントと平均±標準偏差として表示されます。

CPAのローディングおよびアンロード後、EGは3つの個々の成分の中で最も低い膵島毒性を示し、DMSOとPGがそれに続きました（図3c）。混合物を同じ総濃度（44%）で使用した場合、EG と DMSO の混合物は最も毒性が低く（細胞生存率は対照の 96.4%）、EG または DMSO 単独よりも優れていました。膵島生存率も VR 後も高いままであり (対照の 93.3%)、VR 後の培養 24 時間にわたって本質的に変化しませんでした (図 3d、e)。混合物の濃度を下げると (34% に)、氷の形成により VR 後の生存率が低下しました。濃度を増加させると (54% まで)、CPA の毒性により生存率が低下しました (図 3c)。最もよく特定された CPA 配合物 (22% EG + 22% DMSO) を研究全体を通じて使用しました。

最適化された CPA 配合、ロードおよびアンロード条件、および冷却/再加温クライオメッシュシステムを使用して、膵島の形態、生存率、DNA 断片化 (TdT 媒介 dUTP ニックエンド標識 (TUNEL) 染色) および VR 後のアネキシン V 転座を調べました。 VRを健康な生コントロール、死滅コントロール（エタノール処理）、および従来の凍結保存（すなわち、15％DMSO中でゆっくり冷却）膵島と比較しました（図4）。 VR後、4つの膵島タイプ（マウス、ヒト、ブタ、およびSC-ベータ）のそれぞれは、全体的な外観と生存率が新鮮な対照膵島と同様であり、従来の凍結保存された膵島よりもはるかに優れていました（図4a）。 VR 島は滑らかな境界、丸い/長方形の形状、新鮮な島と区別できない正常な組織学的外観を持っていましたが、従来の方法で凍結保存された島の多くは巨視的構造の破壊を示しました。違いは、透過型電子顕微鏡（TEM）を使用した超微細構造検査でさらに明らかでした（図4a、下）。 TEM イメージングでは、VR 島では細胞膜、核膜、ミトコンドリア、分泌顆粒、その他の細胞小器官が無傷であるように見えることが示されました。対照的に、従来の方法で凍結保存された島は、細胞の外観に大きな質的変化があり、ミトコンドリアと分泌顆粒の数が減少し、細胞膜と核膜にかなりの小疱が形成されていました。

ａ、ライブコントロール、ＶＲ（ＶＲによって凍結保存）および従来型（従来のゆっくり凍結によって凍結保存）からのマウス島の形態を、明視野顕微鏡、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）組織学、およびＴＥＭによって評価した。従来のグループでは、無傷の島と破壊された島の混合が観察されました。氷の形成により破壊された島の全体的な形態の例が、明視野および H&E 組織学で示されています。 b. 生コントロール、VR、VR 9 ヶ月間 (再加温前に 9 ヶ月間 LN2 に保存された島)、従来型 (従来型の低速で凍結保存された膵島) を含む治療グループからのマウス、SC-ベータ、ブタおよびヒト膵島の生存率 (生コントロールの割合)凍結）および死滅対照（75％エタノールで処理）。 ND、未完了。ゲーム・ハウエル事後検定による一元配置分散分析を使用してグループを比較し、有益なペアワイズ比較からの P 値を示します（グループあたり n = 3〜34。正確な数は補足表 3 にあります）。 c、ライブコントロール、VR、従来型を含む治療グループのマウス、SC-ベータ、ブタ、ヒト島の共焦点顕微鏡画像（AO/PI）。 d、ライブコントロール、VRおよび従来型を含む治療グループからのマウス、SC-ベータおよびヒト膵島のTUNEL染色画像。下のパネルは、同じ治療グループからのマウス膵島のアネキシン V 染色です。スケールバーは、TEM の場合は 2 μm、明視野画像の場合は 50 μm、組織学および TUNEL 画像の場合は 70 μm、すべての蛍光画像の場合は 100 μm を表します。データは個々のデータポイントと平均±標準偏差として表示されます。

次に、AO/PI 染色を使用して、各膵島凍結保存技術に関連する生存率の変化を測定しました。定性的には、VR 膵島は生コントロール膵島と同様に見えましたが、4 つの膵島タイプのそれぞれで赤色 (壊死または死滅) 細胞の数がわずかに増加しただけでした (図 4c および補足図 5)。従来の凍結保存された膵島では、はるかに多くの細胞死が見られました。凍結保存後、別々の膵島セットを単一細胞懸濁液に解離し、細胞ごとに生存率をテストしました（図4b）。対照と比較した VR 後の生存率は、マウスで 90.5%、SC-ベータで 92.1%、ブタで 87.2%、ヒトで 87.4% でした。生存率は、9 か月の凍結保存後も変化しませんでした (マウス島では 88.3%、SC-ベータでは 91.8%)。従来の凍結保存では、VR 膵島よりも生存率が低くなりました (59.1 ～ 62.2%)。

主に全体的な膵島細胞の生存率を調べましたが、特にインスリン発現（ベータ）細胞の生存率を評価するために、無傷または解離した膵島を固定可能な生/死滅色素および抗インスリン抗体で共染色し、共焦点顕微鏡（定性的）によってベータ細胞の生存率を評価しました。測定、補足図6）およびFACS（定量的測定、補足図7）を使用し、インスリン陽性細胞と陰性細胞の両方が同様の生存率を持っていることがわかりました（詳細は補足結果と考察を参照）。

VR島で観察された低度の細胞死（PI +細胞）に加えて、新鮮な対照島と比較してVR後にわずかに多くのTUNEL +細胞および細胞表面アネキシンV +細胞が観察されました（図4dおよび補足図8）。壊死とアポトーシスの両方が、VR による生存率の全体的な 8 ～ 12% の低下に寄与する可能性があります。従来の方法で凍結保存された膵島では、さらに多くの TUNEL+ 細胞とアネキシン V+ 細胞が見られました。従来の凍結保存と比較して、当社の VR 技術は、テストされた膵島タイプの生存率と形態の保存において大幅な改善をもたらしました。

膜透過性色素によって測定される生存率は、治療後の膵島機能不全の遅行指標を表すため、凍結保存後に予想される膵島機能をより適切に定義できる膵島の健康状態の他の尺度を検討しようとしました。具体的には、代謝の健康、特に膵島 OCR は、生体内での膵島機能を予測します 24,25。まず、VR直後に膵島のATPレベルを調べたところ、その時点でATP含有量が対照膵島よりも著しく低いことがわかりました（補足図9）。ただし、ATP レベルおよびその他の代謝測定値 (OCR およびミトコンドリア膜電位) は、3 時間の培養後にほぼ回復しました。以降のすべての評価にはその時点を使用しました。

