分裂酵母における染色体組み込みのためのベクターと株のセット

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9295 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

異種遺伝子の発現は酵母遺伝学における重要な技術です。分裂酵母では、leu1 遺伝子と ura4 遺伝子が主に異種発現の選択マーカーとして使用されています。遺伝子の異種発現に利用できる選択マーカーのレパートリーを拡大するために、ここで我々は、lys1 および arg3 を使用する新しい宿主ベクターシステムを開発しました。 CRISPR/Cas9 システムによるゲノム編集を利用することにより、ORF 領域に重大な変異を持つ lys1 と arg3 のいくつかの対立遺伝子を単離しました。並行して、各遺伝子座に組み込まれた場合にlys1およびarg3変異体のアミノ酸栄養要求性を補完するベクターのセットを開発しました。これらのベクターと、先に開発した組込みベクターpDUALを組み合わせて、異なる蛍光タンパク質と融合させることで、細胞内の3つのタンパク質の局在を同時に観察することに成功しました。したがって、これらのベクターは異種遺伝子の組み合わせ発現を可能にし、ますます多様化する実験課題に対処します。

酵母生物学の研究は、さまざまな生物学的現象の根底にある分子機構を解明するための洗練された実験システムの開発を刺激しました。最近では、これらの分子機構をより深く探求するために、複雑な実験系が必要となる場合があります。多くの場合、このような複雑な実験では、細胞内で複数の導入遺伝子を発現する必要があります。この目的のために、エピソーマルプラスミドまたは組み込みベクターとして使用できるいくつかのベクター、および構成的または誘導性プロモーターが開発されています1、2。生理学的環境と同様の条件を再現できる発現系が好ましいです。この意味で、組み込みベクターの使用は、エピソーマルベクターではなく、酵母生物学で使用される最先端のシステムの 1 つです3。

我々はこれまでに、単一交差組換えによる染色体組込みにも使用できる 2 種類のエピソーマルベクターを開発しました 4, 5。 1 種類のベクターは、lys1、arg1、または his3 遺伝子座のいずれかに組み込まれるように設計されています。これらのベクターが標的遺伝子座にうまく組み込まれると、形質転換体は対応するアミノ酸に対して栄養要求性になります。これらのベクターのメリットは、アミノ酸要求性を持たない株にも使用できることである。したがって、多くの場合、これらのベクターは新たな宿主株を作製することなく使用できる。しかし、ベクターをゲノムに組み込むとアミノ酸栄養要求性が生じるという事実が、場合によっては欠点となります。一方、pDUAL シリーズのベクターは、leu1 遺伝子座に組み込まれるように設計されています4。 leu1-32対立遺伝子を有する株のみに使用できますが、形質転換体はロイシンに対して原栄養性となるため、形質転換体の選抜が容易になります（図1）。 pDUAL ベクターが leu1 遺伝子の機能的コピーを含まないという事実により、プラスミドがゲノムにランダムに組み込まれる形質転換体の選択が回避されます。どちらのタイプのベクターにもそれぞれ長所と短所がありますが、適切な形質転換体の選択と維持の観点からは、pDUAL タイプのベクターの方が有用であると考えられます。

leu1-32 変異体のゲノムへの pDUAL の組み込み。 pDUALシリーズのベクターは、leu1のORF領域内に制限酵素認識部位を含むleu1遺伝子の一部を持っています。 leu1-32 対立遺伝子の変異点の下流で単一交差組換えが起こると、得られるゲノムには leu1 のコピーが 2 つ存在すると予想され、1 つは 3' 部分が欠失し、もう 1 つは完全長の機能遺伝子になります。回路図は縮尺通りではありません。

本論文では、pDUAL 型単一交叉組換えの戦略を考慮して、leu1 以外の遺伝子座を標的とした新しい宿主ベクター系の開発を試みた。分裂酵母で最近開発された CRISPR/Cas9 システムを使用して 6、我々は、lys1 または arg37、8 に重大なフレームシフト変異を持つ株の単離に成功しました。また、染色体への標的組み込み時にこれらの変異体のアミノ酸栄養要求性を補完できるベクターも構築しました。以前に開発された pDUAL ベクターと併用すると、薬剤耐性マーカーを使用せずに原栄養形質転換体で 3 つの導入遺伝子を発現できるようになりました。

