ドームとセミ - 南通組織消耗品有限公司

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3165 (2023) この記事を引用

492 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

マイクロメートルサイズのサンプルの赤外顕微鏡検査では、ミー散乱に起因する強い散乱歪みが発生することはよく知られています。生体サンプルの赤外吸収スペクトルからミー散乱特徴をモデリングして除去するための最先端の前処理技術は、完全な球体のメタモデルに基づいて構築されています。ただし、非球形のセル形状は例外ではなく標準であるため、変形した球形システムに対するこの前処理手法の有効性を評価することは非常に重要です。これらのケースに対処して、変形した個々の細胞と小細胞のモデルシステムとして、3D プリントされた個々のドーム、最大 5 つのドームの列、距離が異なる 2 つのドーム、およびさまざまな長さの半カプセルの吸光度スペクトルを数値的および実験的に調査します。クラスター。個々のドーム間の結合効果は小さいことがわかり、これは球に関する以前の関連文献の結果を裏付けています。さらに、光学的相反性により上部照明と下部照明で同じ消光効率が保証される一方で、散乱体の内部場はこれら 2 つの状況で大きく異なる可能性があることを例を挙げて指摘し説明します。最後に、球状生物学的システムからの赤外スペクトルを前処理するための ME-EMSC モデルが、変形した球状システムに対しても有効であることを実証します。

現在までに、中赤外スペクトル範囲で生物サンプルおよび無生物サンプルの振動分光分析を行うための強力な技術がいくつか利用可能です。その中には、例えば、ラマン分光法 1、中性子分光法 2、光音響分光法 3、4、5、6、および電子エネルギー損失分光法 7 があります。しかし、さまざまなサンプルの生化学的特性評価に最も広く使用されている分析手法は、フーリエ変換赤外分光法 (FTIR)8、9、10、11 です。したがって、この技術の能力をさらに高め、その適用範囲を拡張することが、この文書の焦点です。生物学的 FTIR 薄膜スペクトルの取得、補正、解釈は確立された技術に基づいていますが、個々の生物学的細胞および小さな細胞集合体の FTIR 分光法の分野では、多くの作業が残されています。赤外線の波長とほぼ同じサイズの生体細胞が非常に効果的な散乱体であることはよく知られています。ヒト細胞の赤外分光法で観察される強い散乱の特徴は、モーレンホフらによってミー型散乱に起因すると考えられました。それ以来、球面モデルシステムは、生物学的システムのモデル化と散乱痕跡の除去に頻繁に使用されてきました 13、14、15、16。ミー散乱による 2 つの主な寄与は、ウィグルとリップルです17。ウィグルは、干渉効果によって引き起こされる長距離振動です17。これらは、赤外消光スペクトルの平均的な挙動を決定します。波紋は、小刻みな波の上に重なった鋭いピークです。これらは形状共鳴、つまりサンプル内部の定在波によって発生します18。

しかし、球状モデルシステムが赤外分光測定における生体細胞の記述に適しているかどうかはよくわかっていません。ほとんどの生体細胞は完全な球形であるとは期待されておらず、自然界では異なる形状が一般に観察されます。例としては、細菌、酵母、藻類などがあり、球形から回転楕円体、細長いカプセル形まで幅広い形状を示します。さらに、細胞を赤外顕微鏡スライド上に堆積させると、細胞がスライドに付着して形状が変形する可能性があります。対照的に、花粉粒などの構造的に安定したサンプルは、スライド上に置かれたときに球形を維持すると予想されます。これは花粉粒子の光学顕微鏡検査で見ることができます。赤外吸光度測定では、花粉粒は、小刻みな動きと波紋の両方を伴う、ほぼ完璧なミー散乱の特徴を示します19。リップルは散乱体の形状に敏感であり、形状の変形により赤外スペクトルのリップルを抑制または除去できることが示されています20。したがって、光学顕微鏡による直接観察に加えて、波紋の存在は、花粉粒が球形を保持していることを示すさらなる指標となります。

赤外分光法を使用して生体細胞を調査する場合、細胞は集合体で発生することがよくあります。赤外分光法における典型的なサンプル構成は、組織内の真核細胞、または基板上に堆積された複数の単一細胞です。したがって、隣接するセルが散乱シグネチャに影響を与える可能性のある結合効果を経験しているかどうかを知ることが重要です。

この研究の目的は、(1) ドーム形 (半球) 系と細長いドーム形の系 (半カプセル) における散乱痕跡を説明すること、(2) 隣接する粒子 (ドームなど) 間のカップリングの影響を理解することです。 (3) シンクロトロン光源 (SR-FTIR) と焦点面アレイ (FPA) 画像検出器を備えた球状光源の両方を使用して、定性的に数値シミュレーションした結果とフーリエ変換赤外分光法 (FTIR) によって得られたスペクトルを比較する。 (4) サンプルに入射する赤外線の照明方向の反転の影響を調査する。(5) ミー散乱の歪んだスペクトルから純粋な吸光スペクトルを取得するための既存の前処理技術が、変形した赤外線スペクトルの補正に適しているかどうかを評価する。球状システム。

ドーム型および細長いドーム型構造は、3D プリンティング技術、つまり 2 光子誘起直接レーザー書き込み (2PDLW) を使用して得られました。

FTIR 分光法では、吸光度スペクトル Z は、サンプルに入射する強度 \(I_0\) とサンプルを透過する強度 I を測定することによって決定されます。

理想的には、入射放射線は分子吸収によってのみ減衰され、分子指紋として直接解釈できる純粋な吸収スペクトルが得られます。ただし、散乱は検出器での放射線の損失にも影響します。散乱の寄与により吸光度スペクトルが大幅に変化する可能性があるため、純粋な吸光度スペクトルを取得するには補正方法が必要になります19。