4 種類の島のそれぞれにおけるミトコンドリア膜電位を、テトラメチルローダミンエチルエステル (TMRE) 染色および定性的および定量的共焦点顕微鏡法によって測定しました。全体的なシグナル強度は、VR 膵島の場合、生コントロールよりも若干低かった（コントロールの 65.7 ～ 86.3%）が、生細胞含有量で調整すると、TMRE 強度はコントロールの 75.1 ～ 93.7% でした（図 5b、左）。 TMRE 強度の違いは、ある程度の中心透明度があった島の中心での回復が遅いためである可能性があります。この外観は、24時間の培養でさらに改善されるようでした（補足図9）。従来の方法で凍結保存された膵島の TMRE 染色強度は、対照膵島の 37 ～ 42% でした (図 5b)。

a、生対照、VRおよび従来型を含む治療群からのマウス、SC-ベータ、ブタおよびヒト島のミトコンドリア膜電位（TMRE染色による）。 b、左：TMRE染色強度の定量化。生きた対照群と治療群の間で示された比較は、クラスカル・ワリス検定およびペアワイズ・ウィルコクソン検定によって実行されました（グループあたり n = 3〜16）。右: 生死対照グループおよび凍結保存グループ (VR および従来型) からの 4 種類の島の ATP レベルの測定。ゲームズ・ハウエル事後検定による一元配置分散分析を使用してグループを比較し、有益なペアワイズ比較からの P 値を示します (n = 3 ～ 12/グループ)。 c、SC-β島におけるミトストレス試験中のOCRの変化を示し、生対照、VR、従来の凍結保存島、および死滅対照島を比較したOCR曲線の例（各時点でグループあたりn = 5〜8）。 d. 各膵島タイプおよび各治療グループの代謝 OCR パラメーターの編集。 Tukey 事後検定による一元配置分散分析を使用してグループを比較し、ペアごとの有意な (P < 0.05) 差が示されました (グループあたり n = 3 ～ 33)。 e、生対照、VR、従来型を含む治療群からのマウス、SC-ベータおよびヒト膵島のインビトロGSISアッセイ。 Tukey 事後検定による一元配置分散分析を使用してグループを比較し、有益なペアワイズ比較を示します (n = 3 ～ 12/グループ)。 b、d、および e では、関連する統計比較 P 値がプロット内に含まれています。スケールバー、100 μm。データは個々のデータポイントと平均±sdとして示されています。b〜eの場合、正確な反復数は補足表3に記載されています。RLU、相対光単位。

VR膵島のTEMによって見られるミトコンドリアの数と外観は、対照膵島細胞と定性的に同様でした（図4a、下）。 TMREの所見と同様に、VR膵島の全体的なATPレベルは、新鮮な対照膵島よりもわずかに低かった（図5b、右）。これらのデータは、ATP を生成する細胞機構は無傷のままであるが、アッセイ時点では ATP レベルがまだ完全に対照値に回復していないことを示唆しています。

無傷のミトコンドリアが示されたので、次に細胞呼吸を調べて、VR 島が ATP を回復するために酸素を消費しているかどうかを評価しました。新鮮な対照島と比較した場合、VR 島は、オリゴマイシン (ATP シンターゼ/複合体 V 阻害剤)、シアン化カルボニル 4-トリフルオロメテオキシフェニルヒドラゾン (FCCP) (ミトコンドリア膜脱共役剤)、およびロテノンの混合物による刺激後に OCR に同様の変化パターンを示しました。 (複合体 I 阻害剤) およびアンチマイシン A (複合体 III 阻害剤) (図 5c)。従来の方法で凍結保存された島は、OCR ストレス応答の低下を示しました。マウス、ヒト、およびSC-ベータ島におけるVRと新鮮なコントロールを比較した場合、基礎呼吸、ATP産生、プロトン漏出、最大呼吸、予備呼吸容量、および非ミトコンドリア呼吸のOCRに差はありませんでした（図5d）。これらのデータは、細胞呼吸によって測定されるように、VR 膵島が正常な代謝機能を維持していることを示唆しています。

膵島が in vitro で機能するかどうかを確認するために GSIS 検査を実施しました。マウス、SC-ベータおよびヒト膵島は、グルコースチャレンジに応答してインスリンを分泌し、マウスおよびSC-ベータではさらにKClを使用した完全な脱分極に応じてインスリンを分泌しました（図5e）。ブタの膵島は検査されていません。ヒト膵島は、高グルコースチャレンジで最大のインスリン放出を示しましたが、KClではそれ以上の放出はありませんでした。測定された各膵島タイプの VR 膵島の刺激指数 (高グルコース濃度への曝露により放出されるインスリンの低グルコースに対する曝露の比) は、対照膵島と異ならなかった。従来の凍結保存された膵島も、程度は低いものの、グルコース負荷に応答してインスリン放出を示しました。これらのデータは、VR 膵島が in vitro で生存可能であり、代謝的に活性であり、機能的であることを裏付けています。

VR 後の膵島機能の最終測定として、同系および異種マウス移植モデルでマウス、ブタおよび SC-β 膵島をテストしました (図 6)。腎臓被膜の下に移植された同系マウス膵島は機能を示し、48時間以内に正常血糖を回復し（図6a）、免疫不全非肥満糖尿病患者におけるブタおよびSC-β異種移植と同様に、移植後60日目に対照膵島と同様の強いインスリン免疫蛍光染色を示した（図6a）。 -Il2rgc-/- (NSG) 受信者 (図 6b)。マウスおよびブタの膵島も強力なグルカゴン染色を示しましたが、コントロールの膵島と比較してシグナル強度が定性的にわずかに低下している可能性があります。予想通り、SC-ベータ移植片はベータ細胞系譜に分化しているため、弱いグルカゴン染色を示しました 21,26。従来、凍結保存された島は、インスリンまたはグルカゴンの染色強度が非常に低かった。

a、生対照、VR、9ヶ月凍結保存したVR（膵島はLN2に9ヶ月保存）を含む治療グループからの辺縁質量マウス島（レシピエントあたり250個の島）の同系移植後のストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスの血糖値）および従来の凍結保存（レシピエント当たり450個の膵島）。 P 値 <0.05 のすべてのペアワイズ比較を示します (*P < 0.05)。これは、Games-Howell 事後検定 [(n = 10 (対照および従来の冷凍保存)、9 (VR)、1 ( VR 部分機能）および 3（9 か月のストレージと VR））。 b、同系（マウス）および異系（ブタおよびSC-ベータ）マウス移植モデルにおけるインスリン（赤）およびグルカゴン（緑）染色。膵島の治療グループには、ライブコントロール、VR、および従来型が含まれます。 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール染色 (青) が統合された画像に示されています。 c、野生型（WT）マウス、糖尿病マウス、および生対照、VRおよび従来の凍結保存島を移植した糖尿病マウスのIPGTT（左）。 IPGTT の曲線下面積 (AUC) (右パネル)。グループは一元配置分散分析およびテューキー事後検定によって比較され、有益なペアごとの比較のみが示されています (グループあたり n = 9 ～ 10)。 d、移植後4、8、および12週間の非絶食時血漿ヒトインスリンレベルを有するNSGマウスへのSC-β島の異種移植。 e、14週目、絶食後および腹腔内グルコース注射によるインスリン産生の刺激から30分後のNSGマウスの血漿インスリンレベル。 dおよびeについては、グループ比較は一元配置分散分析およびTukey事後検定によって行われ、有益な比較が示されています（n = 3〜5/治療グループ）。スケールバー、200 μm。データは個々のデータポイントと平均±標準偏差として示されています。c〜eの場合、正確な反復数は補足表3に記載されています。