この研究で使用した S. pombe 株は、野生型株 JY743 (h- leu1-32 ura4-D18) または AM324 (h+ leu1-32) に由来しました。野生型 JY3 (h90 原栄養株) のゲノム DNA を、プラスミド構築のための遺伝子断片の PCR 増幅に使用しました。形質転換体の培養には、完全培地YE(0.5%酵母エキス、2%グルコース、5μg/mlアデニン)および最少培地SDおよびEMM29を使用した。必要に応じて、ロイシン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、およびウラシルをそれぞれ最終濃度 50 μg/ml で使用しました。 EMM2 は、nmt1 プロモーターの制御下で蛍光タンパク質と融合した ORF の転写誘導にも使用されました 10。

分裂酵母を扱うための遺伝的方法は以前に記載されています9。 S.ポンベ細胞の形質転換についても記載されています11。 Ura+、Lys+、およびArg+形質転換体を、それぞれウラシル、リジン、およびアルギニンを欠くSD培地上で選択した。 lys1、arg1、および his1 の変異対立遺伝子を単離する場合、形質転換体は、それぞれロイシンおよびリジン、アルギニン、またはヒスチジンのいずれかを含む SD 培地で増殖しました。

アミノ酸生合成経路に関与する遺伝子に重大な変異を有する株の単離は、Zhang et al.12 によって報告されている CRISPR/Cas9 システムをわずかに変更して使用して実行されました。分裂酵母 CRISPR/Cas9 システム用のプラスミド pDB4280 (カタログ番号 98699) および pDB4282 (カタログ番号 98701) は、Addgene リポジトリから提供されました。シングルガイド RNA (sgRNA) の設計は、Web ベースのツール CRISPR4P13 を使用して行われました。このプログラムによって提案された標的部位のうち、各遺伝子について、各 ORF の 5' 末端に比較的近い位置にある 2 つの配列を選択しました。相同性アームは、Zhang et al.12 が示した 40 nt と比較して 30 nt に短縮されました。テンプレートベクター pDB4282 とアニーリングするための配列は、Zhang et al. によって示された 23 nt と比較して、20 nt に短縮されました。使用したプライマー配列は次のとおりです: his1-sgRNA1 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAACAAGTCCAGGTACCTGAGTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)、his1-sgRNA2 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAAGGTGAGACAATGCGTGCATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)、arg3-sgRNA1 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAATCATGATCTCTC) CGGTGACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)、arg3-sgRNA2 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAATCCATTCGTGATCTTAGTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)、lys1-sgRNA1 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAATTTAGCCAAAGTGTGCGATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)、および lys1-sgRNA2 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACC) GAAGAAATCCTCGTTAGTCGCATGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)。各プライマーを ura4-P75 プライマー (CATCTGGTGTGTACAAAATTG) と組み合わせて PCR に使用し、ura4 マーカー、ハンマーヘッドリボザイム配列、および sgRNA 足場配列の一部を含む pDB4282 の領域を増幅しました 12。 PCR 反応は 20 μl スケールで実行され、増幅が成功したことはアガロースゲル電気泳動によって確認されました。 PCR産物(2.5μl)を、NotIで消化し、エタノール沈殿により精製したpDB4280プラスミドとともに宿主株JY743の形質転換に直接使用した。 1 マイクログラムのサケ精子 DNA も形質転換に使用されました。形質転換体を、ロイシンおよびヒスチジン、アルギニンのいずれかを含むSDプレート上で増殖させ、マスタープレートを調製した。次いで、形質転換体のアミノ酸栄養要求性を、対応するアミノ酸を欠くSDプレート上にそれらを画線することによって確認した。

この研究で利用されたすべてのlys1およびarg3変異体は、ade6およびura4変異体との遺伝的交雑を介してlys1-K24またはarg3-R25変異体から得られた菌株とともに、日本の酵母遺伝資源センター(YGRC/NBRP)に寄託された。これらの株には、アクセッション ID FY47712～FY47734 が割り当てられています。