吸収または散乱によって前方向から除去される放射線の総量を計算するには、消光断面積の比として定義される無次元の消光効率 \(Q_{\textrm{ext}}\) を調べます。サンプルの幾何学的断面図17。次の式は、見かけの吸光度と消光効率の関係を示しています 19,20:

ここで、G と g はそれぞれ検出器とサンプルの幾何学的断面です。 (2) では \(G\gg g\) と仮定します。 (2) によれば、\(Q_{\textrm{ext}}\) は吸光度 Z に顕著に現れるため、\(Q_{\textrm{ext}}\) は注目すべき量です。一方、均質な膜を除いて、波数の関数として \(Q_{\textrm{ext}}\) を計算するために利用できる厳密な閉形式の解析式は存在せず、\(Q_{\textrm{ ext}}\) を取得できます。この等価性により、測定された見かけの吸光度スペクトル (式 1) は吸光スペクトルとも呼ばれます。

Ref.17 に従って、この論文で説明するシミュレーションと実験に関連する \(Q_{\textrm{ext}}\) の近似式は、光線として表される入射放射線が散乱体をまっすぐに横切ると仮定することによって求められます。偏向がないため、散乱体の内部で位相シフトのみが発生します。検出器では、入射放射線が位相シフト放射線と結合して波干渉が生じ、\(Q_{\textrm{ext}}\) が生成されます。この干渉効果に基づいて、半球、半カプセル、および半円柱の解析消光式が付録 A で導出されます。

トンネル効果と回折効果を含めて、付録に示されている式の精度の大幅な向上が達成できることを指摘します (たとえば、球の場合については参考文献 21 を参照)。ただし、これらのより複雑な式は、この文書の目的には必要ありません。

2 光子誘起直接レーザー書き込み (2PDLW) では、2 光子吸収により、非常に少量の厳密に集束されたレーザービーム内で局所的な重合が得られます22。フォトレジストの重合を引き起こす軌道に沿った焦点の変位により、固体の 3D 微細構造が形成されます。 2 光子吸収プロセスとそれに続く閉じ込め重合により、100 nm またはさらに高い製造解像度が得られる可能性があります 23。このような解像度により、2PDLW は、制御された条件下での赤外分光分析用に、明確に定義されたサイズ、形状、および相対位置を備えたドームおよび細長いドームの製造に理想的に適しています。

FTIR分光法によって調査された各構成のSEMおよび顕微鏡画像。 (a) 半径 \(R=10\,\upmu \hbox {m}\) の単一のドーム、(b) 連続して接触するドーム、(c) 距離 d が増加する 2 つのドーム、(d) 半エンドキャップの半径が \(R= 10\,\upmu \hbox {m}\) と伸び L に等しいカプセル (細長いドーム)。サンプルの材質は OrmoComp24 です。

3D プリントされたドーム型構造は、市販の 2PDLW セットアップ (Microlight3D) を使用して取得されました。それは、周波数倍増 Q スイッチ Nd:YAG レーザー (532 nm、0.56 ns パルス幅、11.7 kHz) を備えた倒立顕微鏡 (Zeiss Axiovert 200) で構成されています。 40x 対物レンズ (NA 0.95、ドライ、Zeiss Plan-APOCHROMAT) を使用して、サンプル内でレーザービームの焦点を合わせました。 3D オブジェクトは、\(100\times 100\times 100 \,\upmu \hbox {m}\) 移動範囲ピエゾマニピュレーターを使用して、レーザー焦点スポットに対してサンプルを移動させることによって取得されます。レーザー出力は音響光学変調器によって制御できます。ピエゾマニピュレータは、基板表面上の構造を自動複製するための長距離移動ステージと組み合わされています。オートフォーカスシステムを使用して、各オブジェクトを基板表面に対して同じ位置に 50 nm 以上の再現性で配置します。スキャン速度、レーザー出力、3D 軌跡はコンピューター制御されます。

3D 構造は、Ormocomp フォトレジスト (Microresist Technology) を使用して作成されました 24。約 5 \(\upmu \hbox {L}\) 滴のフォトレジストを 170 \(\upmu \hbox {m}\) の顕微鏡カバーガラスの表面に堆積させました。微細加工後、Ormodev (Microresist Technology) を溶媒として使用し、未反応のフォトレジストを 2 回の連続洗浄ステップによって除去しました。洗浄後、サンプルを空気中で乾燥させた。 3D プリントでは、プリベークまたはポストベークの手順は使用されませんでした。

微細加工された構造は、Zeiss Supra 55VP 装置を使用した走査型電子顕微鏡 (SEM) によって特性評価されました。 SEM 実験の前に、Leica EM ACE600 スパッタコータを使用してサンプルの表面に 5 nm の金コーティングを堆積し、電荷の蓄積を除去し、SEM 測定のコントラストを向上させました。

CAD ソフトウェアを使用して取得した 3D 構造を Simpoly 4.5.1 でスライスしました。処理時間を短縮するために、オブジェクトの内部部分は表面よりも薄くスライスされました。 Liao et al.25 が提案したのと同様に、表面品質を改善するために、スライス方向はビーム伝播軸に垂直になるように選択され、ボクセル位置は構造の幾何学的な傾斜に従って決定されました。最適な製造条件を見つけるために、SEM 実験によるフィードバックでスライスパラメータ、露光時間、およびレーザー出力を変更し、多数の複製を作成しました。図 1 は、調査したサンプルの SEM 写真を示しています。(1) ドーム (図 1a)、(2) 接触するドームの線形アレイ (図 1b)、(3) 距離が増加するドーム (図 1c)、 (4) 半カプセル (細長いドーム) (図 1d)。