次に、異種移植モデルを使用して、生体内でのSC-β島の機能をテストしました。 SC-β島を非糖尿病NSGマウスに移植し、移植後4、8および12週間目にヒトインスリンを測定するためにランダムな血清サンプルを採取しました（図6d）。 VR 島は 12 週間を通じてヒトインスリンを分泌しました。従来凍結保存されたSC-β島には検出可能なヒトインスリン産生があったが、これらのレベルは模擬移植レシピエントと統計的に差がなかった。 14週目に、レシピエントマウスの絶食をテストし、腹腔内グルコース注射によってヒトインスリン産生を刺激しました（図6e）。従来の凍結保存された膵島移植レシピエントは、検出可能なヒトインスリンを有していましたが、刺激後のレベルの増加はありませんでした。 VR 膵島レシピエントは、模擬膵島または従来の凍結保存膵島よりも高い空腹時レベルを示し、刺激後に 2.3 倍の増加を示し、生体内での SC-β 機能が確認されました。

次に、新鮮なコントロール、VR、および従来の凍結保存マウス島を、ストレプトゾトシン誘発糖尿病レシピエントを使用する辺縁塊（レシピエントあたり250島）の同系膵島移植モデルでテストしました。全体として、VR 島は 24 ～ 48 時間以内にレシピエントの 92% (11/12) で正常血糖を急速に回復しました (図 6a)。二変量カプランマイヤー評価では、正常血糖までの時間は、生体コントロール膵島移植レシピエントと差がありませんでした（ログランク検定、P = 0.063）。 1 人の VR 膵島レシピエントは、おそらく技術的な問題 (つまり、腎被膜からの膵島漏出) が原因で、部分的な機能のみを示しました。このレシピエントの血糖は、移植後 13 日目に 200 mg dl-1 未満に低下し、その後中等度の高血糖が継続しました。

対照的に、従来の方法で凍結保存した膵島は、膵島数を増やしても（レシピエントあたり450個の膵島）、すべてのレシピエントの血糖（BG）を正常化できなかった。移植片のサブセットは、膵島移植腎臓の片側腎摘出術を受けました（補足図10）。すべてのマウスで高血糖が急速に進行し、生来のレシピエント島ではなく、移植された島がBGレベルを制御していることが確認された。

同系移植では、VR 膵島の血糖コントロールは非常に厳しかった。ランダム BG レベルは、移植後の経過全体 (移植後 150 日まで) を通じて対照膵島移植のレベルよりも高くありませんでした。凍結保存時間を延長した結果をテストするために、膵島をガラス化して LN2 に 9 か月間保存し、その後再加温しました。これらの長期保存された膵島移植は、追跡期間を通じて急速な血糖値の正常化とグルコースの安定性も示しました。

血糖コントロールのレベルを実証するために、移植後 50 日目に腹腔内耐糖能検査 (IPGTT) を実施しました (図 6c)。未処理の野生型マウス、新鮮な対照膵島移植、および VR 移植では、グルコース応答曲線 (図 6c、左) または曲線下面積 (図 6c、右) に差異はありませんでした。従来の方法で凍結保存された膵島のレシピエントは、糖尿病対照マウスと同様の血糖反応を示しました。

標準規模の VR プロセス (テストあたり 400 ～ 2,000 個の膵島) の膵島回収率は、マウス (n = 26) で 96.8 ± 1.3%、SC-ベータ (n = 26) で 96.6 ± 1.7%、ブタで 91.3 ± 3.4% ( n = 3）、ヒト（n = 6）島では96.7 ± 1.5％（補足図11）。中程度のスループット (テストあたり 2,500 島) にスケールアップした場合、マウス島の回収率は 95.9 ± 1.2% (生存率 89.4%、n = 3)、SC-β 島の回収率は 98.2 ± 1.1% (n = 4) でした。）。最後に、より高スループットのSC-ベータ膵島VRの最初の概念実証テスト(テストあたり10,000膵島)では、回収率は92.6%でした(n = 1)。

VR のクライオメッシュシステムは本質的に一次元であるため、x および y 次元のスケーリングは理論的にはコンテナーのジオメトリによってのみ制限されます。これらの実験では、膵島を 2 cm × 2 cm メッシュ上で 1 cm2 あたり最大 4,250 個の膵島でガラス化しました。したがって、臨床的に意味のあるスループットを達成するために、100,000 個の膵島単位を 24 cm2 のクライオメッシュ上に保存することができます。

十分な数の高品質で生存可能で機能的な膵島を糖尿病患者に移植すると、このますます一般的となり、徐々に衰弱していく病気を治癒できる可能性があります。膵島移植の成功に影響を与える主な制限は、十分な数の高品質の天然またはSC由来の膵島をオンデマンドで供給できないことであり、これらの細胞生成物を使用前に保存できないことで制限はさらに悪化します。今回、我々は、高い生存率、回復性、機能性、拡張性を同時に達成する長期膵島保存の効果的な方法を初めて示します。このような凍結保存による膵島バンク化の方法は、移植前の膵島の単離、割り当て、保管のサプライチェーンに革命をもたらし、死亡したドナー膵臓の全体的な利用率を高め、より多くの糖尿病患者を治癒できる可能性がある。

以前の研究では、島の凍結保存のための従来の方法（緩徐冷却）とガラス化（急速冷却）の両方が検討され、さまざまな程度の成功を達成しました（補足表1）。例えば、Rajotte ら 27,28 および他のグループ 29,30 は、標準的な CPA (2 M DMSO) を使用した従来の膵島の凍結保存を実証しましたが、低から中程度の生存率と機能しか達成せず、限られたスループット (10 ～ 100 個の膵島) でしか達成できませんでした。プロトコールの改善（つまり、異なる CPA）により、機能の向上 31,32 またはスループットの向上（膵島 10,000 個以上）33,34 が得られましたが、両方が同時に得られるわけではありません。従来の凍結保存は限られた臨床試験でテストされましたが 35、人獣共通感染症のリスクを伴うウシ胎児血清の使用が部分的に原因で完全に採用されることはありませんでした。一方、いくつかのグループは、生存率と機能を改善するための好ましい代替策としてガラス化（すなわち、氷を使用しない凍結保存）をテストしました23,36,37,38,39。初期の研究では原理の証明が示されましたが、膵島スループットが低く（50～300 膵島）、機能が部分的でした 23,40。他のグループは、液滴41、中空糸39、またはメッシュサポート37、38を使用してシステムの形状を変更することにより、冷却速度と加熱速度を向上させ、機能のわずかな改善を達成しましたが、スループットの低下を犠牲にしました（一度にわずか25〜100個の膵島が多くなることがよくありました））。