リジン栄養要求性対立遺伝子の配列分析を以下に記載するように行った。各候補のゲノムを用いて、sgRNA標的部位周辺の領域をPCRにより増幅した。 lys1-sgRNA#1およびlys1-sgRNA#2の標的部位周辺の増幅に使用したプライマーは、lys1-F-puc119 (CTCTAGAGGATCCCCTTGACACTCTCCGTTAC)およびlys1-R-puc119 (TCGAGCTCGGTACCCCACCGATAGGACCTGTAA)である。得られた PCR フラグメントを、ギャップ修復クローニング技術 14 によってベクター pUC119 にクローニングしました。 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems) を使用してインサート全体の配列を決定しました。

his1 と arg3 の変異対立遺伝子についても同様の方法で配列解析を行いました。使用したプライマーは次のとおりです: arg3 の場合は arg3-F-puc119 (CTCTAGAGGATCCCCGCAGTCTGAGAGAGAACTAG) および arg3-R-puc119 (TCGAGCTCGGTACCCGTCTTTAGAAGCCTGTGTC)。 his1 の場合は his1-F-puc119 (CTCTAGAGGATCCCCTGCATAGAGGGTCGTTT) および his1-R-puc119 (TCGAGCTCGGTACCCCGAGTGAATGCTGAGGA)。 PCR産物を、SmaIで消化した大腸菌ベクターpUC119にクローン化した。

ベクター pCLys1 を構築するために、nmt1 プロモーター 4 を含む pDUAL の leu1 フラグメントを、lys1 プロモーターを含む lys1 遺伝子の一部とその ORF の 5' 部分で置き換えました。この領域は、野生型S.ポンベ株JY3のゲノムDNAを使用するPCRによって増幅された。ＮｏｔＩの制限酵素認識部位は、ＰＣＲによって片側にＮｏｔＩ部位を含む２つのＰＣＲ断片を連結することによってこの領域内に生成された。使用したプライマーは次のとおりです: KpnI-Plys1-F3 (GGGATAACAGGGTAATATGGTACCGAGCTGTTTGGACATGTTATG) および NotI-lys1-R3 (AACTACATCAGCGGCCGCTCTCAATTCCATTCTTTACGAG)。 NotI-lys1-F4 (GGAATTGAGAGCGGCCGCCTGATGTAGTTATGGTTTATGC) および EcoRI-lys1-R4 (CGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGTCAGCTCCTTTTGAGACTG)。ベクターへの連鎖PCRフラグメントのクローニングは、In-Fusion HD Kit (TaKaRa Bio)を使用して行われました。

pCArg3ベクターの構築も同様の方法で行った。使用したプライマーは次のとおりです: KpnI-Parg3-F1 (GGGATAACAGGGTAATATACTAGTCGGTACCTGAGTTATCAATATAGTAACAC)、NotI-arg3-R1 (AACGTTATTGCGGCCGCATCACCTACCCATGCAAC)、NotI-arg3-F2 (GTAGGTGATGCGGCCGCAATAACGTTTTACATGATTTG)、および EcoRI-arg3-R 2 (TGTA) AAACGACGGCCAGTGAATTCAGCATTTTTAACAGCAACC)。

pCLys1 および pCArg3 の完全な配列は、それぞれ受託番号 LC745737 および LC745738 で DDBJ データベースに寄託されています。これらのプラスミドは、FYP5995 (pCLys1) および FYP5996 (pCArg3) のアクセッション番号とともに日本酵母遺伝資源センターにも寄託されており、ご要望に応じて入手可能です。

GFP または mCherry を含む pCLys1 および pCArg3 ベクターの構築は、以下に説明するように完了しました。まず、GFP または mCherry の ORF を pCLys1 と pCArg3 のそれぞれにクローニングしました。 GFP の増幅に使用したプライマーは次のとおりです:NheI-GFP-F (TTATAGTCGCTTTGTTAAAGCTAGCCTCGAGCCCGGGATGAGTAAAGGAGAAGAAC) および BamHI-GFP-R (GCTTATTTAGAAGTGGCGCGCCGGATCCCGGGTTTGTATAGTTCATCCATGCC)。 pDUAL-GFH14をPCRの鋳型として使用した。 GFP断片を増幅し、NheIとBamHIで消化したpCLys1またはpCArg3と混合し、大腸菌DH5α株のコンピテントセルに導入した。 mCherry も同様の方法で同じベクターにクローン化されました。 mCherry の増幅に使用したプライマーは、SmaI-mC-F (TTATAGTCGCTTTGTTAAAGCTAGCCTCGAGATGGTGAGCAAGGG) および SmaI-mC-R (ATTTAGAAGTGGCGCGCCGGATCCCGAGCTCGTCCATGCCGCCG) でした。増幅したmCherry断片をSmaIで消化したベクターと混合し、大腸菌に導入した。