CAD ソフトウェアを使用して、ドーム形状 (半球) および細長いドーム形状 (半カプセル) の構造を設計しました。構造の電子顕微鏡画像と赤外光学顕微鏡画像を図 1 に示します。ドームの半径は \(10\,\upmu \hbox {m}\) でした。細長いドーム (セミカプセル) は、距離 L に配置された 2 つの 4 分の 1 球と、それらの間に配置された半円柱 (\(R=10\,\upmu \hbox {m}\) と長さが増加する L) を組み合わせて設計されました。 (図1dを参照)。研究では半径は一定に保たれましたが、L は 0 から 1.5R まで変化しました。分離された個々のドームを作製することに加えて、図1bおよびcに示すように、相互のさまざまな相対位置で複製して、それらの結合を研究しました。 2 種類の構成が使用されました。まず、ドームを並べて配置する直線状のアレイを作成しました。アレイ内のドームの数は 2 から 5 まで変化しました。次に、0 と 2R の間で変化する相対間隔 d でドームのペアを作製しました。すべての構成は 5 つの複製で製造されました。

原子間力顕微鏡画像は、Zeiss AxioObserver に搭載された JPK NanoWizard II AFM (JPK、ケンブリッジ、英国) を使用して、接触モードで収集されました。窒化ケイ素カンチレバー (Veeco、ケンブリッジ、英国) を使用しました。

肺がん細胞株 (CALU-1) からの FTIR スペクトルは、シンクロトロン結合 Nicolet Continuum IR 顕微鏡 (ThermoFisher Scientific、Courtaboeuf、フランス) を使用し、32\(\times\) のシュワルツシルト対物レンズと MCT シングル元素検出器。測定は、フランスのソレイユシンクロトロンの SMIS ビームラインで行われました。実験の詳細については参考文献 26 を参照してください。この実験では、欧州細胞培養コレクション (英国ソールズベリー) から購入した非小細胞肺がん (NSCLC) 細胞株 SK-MES から細胞を取得しました 20,27。

3D プリントされたドームとセミカプセルの FTIR スペクトルは、SOLEIL シンクロトロンの SMIS ビームラインで収集されました。すべてのサンプルは、肺がん細胞と同じ FTIR 顕微鏡を使用し、同じ倍率と検出器で測定されました。ドームとセミカプセルの共焦点開口は \(10\times 10\,\upmu \hbox {m}\) に設定されました。開口部の幅は、セミカプセルの空間範囲全体をカバーするために、L に合わせて増加しました。スペクトル分解能は 4 \(\hbox {cm}^{-1}\) に設定されました。各サンプルについては合計 64 回のスキャンが平均され、バックグラウンドについては 512 回のスキャンが平均されました。スペクトルは、構成ごとに 4 ～ 5 つのレプリカから収集されました。次に、各構成のスペクトルの平均が計算されました。

シミュレーションは表面積分方程式 (SIE) 法によって実行されました28。これは、3 次元の電磁気問題を解決するために頻繁に使用される強力な数値手法です。 SIE 法は、サンプル表面の等価表面電流密度を解くため、体積ベースの方法 (FEM、FDTD、VIEM など) と比較して未知数の数が減少します 29。均質な誘電体に対してはさまざまな SIE 定式化が存在します。私たちのコードでは、複合接線定式化 (CTF) を使用します。 SIE ソリューションの効率をさらに向上させるために、Multilevel Fast Multipole Algorithm (MLFMA)30 が採用されています。消光効率は、SIE 解ベクトルと励起ベクトルから計算されます 31,32。私たちのコードは、解析的な Moe ソリューションによって検証されており 33、以前の研究で均質な誘電体オブジェクトのシミュレーションに使用されています 33。

一般に、生物学的サンプルの形状を調査した結果、生物学的細胞が基板上に堆積されたときに完全な球体に似ていない可能性があることは明らかです。肺がん細胞のトポグラフィーを示す AFM 高さマップの例を図 2a に示します。この図は、セルの形状が球よりもドームに近いことを示しています。肺がん細胞がスライドの表面に貼り付くため、形状が変形します。これは、構造的に柔らかいサンプルの多くの場合、ドーム型システムが生体細胞を説明するためのより良いモデルシステムであるという私たちの仮定を強化します。 2D 等高線ヒートマップ (図 2b) は、図 2a と同じ情報を示しますが、2D でのセルの構造は定量的により良く表現されています。同じ細胞から収集された赤外スペクトルが図 2c に示されており、散乱の痕跡が明確に存在しています 15,27。対照的に、同じ図では、散乱特徴のないヒト細胞の代表的なスペクトル (マトリゲルスペクトルで表されます 15) がオレンジ色で示されています。純粋な吸光度スペクトル (オレンジ色の線) は、がん細胞が散乱していない場合に測定されると予想されるものとほぼ同じです。

肺がん細胞の性質。 (a) ドームに似た 3D トポグラフィーを示す AFM 高さマップ。 (b) (a) と同じ情報を示す 2D 等高線ヒートマップですが、2D 断面情報がより明確に表示されます。 (c) ミー散乱の寄与を含む肺がん細胞の赤外スペクトル 15,27 (青線) と、ミー散乱の寄与を含まないヒト細胞をほぼ代表する純粋なマトリゲル吸光度スペクトル (オレンジ線) との比較。

3 つの異なるシステム、すなわち、一列に並んだドーム (図 1b)、距離が増加した 2 つのドーム (図 1c)、および伸び L を変化させた半カプセル (図 1d) を調査しました。これらのシステムのスペクトルを図 3a に示します。図 3 のすべてのスペクトルは、同一のシステムからのスペクトルの平均です。