VR アプローチは、新たに単離されたマウス、ブタ、およびヒト膵島の凍結保存における有効性に加えて、SC 由来のヒト膵島にも有効でした。 SC-β 島は、β 細胞置換のためのヒト細胞の有望な供給源となり、インビトロでのグルコース応答性インスリン分泌と糖尿病マウスモデルにおける長期血糖制御を実証しています 21,42。強力な生理学的機能を達成するために、SC 由来ベータ細胞技術を改良する広範な努力が進行中です。効率的で低コストの差別化方法を作成する。内分泌細胞の補体を改善します（つまり、アルファ細胞とベータ細胞の混合物で生成します）43,44。それにもかかわらず、将来の臨床採用に備えて既製の入手可能性を実現するには、凍結保存によって可能になるような高品質のSC-β島の確実な供給が依然として必要である。当社の凍結保存法は潜在的な解決策を提供し、LN2 で 9 ヶ月保存した後でも SC-β 島の高い生存率 (92.1%) と in vitro および in vivo 機能を実証します。長期保存により、将来のレシピエントの免疫操作が可能になり、移植前の包括的な膵島の品質管理が可能になり、機能的な単一患者ユニットで大量のバッチを凍結保存できるためコスト効率が向上します。これらの結果は、我々の新しい凍結保存プロトコルがSC-β島サプライチェーンを改善し、それによって糖尿病患者の治療選択肢を増やす強力な手段となる可能性があることを示唆しています。

SC-ベータ島と死亡したドナー島の両方にとって、凍結保存法の拡張性は不可欠です。臨床的に意味のあるスループット（つまり、膵島数100,000以上）に向けたアプローチのさらなるスケールアップは、より大きなクライオメッシュサイズとメッシュスタッキングなどの代替フォームファクターを使用して達成できます（補足図12）。より大きなクライオメッシュサイズの場合、メッシュが急速かつ均一に押し込まれると、冷却/再加温バスのサイズが適切である条件下では、冷却および再加温の流束と熱質量 (単位面積あたり) はメッシュのサイズと形状に依存しません。、クライオメッシュよりも大きい）および再加温バスが撹拌されます。さらに、膵島とクライオメッシュの間に残った CPA 溶液（表面張力により同伴）は、ランゲルハンス島をクライオメッシュに一時的に「接着」し、LN2 での保存中に膵島がクライオメッシュから剥がれることはありません。

我々の発見は、将来の臨床膵島凍結保存の基礎となり、マウス、ブタ、ヒトおよびSC-β膵島の凍結保存中に高い生存率、機能性（インビトロおよびインビボ）、拡張性を同時に達成できることを示唆しています。ヒト膵島の CPA 最適化など、我々のアプローチの限界に対処するにはさらなる努力が必要です。膵島のストレス、適応、損傷反応のさらなる特徴付け。バッチあたり 300,000 膵島を超えるスループットにスケールアップします (単一ドナー単離の一般的な収量は 300,000 IEQ 未満です5)。臨床グレードの処理への適応（詳細は補足結果と考察を参照）。これらの制限はそれぞれ、将来の開発で容易に克服されると私たちは信じています。

移植前に膵島を凍結保存する方法が成功すれば、その意義は非常に大きい。このような技術には以下の利点があります。(1) 高用量プールドナー膵島移植による有効性の向上。 (2) 品質管理と評価のより良い機会。 (3) 計画外の手術を計画されたイベントに変換することで、患者の準備を改善します。 (4) 反復注入ではなく単回膵島注入を使用することによりリスクが減少する。（５）次のドナーを使用するのではなく、利用可能なオプションのバンクから選択することにより、ドナーとレシピエントのＨＬＡマッチングの機会が改善される。（6）アポトーシスを起こしたドナー白血球の注入 45 または島とドナー由来の造血幹細胞移植との混合キメラ化によって達成される寛容など、移植前にレシピエントのプレコンディショニングを必要とする寛容誘導プロトコルの促進。（7）単一ドナー移植を期待して収量を最大化するために歴史的に選択されてきた「最適な」ドナーのみではなく、すべての適切なドナーからの膵島の単離とバンク化を促進することによって臓器利用を改善する。

ミネソタ大学 (プロトコル 1905-37028A) およびメイヨークリニック (プロトコル A00003973) の施設内の動物管理および使用委員会が、この動物研究を承認しました。マウスは、特定の病原体を含まない施設（NSG マウスの場合）または従来の施設（C57BL/6 マウスの場合）で、14 時間点灯/10 時間消灯の光サイクル、周囲温度 68 ～ 74 °F、湿度 30 ～ 70% で飼育されました。。

マウス膵島は、コラゲナーゼ (CIzyme RI、VitaCyte) 消化および Histopaque (Millipore Sigma) 密度勾配濃縮により、C57BL/6 メスの引退ブリーダー (年齢不詳、Charles River Laboratories) から単離されました 46。次いで、膵島を手作業で採取し、使用前にバイオリアクター(ABLE Biottリアクター、BWV-S03A)内でS3培地中で16時間培養した。ヒト膵島は販売業者 (Prodo Laboratories) から購入し、使用前に PIM(S) Complete 培地 (Prodo Laboratories) で最長 7 日間培養しました。ブタの島はランドレース種の成豚から単離されました 47。

HUES8 細胞は、500 ml スピナーフラスコ (Corning、3153) でスフェロイドとして培養されました 21。懸濁培養は、10 µM Y27632 (R&D Systems, 1254) を含む mTeSR1 培地 (STEMCELL Technologies, 85850) に 1 億 5,000 万細胞 (5 × 105 細胞 ml-1) を播種することによって確立され、37 °C の加湿インキュベーター内で 70 rpm で維持されました。 , CO2 5%、湿度 100%。培地を48時間でY27632を含まないmTeSR1に交換した。細胞は、Accutase (Millipore Sigma、A6964) を使用して機械的に破壊しながら単一細胞に分散させることによって 72 時間ごとに継代し、Y27632 を含む新鮮な mTeSR1 に再懸濁しました。

SC ベータの分化は、スピナーフラスコ内の mTeSR1 培地での SC スフェロイドの形成と拡大の 3 日後に開始されました 21,26。クラスターを重力によって沈降させ、培地を適切な増殖因子を含むプロトコル固有の培地と交換した。細胞分化は、胚体内胚葉、原始腸管、膵臓前駆細胞 1、膵臓前駆細胞 2、内分泌前駆細胞へと順に誘導され、最後に SC-β26 に誘導されました。基本培地タイプ (S1、S2、S3、および BE5) には誘導シグナルが補足されました (詳細は補足方法を参照)。 SC ベータ島はフローサイトメトリーによって特徴付けられました (詳細は補足方法を参照)。