GFP または mCherry と融合する ORF は、分裂酵母 ORFeome15 のエントリークローンコレクションから PCR によって増幅されました。増幅に使用したプライマーは、GFP 融合の場合は Ent-GFP-R (CCTTTACTCATCCCGGGCTCGAGGCTAGCAACTTTGTACAAGAAAAGCTGGGTA)、mCherry 融合の場合は Ent-mC-R2 (CGCCCTTTGCTCACCATCTCGAGGCTAGCAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTG) で、221_pREY_F (ACTTATAGTCGCTTTGTTAAAGCTAGCGATATCAAA) と組み合わせました。 AAAGCAGGCTCTCATATG) を上記 2 つのプライマーのパートナーとして使用します。増幅された各ORFを、ギャップ修復技術を介してGFPまたはmCherryを含むpCLys1またはpCArg3にクローニングしました。 YFPを有するpDUALベクター(pDUAL-YFH1c)へのORFのクローニングは、Gateway技術によって行われた。

CFP、GFP、YFP、mCherryの蛍光を一体型蛍光顕微鏡BZ-X700（KEYENCE）を用いて観察した。対物レンズはCFI Plan Apo λ 100XH（Nikon）を使用した。細胞をチアミンを含む YE または EMM2 プレート上で前培養し、その後 EMM2 プレート上に画線して、nmt1 プロモーターによって駆動される蛍光タンパク質融合タンパク質の発現を誘導しました。

ｐＤＵＡＬ型単一交差染色体組込みを可能にするためには、好ましくはアミノ酸またはヌクレオチド生合成経路で機能するタンパク質をコードする遺伝子に点突然変異を有する株が必要である。分裂酵母にはそのような栄養要求性変異体がいくつか存在します。しかし、それらのほとんどは変異点が特定されていないか、位置の観点から組み込みを介した相補には適していません。したがって、我々は、Zhang et al.12 によって最近報告されたクローニングフリーの方法に従って、CRISPR/Cas9 システムを使用して、そのような生合成経路変異体を単離しました。

分裂酵母遺伝学の分野では、leu1、ade6、ura4 が選択マーカーとして広く使用されています 16、17、18。 leu1 遺伝子は第 2 染色体の右腕に位置し、ade6 および ura4 は第 3 染色体に位置します。新しいマーカーと上記の 3 つの遺伝子座の間の遺伝的交配を容易に行うことができるように、第 1 染色体から組み込み遺伝子座を選択しました。その結果、lys1、arg3、his119の3つの遺伝子を標的遺伝子座として選択しました。次に、ウェブベースの sgRNA 予測プログラム CRISPR4P13 を使用して、これらの遺伝子のオープンリーディングフレームをターゲットとするシングルガイド RNA 配列を設計しました。 CRISPR4P が示唆する sgRNA 標的配列のうち、点変異が ORF の 5' 末端または 3' 末端のいずれかに近い位置に存在する対立遺伝子は、ORF の開始コドンの近傍にある 2 つの配列を選択しました。シングルクロスオーバー染色体組み込みに適しています。