まずは連続ドームから。図1bに示すように、ドームの数は1から5の範囲であり、単一のドームが基準システムとして機能し（隣接するものはありません）、列2から5のドームはすべて接触しており、ドーム間の結合が最大になります。各列で、列の中心に近いドームの 1 つからの吸光度スペクトルを記録しました。得られた吸光度スペクトルを図 3a の上のセットに示します。ドームが近接しているにもかかわらず、連続して接触するドームの数に関係なく、隣接するドームがスペクトルに与える影響は無視できることがわかります。散乱サインのわずかな変動は、7500 ～ 5000 cm\(^{-1}\) の領域で最も顕著ですが、系統的ではありません。

(a) ドームおよび細長いドームサンプルからの赤外線吸収スペクトル。構成ごとに 4 ～ 5 個のレプリカの平均が表示されます。すべての状況において、ドームの材質は OrmoComp24 で、ドームの半径は \(10\,\mu\)m です。上のセットは、1 つのドーム (赤線) から 5 つのドーム (青線) まで、連続したドームの吸光度スペクトルを示しています。中央のセットは、距離が \(d = [0, 5, 10, 20]\, \upmu \hbox {m}\) (それぞれ赤から青の線まで) 増加するドームを示しています。下のセットは細長いドームの吸光度スペクトルを示しています。ここで、伸び L = [0, 2.5, 5, 10, 15] \(\upmu \hbox {m}\) (b) 屈折率 1.5 の細長いドームの消光効率伸び L を増加させるため。エンドキャップの半径は R = \(10\,\upmu \hbox {m}\) です。一点鎖線は、L が 0 から 3R に増加する場合の電磁 SIE シミュレーションによって見つかった \(Q_{\textrm{ext}}\) を示しています。実線は、式(1)による近似を示しています。 (A.16) ここで、L は 0 から 50R まで増加します。赤い破線は、無限に長い半円筒の \(Q_{\textrm{ext}}\) の近似値です (式 A.15)。緑色の線は、正確なミー理論によって計算された、半径 \(10\,\upmu \hbox {m}\) および屈折率 1.5 の球の \(Q_{\textrm{ext}}\) を示しています。緑色の線は、上側 (緑色) の波数軸に関連付けられています。 (c) 連続したドーム (実線) と距離が増加するドーム (破線) で構成されるシステムの \(Q_{\textrm{ext}}\) をシミュレートしたもの。黒い線は単一ドームの \(Q_{\textrm{ext}}\) です。ドームの数は 1 (赤線) ～ 4 (青) の範囲です。シミュレーション時間を短縮するために、最長アレイの波数領域が縮小されます。ドームの距離が増加する場合、2 つのドーム間の距離 d は 0 から R まで増加します。どちらの調査でも、R は \(10\,\upmu \hbox {m}\) に設定され、屈折率は 1.5 です。ラインは重なり合う度合いが高いため、水平方向に分離されます。ライン間ではリップル構造の小さな違いのみが観察されます。

図 3a は、図 1c に示すように、距離が増加する 2 つのドーム (中央のセット) の吸光度スペクトルを示しています。測定は、ペアのドームの 1 つで行われます。図 3a は、このシステムでも吸光度の変動が無視できることを示しています。赤い線はドームに接触した場合の吸光度です。他の線は、ドーム間の距離 d が \(d=2R\) まで増加した場合の吸光度を示します (青線)。

図1dのLが0から1.5Rまで徐々に増加する半カプセルを調べると、ウィグル構造がより低い波数に向かってシフトしていることがわかります（図3aの下のセット）。「方法」で説明したように、これらのスペクトルで見られる吸光度の垂直方向のシフトは、開口数のサイズの変化 (L に応じて増加) によって引き起こされます。

吸光効率 \(Q_{ext}\) は、式 (1) によって測定された吸光度に関係します。 (2)。上で述べたように、高度な対称性を持つ特殊なシステムの場合、正確な消光効率は電磁気理論、たとえば球の場合のミー理論 34 から解析的に求めることができます。この場合、顕微鏡スライドの存在は無視されます。この影響については、続報で調査する予定です。球については、近似的な解析解を見つけることもできます (付録 A を参照)。ただし、非積分可能システムの場合は、正確な分析結果が見つからないため、分析ソリューションに対して近似アプローチのみを使用できます。 SIE などの数値的アプローチを使用して、非可積分系の散乱問題を解決することもできます。

ドームは軸対称ですが球面対称ではないため、上部照明（入射ビームは負の z 方向に伝播します。つまり、入射放射線はドームの底面に向かってドームの先端から入射します）と下部照明を区別できます。照明（入射ビームは正の z 方向に伝播します。つまり、入射放射線はドームの底面を通ってドームの先端に向かって入射します）。上部と下部の照明が同じ \(Q_{\textrm{ext}}\) を生み出すことを数値的に確認しました。これは光の相反定理 35 によって保証されています (図 4c を参照)。