島の生物物理学的パラメーターの測定に使用されるマイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィー手順を使用して製造されました (詳細は補足方法を参照)。厳選された膵島を、出口穴を通して逆行的に装置に導入した。膵島培地を使用して順行性流動を開始した後、所望の濃度のCPA/塩溶液をシリンジポンプを介してロードした。 CPAの場合、RPMIで調製した15重量%のEG、PGおよびDMSOを使用しました。塩溶液には、脱イオン水で調製した 1.8%、2.7%、3.6%、および 4.5% の塩化ナトリウムを使用しました。膵島がチャネル床に落ち着くと、膵島の移動と回転を最小限に抑えながら、CPA/塩溶液の流量を徐々に増加させました。少なくとも装置の５倍量の溶液が装置を通してポンプで送られた後、溶液の流れを停止した。 4 °C で行われた実験の場合、実験全体は同じ温度に維持された冷蔵室内で行われました。膵島の断面積の変化を記録し、MATLAB を使用して分析して、膵島の球体積の変化を推定しました。

Lp (透水性とも呼ばれる透水性) と ω (CPA 透過性) を使用した 2 パラメーターモデルを適用して、実験的な収縮と膨潤のデータを当てはめました 48。仮定については補足資料で詳しく説明されています。浸透圧不活性細胞体積 Vb は、ボイル・ヴァン・ホフの関係式から決定されました 49。ボイル・ヴァン・ホフ方程式は、以下のように細胞の平衡容積と非浸透溶液の重量オスモル濃度を相関させます。

ここで、V は細胞平衡体積、V0 は等張細胞体積、Vb は細胞の浸透圧不活性体積分率、π0 は等張浸透圧、π は非透過溶液の浸透圧です。

MATLAB を使用して、実験的な収縮 - 膨張曲線からマウスと SC ベータ島の Lp と ω をフィッティングしました。膵島容積変化と細胞内 CPA のモデリングは、次のように、Kleinhans 48 によって提案された 2 つのパラメーターの「非共役」モデルに基づいています。

ここで、V と A はそれぞれ島の体積と表面積です。 nC は膵島内の CPA のモル数です。 R は気体定数です。 T は絶対温度です。 Lp と ω はそれぞれ透水係数と CPA に対する膜透過性です。 C はモル濃度です。上付き文字 i と e はそれぞれ細胞内と細胞外を示します。下付き文字 C と S は、それぞれ透過 CPA と非透過溶質を示します。

膵島は、Rajotte らによって以前に確立されたプロトコールに基づいてわずかに修正された低速凍結アプローチによって凍結保存されました50。 CPA 溶液にはウシ胎児血清やウシ胎児血清は含まれていません。 21℃でDMSOを膵島懸濁液に添加して、凍結バイアル中で最終濃度2Mを達成した。 DMSO と 25 分間インキュベートした後、クライオバイアルを -7.5 °C のエタノール浴に 5 分間入れました。金属棒を LN2 で冷却し、クライオバイアル内の懸濁液に触れることによって氷を播種するために使用しました。 15 分間の融解潜熱放出後、制御速度冷凍庫 (Kryo 560、Planer Limited) を使用してクライオバイアルを 0.25 °C min-1 で -40 °C まで冷却し、その後 LN2 に突っ込みました。解凍は 37 °C のウォーターバスを使用して行われました。解凍した膵島を 0.75 M スクロース中に 0 °C で 30 分間置き、細胞内 CPA を除去しました。

使用した完全強度ＣＰＡは、ＲＰＭＩ培地中で調製した２２重量％のＥＧ＋２２重量％のＤＭＳＯであった。 CPAをロードするために、膵島を最初に20％CPA（すなわち、4.4重量％EG + 4.4重量％DMSO）中で21℃で10分間インキュベートし、続いて50％CPAで4℃で10分間、および100％CPA中でインキュベートした。 4℃で10分間のCPA。次いで、膵島懸濁液を、吸湿性材料（すなわち、ペーパータオル）上に置かれたクライオメッシュに移した。 CPA溶液はナイロンメッシュを通して吸い上げられ、膵島はクライオメッシュ上に残りました。島の凝集は避けられた。クライオメッシュをすぐに LN2 に浸し、LN2 タンクに保管しました。膵島を解凍するために、CPA を除去するために、4 °C で 11 wt% EG、11 wt% DMSO、および 5 wt% スクロースからなる再加温溶液にクライオメッシュを急速に浸しました。 10分後、再加温溶液を氷冷した10重量%スクロース溶液を使用して2倍に希釈し、膵島を4℃でさらに10分間インキュベートした。次いで、膵島を２１℃に移し、懸濁液を１０重量％スクロース溶液を使用して２倍に希釈した。５分後、最後のＣＰＡ除去ステップとして、膵島をＲＰＭＩ培地に１５分間戻した。この時点で、全ての膵島がナイロンメッシュから剥離した。

クライオメッシュ VR アプローチと同じ CPA ローディング手順を使用して、10 ～ 20 個の膵島を 2 μl 液滴に含めてクライオトップ上に置きました。クライオトップをすぐに LN2 に突っ込んでガラス化しました。再加温および CPA 除去プロセスは、cryomesh VR で実行されたプロセスと同じでした。

10 ～ 20 個の膵島を含む 2 μl の液滴を、ガラス化のために LN2 に浮かべた銅製の皿に滴下しました。ガラス化液滴は、アンロード溶液中で対流により再温められた。 CPA 除去手順は、cryomesh VR アプローチと同じに保たれました。

金ナノロッド (nanoComposix) を液滴に添加して、2.8 × 1010 部 ml-1 の濃度に達しました。膵島と金ナノロッドが埋め込まれた液滴 (2 μl) を事前に冷却した銅皿上でガラス化した後、1064 nm パルスレーザーを使用して液滴を再加熱しました 17。パルス長は 7.5 ms、レーザー電圧は 250 V でした。高速カメラ (Nac Image Technology、Q1v) を使用して、レーザーの昇温プロセスを 4,000 フレーム/秒で記録しました。

膵島の超微細構造をTEMで分析した。簡単に説明すると、膵島を 0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.4) 中の 2.5% グルタルアルデヒド中で 4 °C で一晩固定し、2% 四酸化オスミウム水溶液で 1 時間後固定し、段階的なエタノール (30% から 100%) とプロピレンオキシドで脱水しました。、Epon812 に埋め込み、60 °C で 48 時間硬化させます。次に、65 nm の超薄切片を 200 メッシュの銅グリッド上に収集し、酢酸ウラニル (15 分) とクエン酸鉛 (2 分) で染色してから、TEM で検査しました。画像は、FEI Tecnai G2 Spirit 透過型電子顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific) で取得しました。

無傷の島の生存率の定性的測定は、AO および PI を使用して実行されました。無傷の膵島を、8 ng ml-1 AO および 20 ng ml-1 PI (Millipore Sigma) で室温で 2 分間染色し、カバースリップをかけ、502/525 nm フィルターを備えた Olympus Fluoview 3000 倒立共焦点顕微鏡 (Olympus) を使用して画像化しました。 AO 用および PI 用の 493/636 nm フィルター。画像は、20 倍の対物レンズを使用して 4,020 × 4,020 ピクセルの解像度で撮影されました。ここおよび研究全体を通じて、すべての共焦点画像における島の直径は、有効イメージング深度を増加させるために使用されるカバースリップ圧縮により増加していることに注意してください。

定量的な生存率は、解離した膵島細胞で測定されました。膵島処理後、膵島を動的培養フラスコ内、70 rpm、37 °C、5% CO2 で S3 培地中で 3 時間インキュベートしました。膵島を TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific、12605010) で単細胞懸濁液に解離し、ウシ胎児血清を含む S3 でクエンチし、8 ng ml-1 AO と 20 ng ml-1 PI で染色しました。 15 秒のインキュベーション後、懸濁液 10 μl を Countess Cell Counting Chamber Slides (Thermo Fischer Scientific、C10228) にピペットで移し、Countess II FL セルカウンター (Thermo Fisher Scientific の Invitrogen、AMQAF1000) を使用して生存率を定量しました。解離定量的生存率測定技術の精度は、AO/PI 染色された無傷膵島の共焦点画像の 3D 再構成の画像解析によって得られた値と比較することによって検証されました。

アッセイを実行する前に、受け取った膵島クラスターを動的培養フラスコ内で 70 rpm、37 °C、5% CO2 でインキュベートしました。膵島を、25 μlの50 ng ml-1 再構成TMRE、過塩素酸塩（Biotium、70005）で室温で1分45秒間、顕微鏡スライド上で染色し、カバーガラスをかぶせて（Chase Scientific、ZA0294）、Olympus Fluoview 3000共焦点を使用して画像化しました。倒立顕微鏡 (励起/発光フィルター: 594/574 nm)。画像は、20 倍の対物レンズを使用して 4,020 × 4,020 の解像度で撮影されました。膵島の膜電位は、Olympus CellSens Dimension ソフトウェア (v1.17) を使用して蛍光強度を測定することによって定量化されました。

各アッセイの前に、膵島を動的培養フラスコ内で 70 rpm、37 °C、5% CO2 でインキュベートしました。標準サイズの膵島（約 150 µm）を手作業で採取し、ウェルあたり 3 つの IEQ を黒色 96 ウェルプレート（Greiner Bio-One、89131-680）の各ウェルに 37 °C の 50 µl RPMI に入れて配置しました。次に、50 μl の予熱した Promega CellTiter-Glo 3D 細胞生存率試薬を各ウェルに添加しました。 ATP標準(Roche)を陽性対照として使用し、結果を校正した。プレートを密封し、アルミホイルで覆い、オービタルシェーカー上に室温、８０ｒｐｍで５分間置いた。次いで、プレートを振盪せずに室温で２５分間インキュベートした。 BioTek Synergy 2 マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して発光を捕捉し、BioTek Gen5 ソフトウェアを使用して分析し、IEQ ごとの相対光単位として報告しました。

アッセイを行う前に、膵島を動的培養フラスコ内で 70 rpm、37 °C、5% CO2 で 3 時間インキュベートしました。細胞呼吸は、Agilent Seahorse XF Mito ストレステストおよび Agilent SeaHorse xFe24 Islet Capture FluxPak (Agilent、103418-100) プレートとグリッドを使用して測定しました。各サンプルウェルの内円の50%をカバーするのに十分な数の膵島を、500μlの培地を含むウェルに手で採取した。膵島捕捉スクリーンを慎重かつしっかりとプレートに取り付けた。膵島を、1 mM ピルビン酸、2 mM グルタミン、および 5.6 mM グルコースを添加した SeaHorse 培地 (SeaHorse XF DMEM) (Agilent、103575-100) で 2 回洗浄し、37 °C で 1 時間平衡化しました。アッセイ試薬は、事前に水和されたセンサーカートリッジにロードされました。アッセイプレートを校正済みの Agilent SeaHorse xFe24 アナライザーに挿入し、メーカーのプロトコールに従って次の最適化された試薬濃度を使用してミトストレステストを実行しました: マウス膵島 (5 μM オリゴマイシン、1 μM FCCP、および各 10 μM ロテノンおよびアンチマイシン A) )、SC-β 島 (10 μM オリゴマイシン A、2 μM FCCP、および各 10 μM ロテノンおよびアンチマイシン A)、ヒト島 (50 μM オリゴマイシン A、10 μM FCCP、および各 10 μM ロテノンおよびアンチマイシン A)、およびブタ島 (50 μM オリゴマイシン A、2.5 μM FCCP、および各 10 μM ロテノンおよびアンチマイシン A)。 OCR 値は 200 分にわたって取得されました。サンプリング速度がプレート間で異なる場合、時間経過は標準観察期間にわたってスケールされました。

ウェル間の正規化のために、各ウェルの島を1 M 水酸化アンモニウム + 0.2% Triton X-100中で溶解させた。 DNA含有量は、BioTek Synergy 2マルチモードマイクロプレートリーダー(BioTek)での定量化のための標準化されたキャリブレーションコントロールを使用するPicoGreenアッセイ(Molecular Probes)によって測定されました。基礎呼吸、ATP 産生、プロトン漏出、最大呼吸、予備呼吸容量、非ミトコンドリア呼吸の OCR を含む個々の細胞呼吸パラメーターを計算し、個々のウェルで得られた DNA 含有量に対して正規化しました。

受け取った膵島クラスターは、アッセイを実行する前に、動的培養フラスコ内で 70 rpm、37 °C、5% CO2 でインキュベートされました。製造業者のプロトコールに従って、ApopTagペルオキシダーゼin situアポトーシス検出キット(Millipore Sigma、S7100)を使用してアポトーシス細胞を染色した。染色および洗浄後、キシレンで脱水してスライドをマウントし、封入剤を使用してカバースリップを貼り付けました。各膵島のアポトーシス細胞の数を光学顕微鏡下で計測した。

受け取った膵島クラスターは、アッセイを実行する前に、動的培養フラスコ内で 70 rpm、37 °C、5% CO2 でインキュベートされました。次いで、５×アネキシンＶ結合緩衝液（Ｂｉｏｔｉｕｍ、９９９０２）を脱イオン水で希釈して、１×結合緩衝液を得た。膵島を1×結合緩衝液を使用して2回洗浄した。染色溶液は、アネキシン V コンジュゲートを 1 × 結合緩衝液で最終濃度 2.5 μg ml-1 に希釈することによって調製し、遮光して室温で 15 ～ 30 分間膵島とともにインキュベートしました。次いで、膵島を1×結合緩衝液で3回洗浄し、20×対物レンズ下で490/515nmの励起/発光を有するOlympus Fluoview 3000共焦点倒立顕微鏡を使用して30分以内に画像化した。ホスファチジルセリンに対して高い親和性を持つ Ca2+ リン脂質結合タンパク質を、Olympus CellSens Dimension ソフトウェア (v1.17) を使用してフォールスカラーマッピング蛍光をゲートすることによって定量し、統計的に分析しました。