図 3b は、式 3 に従った細長いドームの近似 \(Q_{\textrm{ext}}\) とともに、解析的なミー解を緑色で示しています。 (A.16) を実線で、細長いドームの \(Q_{\textrm{ext}}\) の数値シミュレーションを一点鎖線で示します。分析的なミー解は、上部の緑色の x 軸に対応していることに注意してください。ドームの場合、伸びは伸びなし (\(L=0\)、青い線) から \(L=\) [ 2.5, 5, 10, 15, 30 ] \(\upmu \hbox {m}\) まで変化します。 ) 、最長の伸びは赤い線に対応します。ドームの半径は R=\(10\,\upmu \hbox {m}\) に設定され、屈折率は 1.5 に設定されます。これは、吸収を無視した場合の OrmoComp24 ブルーの屈折率とほぼ同じです。非吸収粒子をシミュレートすることで、\(Q_{\textrm{ext}}\) に対する散乱の影響を分離します。図 3b で最初に気づくのは、\(Q_{\textrm{ext}}\) のうねりが数値計算 (一点鎖線) と近似式 (実線) で一致していることです。

半円筒の伸びを持つ細長いドームの \(Q_{\textrm{ext}}\) の近似 \(L=500\,\upmu \hbox {m}\) (濃い赤色の実線) に加えて、図 3b は、半円柱の \(Q_{\textrm{ext}}\) (式 A.15) を暗赤色の破線で示しています。 L を増加させると、結果の \(Q_{ext}\) が半円柱の値に近づくことは明らかです。 \(Q_{\textrm{ext}}\) の数値計算は、近似 \(Q_{\textrm{ext}}\) と同じ傾向を示しますが、伸びは \(L=500\,\upmu \) です。 hbox {m}\) は数値計算を行うには大きすぎます。

数値シミュレーションは、電場が半円筒の長手軸に対して垂直になるように分極された入射場に対して行われます。図から明らかなように、伸びによりリップルが弱まります。これは、ウィスパリングギャラリーモードが伸び軸である電場に垂直な方向で最も強いためである。ただし、 \(L>0\) の場合、変形した形状が境界に沿った定在波をサポートしないため、これらのささやきギャラリーモードは消滅します。これは参考文献20で報告された結果によって裏付けられています。細長い軸に平行な電場の分極については、付録 B を参照してください。

図 3b から、ドームを横切る赤外線の光路長が、横切るのに必要な光路長と比較して 2 倍に短縮されたことを補正すると、近似 Qext と数値 Qext のうねりも完全なミー解と一致することがさらに明らかです。球体。これを示す目的は、完全な球体とドームの Qext の関係を示すことです。分散の場合、屈折率の波長依存性によるスケーリングも必要になることに注意してください。ただし、ME-EMSC モデルでは、スケーリングに関する事前の知識は必要なく、ウィグルと分散のスケーリングが自動的に調整されます。したがって、この結果は、ドーム状散乱体から得られるスペクトルの補正に対するファンドハルスト近似の適用可能性を裏付けています。

はるかに弱いですが、図 3b は、数値ドーム \(Q_{\textrm{ext}}\) (青い一点鎖線) の波紋が球 \(Q_{\textrm{ext}}\) の波紋と並んでいることを示しています。 }}\）（緑の線）。これは、ドームの底面での屈折率の不連続性、つまりドームの内側の \(n=1.5\) から \(n=1\) への急激な変化に基づいて理解されます。 ) ドームの外側にある不完全な鏡のように機能し、鏡像を介してドームの共鳴を球の共鳴に補完することができます。したがって、上下対称の球内の共鳴もドーム共鳴となります。ドームの波紋と球の波紋のコントラストが低下していることもわかります。これは、ドームの底面ミラーが不完全であるため（つまり、反射とは別に、かなりの透過も可能にするため）、ドームの共振がドームの容積から簡単に漏れる可能性があるためです。ミラー面を通過するため、ドームリップルの顕著性が大幅に減少します。ドームの底面から放射が漏れるため、ドームは漏れのある誘電体共振器とみなすこともできます。共振器内に漏れがあると、共振器の品質係数が低下し、共振の広がりが生じます。このメカニズムは、観察されたドームの波紋が、対応する球体の波紋よりも高さが小さいだけでなく、幅がはるかに広い理由を説明します。

また、連続してドームに接触する場合の \(Q_{ext}\) の数値シミュレーションも実行しました (図 1b)。これらのシミュレーションの結果を図 3c に実線で示します。異なるシステムの \(Q_{ext}\) の変化が小さいことは明らかです。距離が増加する 2 つのドームにも同じことが当てはまります (図 1c)。その \(Q_{ext}\) は図 3c に破線としてプロットされています。ドーム間の距離 d は、ほぼ距離がない (\(d=0.04\,\upmu \hbox {m}\)) から \(d=R=\) \(10\,\upmu \hbox {m) まで変化します。 }\)。 \(Q_{ext}\) は実質的に影響を受けません。これらの結果は、参考文献 33、36 で報告されている内容を裏付けており、接触している場合と分離している場合の両方の球の小さな集合体についても同じ結論が導き出せることを示しています。参考文献 33 には、異なる半径を持つ球の集合体の場合、消光効率はすべての球の平均値が個別にとられることも示されています。同じ結論が半球にも当てはまると想定できます。

付録 C では、半ディスク型の散乱体と半スタジアム型の散乱体からなる 2 次元システムについて、同様の数値調査の結果が報告されています。これらのシステムは、3 次元では不変な 3 次元システム (無限に長い半円筒など) と同等です。シミュレーションは 3 次元の結果と同じ傾向を示します。つまり、隣接する散乱体の影響は無視できますが、半ディスクから半スタジアムへの移行により消光効率の変動が生じます。

前のセクションで、光の相反定理35は \(Q_{\textrm{ext}}\) が底部と上部の照明に関して不変であることのみを必要とし（図4cに示すように）、条件については何も述べていないことを指摘しました。これら 2 つの場合における散乱体の内部電場分布の形状。実際、下部照明では上部照明とは異なる電場強度分布が得られます。 \(R=10\,\mu\)m のドームに対して、上部と下部の両方の照明を使用してシミュレーションが実行されました。複素屈折率を使用して、\(Q_{\textrm{ext}}\) の不変性が吸収材料にも同様に保持されることを実証しました。 OrmoComp の屈折率は不明なため、屈折率を PMMA37 に設定しました。詳細な数値シミュレーションの結果、図 4a は上部照明を使用したドームの電場強度分布を示し、図 4b は同じドームで下部照明を使用した電場強度分布を示します。これら 2 つの場合では、まったく異なる電場分布が得られます。実際、上部の照明では水平ストライプの形の強度分布が得られますが (図 4a)、下部の照明ではささやき回廊モード 18 (図 4b)の形の強度分布が得られます。ささやきギャラリーモードは、球体の \(Q_{\textrm{ext}}\) の波紋の起源として以前に特定されました (図に示す \(Q_{\textrm{ext}}\ の鋭い特徴を参照) .3b)。前のセクションで説明したように、ささやきギャラリーモードは上下対称であるため、不完全な底面ミラーが図4bに示すささやきギャラリーアークを完成させることができるため、ドーム内でも同様に発生すると予想する必要があります。球の完全なささやきギャラリーモードを示し、ドームの場合の球の波紋と同じ場所での波紋とその位置を説明します。驚くべきことに、ドームの場合、対応する共鳴波動関数の形態は照明方向に依存するということです。ドーム型の散乱体（およびその他の不規則な形状の散乱体）における異なる電場分布は、赤外分光法に重要な影響を与える可能性があります。図4に示すように、散乱体の異なる内部領域は、上部と上部に応じて異なる強度で照射されるからです。下部のイルミネーション。たとえば、入れ子になったドームの形の細胞を考慮すると、下部照明は細胞壁を優先的にプローブし、上部照明は細胞の内部容積を優先的に同時にプローブします。したがって、ある程度の空間的に分解された細胞化学を得ることができた。これらの違いは、光の相反性定理により \(Q_{\textrm{ext}}\) では確認できませんが、透過赤外線に加えて散乱放射線も測定すると確認できる可能性があります。これは、赤外線顕微鏡の開口数によって部分的に行われます。上部照明と下部照明に対処する実験はまだ行っていませんが、詳細な SIE シミュレーション (いくつかの独立した予備的な VIEM シミュレーションで裏付けられています) では、さまざまな内部磁場分布 (図 4 を参照) とそれに対応する分布が非常に明確です。異なる散乱シグネチャ。

ドームの場合に得た結論は、2 つの吸収層を持つフィルムスタックの場合でも明確に裏付けることができます。この場合、吸光効率、散乱効率、吸収効率など、関連するすべての量に対して閉じた形式の解析式を取得できます。つまり、\(Q_{\textrm{ext}}\)、\(Q_{\textrm{scat} }\)、\(Q_{\textrm{abs}}\) となります。この式は、吸収の場合でも同じ \(Q_{\textrm{ext}}\) を分析的に取得することにより、光学的相反性 35 を確認します。彼らはまた、内部電場分布が上部照明と下部照明の 2 つのフィルムで異なることも示しています。これは、吸収フィルムスタックの場合、明示的かつ解析的に計算できます。

また、半円筒と半カプセルを使った追加の数値シミュレーションを実行し、\(Q_{\textrm{ext}}\) は不変である一方で、これらのシステムの上部と下部の照明によっても異なる内部電場強度が生成されることを確認しました。上部照明と下部照明の分布。

上部照明と下部照明のコンテキストでは、斜入射について疑問に思う人もいるかもしれません。この状況についてはまだ調査していませんが、おそらく同じ影響が発生するでしょう。ただし、斜め入射の場合は、入射ビームの偏光が重要となるため、相互条件を慎重に定義する必要があります。斜め入射の場合でも \(Q_{\textrm{ext}}\) は不変であると予想されますが、内部電界分布は再び異なることが予想されます。これらは難しいですが重要な問題であり、今後の研究の対象となります。

\(n=1.5\) と \(R=10\,\mu\)m の \(2374\,\textrm{cm) におけるドームの内側と外側の電場分布 \(|E|^2\) }^{-1}\)。 (a) 上部照明。内部電界強度は横縞状になります。 (b) 底部照明。内部電界強度はささやきギャラリーモードとして現れます。したがって、\(Q_{\textrm{ext}}\) は両方の照明方向で同じですが、ドーム内の対応する電場分布は、上部照明と下部照明で大きく異なります。 (c) 上部と下部の照明を備えた吸収ドームの消光効率。ドームの屈折率は、37 に示されているように PMMA に設定されます。消光効率は上部照明と下部照明で同じです。

球状の生体サンプルから散乱痕跡を推定して除去するために、ME-EMSC アルゴリズム 15 は最先端技術とみなされています。このアルゴリズムは、球の \(Q_{ext}\) に対するファンドハルスト近似を使用するメタモデルに基づいています。 \(Q_{ext}\) のいくつかの妥当な解が計算され、それらはいくつかの基底ベクトルに圧縮されます。基底ベクトルは、測定された吸光度スペクトルを再構築するために使用されます。この論文で指摘されているように、生体サンプルが完全な球形であることはまれで、たとえばドームや半カプセルに近い場合もあります。したがって、セミカプセルの \(Q_{ext}\) が、メタモデルで使用される球解が広がる基底ベクトルの部分空間内に存在するかどうかを知ることが重要です。半球の \(Q_{ext}\) がこの部分空間内に存在することは明らかですが、ファンドハルスト近似の解は球と半球で同一であるため (有効光路の違いを調整すると)長さ)、これは \(L>0\) のセミカプセルには当てはまりません。