膵島の in vitro 機能を評価するために GSIS アッセイが実施されました 26。簡単に説明すると、膵島を低グルコース (3.3 mM グルコース) クレブスリンガー緩衝液 (KRB) (128 mM NaCl、5 mM KCl、2.7 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1 mM Na2HPO4、1.2 mM KH2PO4、5 mM NaHCO3、 10 mM HEPES および 0.1% FAF-BSA の脱イオン水溶液)。次いで、膵島を24ウェルトランスウェルインサート(Millicell、細胞培養インサート、PIXP01250)にロードし、低グルコースKRB中で37℃で1時間絶食させた。膵島を低グルコース KRB で 1 回洗浄し、次に低グルコース KRB で 37 °C で 1 時間インキュベートしました。低グルコース、高グルコースおよびKClを含むKRBの量は、ウェル当たり1mlであった。インキュベーション後、上清を収集し、分析まで -20 °C で保存しました。次に、膵島を高グルコース KRB (16.7 mM) に 37 °C で 1 時間移し、上清を収集して保存しました。次いで、膵島を、脱分極状態を観察するために30 mM KClを含む低グルコースKRBに移し、この緩衝液中で1時間インキュベートし、上清を収集した。最後に、TrypLE とのインキュベーションによって膵島を分散させ、Countess 自動細胞計数器 (Thermo Fisher Scientific) を使用して計数しました。収集した上清を酵素免疫吸着法によりヒトインスリン濃度について分析し（ALPCO、80-INSHUU-E01.1）、細胞数について正規化した。マウス膵島インスリンは、HTRF (均一時間分解蛍光) アッセイ (Cisbio PerkinElmer、62IN1PEG) によって測定されました。

C57BL/6 マウス (6 ～ 8 週齢雄、Charles River Laboratories) を単回用量 (220 mg kg-1) ストレプトゾトシン (Millipore Sigma、S0130) 腹腔内注射により糖尿病にしました。血糖値は 4 ～ 7 日後に測定され、毎日 2 回連続して >400 mg dl-1 を測定することで糖尿病が確認されました。レシピエントあたり 250 個の膵島の辺縁塊膵島移植 51 を、レシピエントマウスの左腎被膜の下で実施しました。すべての治療グループについて、あらゆるサイズの島、形態学的に破壊された島と無傷の島の両方を含む島を移植のためにランダムに選択した。血糖値測定は毎日行った。移植の成功は、BG < 200 mg dl-1 の 2 回連続した毎日の測定の 1 日目に測定されました。移植片不全は、250 mg dl-1 を超える 2 回の連続測定の初日として定義されました。

移植後 50 日目に、マウスを 16 時間 (一晩) 絶食させ、その後 2.5 g kg-1 グルコースを腹腔内注射し、15 分ごとに 150 分間 BG を測定することによって、IPGTT を実施しました。

移植された膵島がBGレベルを制御しており、生来のβ細胞機能の回復ではないことを確認するために、移植後60日目に移植片のサブセットに対して左腎摘出術(膵島移植を含む)を実施し、高血糖の回復を確認した。 60日目の外植片を固定し、インスリンおよびグルカゴンについて染色した。

SC-β およびブタ島を、非糖尿病の 6 ～ 12 週齢の雄 (NSG) マウス (Jackson Laboratory) の腎臓被膜下に移植しました 21。簡単に説明すると、合計 5 × 106 個の細胞を含む島クラスターを雄 NSG マウスの腎臓被膜の下に注射しました。対照マウスには、腎臓被膜に生理食塩水を注入する模擬手術を受けた。ヒトのインスリンレベルを測定するために、移植後の顔面出血を4週目、8週目、および12週目に実施した。移植後 14 週間で、修正 IPGTT が実行されました。マウスを16時間絶食させ、2.5 g kg-1 グルコースボーラスの腹腔内注射の前後30分に血液を採取した。マイクロベット (Sarstedt、20.1292.100) を使用して血液から血清を分離し、ヒト超高感度インスリン酵素免疫吸着法 (ALPCO、80-INSHUU-E01.1) を使用してヒトインスリンを定量しました。 IPGTT後、移植片を含む腎臓を外植し、インスリンとグルカゴンについて染色した。

ブタ膵島異種移植では、350 個の膵島を NSG マウス (雄または雌、6 ～ 12 週齢) の腎臓被膜の下に移植しました。移植後 60 日目に、移植片を含む腎臓を取り出し、固定し、インスリンとグルカゴンについて染色しました。

腎臓被膜の下に膵島が移植された回復した腎臓を、70% アルコール性ホルマリン (BBC Biochemical、0460) で固定し、パラフィンブロックに包埋しました。次に、ミクロトームを使用して 5 μm の切片を切り出しました。キシレンを使用し、EtOH 濃度を 100%、90%、80%、および 70% に下げて切片のパラフィンを除去しました。スライドをブロッキング緩衝液（Ca2+ および Mg2+ を含む DPBS 中の 5% ウシ血清アルブミン（Millipore Sigma、B6917）（Thermo Fisher Scientific、14040141））とともに 20 分間インキュベートし、次に以下のように種特異的試薬で染色しました。ベータ細胞特異的生存率実験では、固定、透過処理、および抗インスリン抗体による染色の前に、無傷のマウス膵島を固定可能な生死色素 (Biotium、Live-or-Dye NucFix) で染色しました (以下を参照)。

腎臓切片を、FLEX ポリクローナルモルモット抗インスリン抗体 (Agilent、IR002) とともに室温で 1 時間インキュベートしました。ブロッキング緩衝液を使用して切片を穏やかに５回洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液（１：５７０）中で組換えウサギ抗グルカゴン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９２５１７）とともに１時間インキュベートした。次いで、切片をブロッキング緩衝液で５回穏やかに洗浄し、ヤギ抗モルモット免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８）（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５０１８５；１：２５０）およびヤギ抗ウサギとともにインキュベートした。 IgG H&L (Alexa Fluor 647) (Abcam、ab150079) のブロッキングバッファー (1:250) 中で室温で 1 時間。 Ca2+ および Mg2+ を含む 4 °C DPBS で切片を穏やかに洗浄した後、切片を 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (Millipore Sigma、F6057) で標識し、カバースリップをかけて (Chase Scientific、ZA0294)、4 °C に置きました。撮影前に 2 時間。