この質問に答えるために、図 5a に示す屈折率を持つ吸収セミカプセルを考えます。屈折率の実数部は青色、虚数部はオレンジ色で表示されます。屈折率は、虚数部のローレンツ線をシミュレートし、クラマース・クローニッヒ関係を使用して屈折率の変動する実数部を計算することによって確立されます。実部には定数オフセット 1.5 が使用されます。材料の吸収特性を変更できるように、シミュレートされた屈折率が使用されます。 \(R =10\,\upmu \hbox {m}\) および \(L = 10\,\upmu \hbox {m}\) は、図 5b の赤い破線で示されています。式 (A.12) は、セミカプセル \(Q_{\textrm{ext}}^ \mathrm{semi-capsule}\) を計算するために使用されます。

次に、式 1 に従って、吸収球の 100 個の消光効率 \(Q_{\textrm{ext}}^{\textrm{sphere}}\) が計算されました。 (A.2)。複素屈折率は、実部の一定のオフセットが 1.3 と 1.7 の間で変化したこと以外は、セミカプセルの場合と同じでした。球の半径は \(R = 5\,\upmu \hbox {m}\) から \(R = 10\,\upmu \hbox {m}\) まで変化しました。さらに、曲線は、ME-EMSC メタモデルと同様に、PCA によって \(n_{\textrm{comp}}\) 個の主成分 \(p_i\) に圧縮されます15。

\(Q_{\textrm{ext}}^ \mathrm{semi-capsule}\) が \(p_i\) で表現できるかどうかを調べるには、 \(Q_{\textrm{ext}}^ \ mathrm{semi-capsule}\) が \(p_i\) によって広がる空間に投影されました。再構成された \(Q_{\textrm{ext}}^ {\mathrm{semi-capsule}, r}\) は、元の \(Q_{\textrm{ext}}^ \mathrm{semi-capsule} とともに表示されます)図 5b の \)。再構成された \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{semi-capsule}, r}\) は、異なる数の主成分 \(n_{\textrm{comp}}\) で確立され、次のようになります。さまざまな青の色合いで表示されます。元の \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{semi-capsule}}\) は赤い破線で示されています。少数の主成分 (\(n_{\textrm{comp}} = 5\)) の場合、再構成には比較的大きな誤差が生じることは明らかです。主成分の数を増やすと、再構成が向上します。 \(n_{\textrm{comp}} = 12\) の場合、再構成はほぼ完璧です。 L が長い場合、満足のいく再構成を得るために一般に必要な主成分の数が増加します (結果は示されていません)。ただし、 \(n_{\textrm{comp}} > 9\) の場合、再構成は長い伸長に対しても満足のいくものになります。

ME-EMSC では、部分空間モデルで使用される主成分の数はユーザーが設定する必要がある変数です。デフォルト値は説明された分散に基づいており、通常は 7 です。私たちの結果は、非球形サンプルの場合でも、モデルは変形した球体に対して \(Q_{\textrm{ext}}\) を記述することが期待されることを示しています。ただし、モデル内のコンポーネントの数を増やす必要がある場合があります。この解析では、ME-EMSC で採用されている球部分空間モデルにも細長いドームの解が含まれていることを示します。したがって、ME-EMSC は、生物細胞のより代表的なモデルである細長いドーム型システムにも有効であると結論付けます。

\(p_i\) が任意の複素屈折率から計算された \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{semi-capsule}}\) を再構成できないことを実証するために、わずかに異なる化学をシミュレートして次のように使用しました。 \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{semi-capsule}}\) の入力。元の複素屈折率との違いは、一部のピーク位置が次に従って移動されていることです。 1500 \(\hbox {cm}^{-1}\) \(\rightarrow\) 1520 \(\hbox {cm}^{- 1}\)、2010 \(\hbox {cm}^{-1}\) \(\rightarrow\) 1950 \(\hbox {cm}^{-1}\)、3000 \(\hbox {cm} ^{-1}\) \(\rightarrow\) 3500 \(\hbox {cm}^{-1}\)、5400 \(\hbox {cm}^{-1}\) \(\rightarrow\) 5350 \(\hbox {cm}^{-1}\)。以前の \(p_i\) を使用して新しい \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{semi-capsule}}\) を再構成する場合、シフトされたピークを正確に取得することはできません。図 5c は、再構成された \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{semi-capsule}, r}\) と新しい \(Q_{\textrm{ext}}^{\) を青の色合いで示しています。 mathrm{semicapsule}}\) を赤色の破線で示します。再構成されたスペクトルがシフトされたピークを説明できないことは明らかです。

(a) \(Q_{\textrm{ext}}\) の計算に使用される屈折率。実数部 \(n_r\) は青色、虚数部 n はオレンジ色で表示されます。 (b) \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{semi-capsule}}\) (赤い破線) は \(n_{comp}\) 個の基底ベクトルから再構成されます。青い線は、使用される基底ベクトルの数が異なる、さまざまに再構成された \(Q_{\textrm{ext}}^{\mathrm{semi-capsule,r}}\) を示しています。 (c) 100 個の \(Q_{\textrm{ext}}^{\textrm{sphere}}\) 曲線の計算に使用される化学的性質 (屈折率によって決定される) が変更されると、再構成 \(Q_{\textrm {ext}}^{\mathrm{semi-capsule,r}}\) は吸収帯で失敗します。

肺がん細胞の AFM 画像（図 2a を参照）を評価することにより、その形状が球よりもドームと一致していることが観察されます。肺癌細胞と同様に、この形態は、顕微鏡スライド上に堆積された場合、構造的に不安定な多くの生体細胞で一般的に予想されます。図2cに見られるように、このようなドーム型システムからの強い散乱の特徴が依然として観察されています。これは、ドーム型システムからの強いミー散乱の兆候を示す数値調査によって裏付けられています。実際、波紋を無視すると、実効光路長の差を補正した場合 (つまり、\(\rho\) の係数 2 スケーリング)、ドームは完全な球とまったく同じ小刻みな構造を示すと予想されます。 L が増加すると、細長いドームが球と非常によく似た小刻みな構造を示し、より低い波数に向かって徐々にシフトすることが観察されます。

さらに、孤立したドームとドームアレイの散乱シグネチャに大きな違いは観察されません。 3D プリントされたサンプル (図 1) の測定値 (図 3a) は、散乱間の結合の影響が無視できることを示しています。ウィグル構造は実質的に変化しませんが、リップル構造にはわずかな違いが観察されます。我々は、この結論が数値シミュレーションと測定の両方に有効であることを実証しました。これらの結果は、参考文献 33 で報告されている球体アレイに関する結果と一致しています。

この論文は、これらのシステムでの散乱を修正するために使用されるモデルに重要な意味を持つ散乱問題のより良い理解に貢献します。赤外分光法では、ME-EMSC アルゴリズムは、生体細胞および組織のスペクトルからミー散乱シグネチャーを除去し、対応する純粋な吸光度スペクトルを取得するために使用される最先端の前処理方法です15。このアルゴリズムでは、球からの散乱に対するファンドハルスト近似に基づくメタモデルを使用して、測定された吸光度スペクトルの散乱特徴をモデル化します。この論文で報告された結果に基づいて、散乱体が完全な球であると仮定するモデルはドーム型およびセミカプセル型のシステムにも同様に適用できると結論付けます。これは理論的考察によって実証されており、ME-EMSC モデルの背後にある理論がドームおよびセミカプセルシステムに適用できることが証明されています。さらに、複数の球体とドームのシステム間の結合効果は無視できるため、ME-EMSC モデルはアレイ内の生体細胞にも適用できます。

吸光度スペクトルを報告する場合、赤外顕微鏡分光法における生体サンプルの照明方向 (つまり、上部照明と下部照明) は通常、文献では指定されていません。そして実際、光の相反定理35は、\(Q_{\textrm{ext}}\)に関する限り、照明方向を反転しても同じ結果が得られることを保証しています。ただし、\(Q_{\textrm{ext}}\) を決定するには、前方散乱光のみが赤外線検出器に記録される必要があります。しかし、現実的な検出器ではこれは達成できません。検出器の開口数 (NA) のせいで、散乱放射線は常に前方向の放射線と一緒に記録されるからです。散乱放射線は照明方向に依存するため、これは大きな問題です。したがって、現実的な検出器の場合、入射放射線の 2 つの共役方向 (たとえば、上部と下部の照明) に対して測定される吸光度は異なります。分光学者はこの問題を認識しておく必要があり、散乱補正アルゴリズムで適切に考慮する必要があります。これは将来の作業の重要な方向性になります。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、BioSpec Norway Community (https://doi.org/10.5281/zenodo.7228232) 内の Zenodo リポジトリで対応著者からのリクエストに応じて入手できます。

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この研究は、ノルウェー研究評議会の助成金「ハイパースペクトルイメージングデータの分析におけるスペクトル情報と画像情報の組み合わせ」番号 289518 によって支援されました。 AB は、微細構造のスライスに関する有意義な議論に対して Philippe Paliard (Microlight3D) に感謝します。 3D プリントされたサンプルの吸光度スペクトルの測定は、フランス国立シンクロトロン施設である SOLEIL (プロジェクト番号 20200795) によって支援されました。計算は、認可番号 NN9294K を通じてノルウェーのハイパフォーマンスコンピューティングおよびデータストレージのための国家インフラストラクチャである Sigma2 によって提供されたリソース上で実行されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Johanne Heitmann Solheim と Maren Anna Brandsrud

ノルウェー生命科学大学科学技術学部、1430、アース、ノルウェー

ヨハネ・ハイトマン・ソルハイム、マレン・アンナ・ブランドスラッド、ベイベイ・コング、スタイン・ロッシウス、アヒム・コーラー

ENS de Lyon の化学研究所、フランス国立科学研究センター (CNRS)、69364、リヨン、フランス

アコス・バニャシュ & ギョーム・ミクワン

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フェレンツ・ボロンディクス

薬学・生物工学部、がんセンター、ノース・ミッドランズ大学病院、キール大学、ストーク・オン・トレント、ST4 6QG、英国

ジョゼップ・スレ＝スソ

ウェスレアン大学物理学科、ミドルタウン、コネチカット州、米国

ラインホルト・ブリュメル

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JHS、MAB、AK は最初のアイデアを共同で開発しました。著者の JHS、MAB、RB、および AK がこの論文のコンセプトを開発しました。 RB と AK が研究を監督しました。 BKはRB、JHS、MABの支援を受けてシミュレーションを実行し、データを分析した 3DプリントはGMの支援を受けてABが実施した 3DプリントしたサンプルのFTIR測定はFBとABが実施した肺がんの測定cell は JSSJHS によって行われ、MAB と SL がこの論文の主著者であり、他の著者からの寄稿も受けました。

マレン・アンナ・ブランドスルッドへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Solheim, JH、Brandsrud, MA、Kong, B. 他生体細胞の赤外顕微分光法のモデルシステムとしてのドームとセミカプセル。 Sci Rep 13、3165 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-30130-z

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受信日: 2022 年 6 月 13 日

受理日: 2023 年 2 月 16 日

公開日: 2023 年 2 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30130-z

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