腎臓切片を、ブロッキングバッファー（1:50希釈）中のマウスモノクローナル抗インスリン抗体（K36aC10）（Abcam、ab6995）およびブロッキングバッファー（1:570希釈）中の組換えウサギ抗グルカゴン抗体（Abcam、ab92517）とともに室温でインキュベートしました。）室温で1時間。次いで、切片をブロッキング緩衝液で５回穏やかにリンスし、ブロッキング緩衝液中のヤギ抗マウスＩｇＧＨ＆Ｌ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７）（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５０１１５）（１：２５０）およびヤギ抗ウサギＩｇＧＨ＆Ｌ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８）とともにインキュベートした。 (Abcam、ab150077) をブロッキングバッファー (1:300) に溶解し、室温で 1 時間処理します。 Ca2+ および Mg2+ を含む 4 °C DPBS で切片を穏やかに洗浄した後、切片を 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (Millipore Sigma、F6057) で標識し、カバースリップをかけて (Chase Scientific、ZA0294)、4 °C に保持しました。 Olympus Fluoview 3000倒立共焦点顕微鏡でイメージングする前に2時間。

統計分析は R バージョン 4.0.3 (R Foundation for Statistical Computing) で実行されました。補足表 3 には、独立した実験の正確な数 (n) と関連する各数値の技術的反復を含めました。正規性は、連続変数のシャピロ・ウィルク検定で、または qq プロットと分布ヒストグラムを使用してグラフ的にテストされました。分散の均一性は、Levene 検定を使用して評価されました。正常または正常に近いグループの比較では、ペアワイズ事後 Tukey HSD 検定を使用した ANOVA 検定を使用して統計的差異を決定しました。分散が等しくないグループの場合は、Games-Howell 検定が使用されました。非正規変数は、全体的な有意性についてはノンパラメトリックなクラスカル-ウォリス検定を使用し、個別のグループの比較にはペアワイズウィルコックス (マン-ホイットニー U) 検定を使用して検定されました。 P 値は多重比較のために調整されました。イベントまでの時間分析は、有意性のログランク検定を備えたカプラン・マイヤー法を使用して実行されました。特に明記しない限り、データは平均値 ± SD として表示されます。各図の完全な統計処理は補足データ 2 に示されています。統計検定は両側で行われ、P 値 <0.05 が有意であると見なされました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

すべての生データは公開アクセスのためにアーカイブされています (https://doi.org/10.13020/yrva-zr31)52。

統計分析には R バージョン 4.0.3 を使用しました。 MATLAB 2018b は、実験的に記録された収縮と膨張のビデオから島の体積変化を計算するために使用されました。 MATLAB 2019a は、収縮 - 膨張曲線のフィッティングと化学毒性のコスト関数の評価に使用されました。カスタムコードは、対応する作成者からのリクエストに応じて入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

JSR は、シュルツ糖尿病研究所とミネソタ大学外科の移植部門の支援を受けました。著者らは、TEM の支援についてミネソタ大学特性評価施設の F. Zhou 氏と W. Zhang 氏、組織学実験の技術支援についてミネソタ大学臨床トランスレーショナルサイエンス研究所の C. Forster 氏と A. Lewis 氏に感謝します。著者らは、シュルツ糖尿病研究所外科部門の共焦点顕微鏡の使用とブタ島の提供に感謝している。この研究は、ミネソタ州再生医療 (EBF および JCB)、国立科学財団 (EEC 1941543、JCB および EBF)、および国立衛生研究所 (R01DK131209、JCB および EBF; R01DK117425、JCB および EBF; および R01HL135046) からの助成金によって支援されています。 JCBとEBF）。 LZ はミネソタ大学からの博士論文フェローシップに感謝し、JCB はミネソタ大学の機械工学の Kuhrmeyer 教授および医学工学研究所の Bakken 教授の支援に感謝します。 PPQ は、この活動を支援してくださった JW キークヘファー財団、スティーブンとバーバラのスラグギー家、ハリファ・ビン・ザイード・アル・ナヒヤーン財団に感謝します。

Li Zhan、Joseph Sushil Rao といった著者も同様に貢献しました。

著者 John C. Bischof、Erik B. Finger が共同でこの作品を監修しました。

ミネソタ大学機械工学科、ミネソタ州ミネアポリス、米国

リー・ザン、ゾンフー・ハン、マイケル・エサリッジ、カリ・S・ダッチャー、ジョン・C・ビショフ

ミネソタ大学外科（米国ミネソタ州ミネアポリス）

ジョセフ・スシル・ラオ、ダイアン・トボルト、エリック・B・フィンガー

ミネソタ大学シュルツ糖尿病研究所、ミネソタ州ミネアポリス、米国

ジョセフ・スシル・ラオ

米国ミネソタ州ミネアポリスのミネソタ大学化学工学および材料科学学部

ニキル・セシア & カリ・S・ダッチャー

米国ミネソタ州ロチェスター、メイヨークリニック生理学・生体医工学部

マイケル・Q・スラマ & クイン・P・ピーターソン

米国ミネソタ州ロチェスター、メイヨークリニック再生医療センター

クイン・P・ピーターソン

米国ミネソタ州ミネアポリスのミネソタ大学生物医工学部

ジョン・C・ビショップ

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LZ、JSR、JCB、EBF がこの研究を考案し、設計しました。 LZ、JSR、NS、MQS、DT は実験を実行し、データを収集しました。 ZH、NS、LZ はモデリングを実行し、データを組み立てました。 CSD、QPP、JCB、EBF がこの研究を調整し監督しました。 JCB と EBF が共同執筆者です。著者全員が議論とデータの解釈に参加しました。 LZ、JCB、EBF は、すべての著者からの意見をもとに原稿を執筆しました。

エリック・B・フィンガーへの通信。

LZ、JSR、ZH、NS、ME、CSD、JCB、EBF は、この研究に関連する仮特許出願 (シリアル番号 63/270,192) を提出しました。

Nature Medicine は、この研究の査読に貢献してくれた Gordon Weir、Klearchos Papas、およびその他の匿名の査読者に感謝します。ジェローム・スタールとジェニファー・サージェントはこの記事の主な編集者であり、他の編集チームと協力して編集プロセスと査読を管理しました。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

補足の結果と考察、方法、図 1 ～ 12、表 1 ～ 3、および参考文献。

膵島でカプセル化された 2 μl 液滴のレーザーナノウォーミング (7.5 ms レーザーパルス) の高速ビデオ (1 秒あたり 4,000 フレーム)。

P 値、検定統計量、信頼区間など、各数値の統計処理の概要。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Zhan、L.、Rao、JS、Sethia、N. 他ガラス化による膵島凍結保存は、移植のための高い生存率、機能、回復および臨床的拡張性を達成します。 Nat Med 28、798–808 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41591-022-01718-1

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受信日: 2021 年 9 月 24 日

受理日: 2022 年 1 月 26 日

公開日: 2022 年 3 月 14 日

発行日：2022年4月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-022-01718-1

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