我々は、sgRNA標的配列およびura4+の一部を含むPCR断片を、Cas9およびura4+12の5'部分を含む消化pDB4280とともにura4-D18変異体JY743に導入した。 Ura+ 形質転換体を検出した後、形質転換体のアミノ酸栄養要求性を確認しました。 his1 で観察された状況と同様に、sgRNA #1 と #2 の両方の形質転換から多くの Ura+ 形質転換体が得られました。しかし、アミノ酸栄養要求性を示した株は少数であり、これらの sgRNA が各部位を標的とするのに効果的ではないことが示唆されました。同じことが、lys1 sgRNA #1 形質転換体にも当てはまりました。逆に、lys1 sgRNA #2形質転換体の場合、lys1 sgRNA #1と比較して形質転換体の数が少ないにもかかわらず、多くの形質転換体がアミノ酸要求性を示した。 arg3 の場合、多くの栄養要求性形質転換体が 2 つの異なる sgRNA からも得られました。次に、ORF領域のPCR増幅後の配列決定により、標的遺伝子に変異が発生したかどうか、またどこで変異が発生したかを分析しました。その結果、lys1とarg3にはいくつかの変異が見つかりましたが、his1には変異が見つかりませんでした（図2a、b）。 his1 の状況と同様に、arg3 の ORF 領域に変異を持たないアルギニン栄養要求性変異体もいくつかありました。これは、CRISPR/Cas9 システムでよく議論されるように、オフターゲット効果によるものである可能性があります。見つかった変異のほとんどは一塩基の欠失または挿入であり、それらはすべて sgRNA ターゲットとして使用された配列内でのみ発生しました。

この研究で分離された栄養要求性変異体の変異。 (a) リジンおよび (b) アルギニン栄養要求性変異体のすべての変異は、sgRNA の標的となる領域で見つかりました。 sgRNA 標的配列の周囲のヌクレオチド配列が示され、その下にアミノ酸配列が読み取り枠に関連して示されます。各 ORF の最初のヌクレオチドの数は 1 に設定されます。sgRNA のターゲット配列には下線が付けられています。挿入されたヌクレオチドは小文字で示されています。ハイフンは欠失したヌクレオチドを示します。アスタリスクは終止コドンを示します。デフォルト配列に対するアミノ酸の変更は斜体で示されています。 (c) arg3-R25 対立遺伝子のヌクレオチド配列とアミノ酸配列。挿入されたヌクレオチド配列を太字で示す。 arg3-R25 対立遺伝子から発現されるタンパク質の予想されるアミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示します。

これらの変異体のうち、arg3-R25 対立遺伝子には 262 ヌクレオチドの挿入部分が含まれています (図 2c)。この結果と一致して、arg3-R25株のゲノムを鋳型として使用した場合、この遺伝子座のPCR増幅によってより長い産物が得られた。この配列の BLASTN 検索により、チヌークサーモンまたはキングサーモンとして知られる Oncorhynchus tshawytscha のゲノムの一部と完全に一致することが明らかになりました。この結果は、以前に報告されたように、262 bp の配列が酵母細胞の形質転換に使用されたサケ精子 DNA に由来することを強く示唆しています 20。私たちが使用したサケ精子 DNA はサケ種 Oncorhynchus keta に由来しますが、利用可能な O. keta データセット内の 262 bp 配列に一致する配列は見つかりませんでした。したがって、我々はこの配列を O. keta ゲノムの一部として DDBJ データベースに登録しました (アクセッション番号 LC764838)。長い断片の挿入は、突然変異の遺伝子変換に基づく補完を回避するプラスミドの染色体組み込みに有利であるため 21、組み込みベクターの標的として機能する arg3-R25 対立遺伝子を選択しました。 lys1の場合、lys1 ORFの先頭から268番目のヌクレオチドにアデニンが欠失しているlys1-K24対立遺伝子を選択し、その結果、この変異部位のすぐ下流に終止コドンが生成されました（図2a）。。

変異体の単離と並行して、染色体組み込みのためのベクターを設計および構築しました。 lys1遺伝子座に組み込むことができるpCLys1という名前のベクター（図3a）を構築するために、プロモーターとlys1 ORFの5'部分を含むゲノム領域を増幅し、pDUALベクターのleu1領域をそれらで置き換えました。 lys1 ORF の 30% 未満しかクローン化されなかったため、クローン化された lys1 フラグメントは機能しないことが予想されました。この短いlys1フラグメントは、まず野生型ゲノムからPCRによって2つの部分として増幅され、次にそれらの間のNotI認識部位と融合されました。したがって、クローン化された部分遺伝子は、NotI 消化によって ORF 領域で 2 つに分割される可能性があります。 NotI 部位は、lys1-K24 対立遺伝子の変異点の約 700 bp 下流に作成されました。 NotI消化によって直線化されたpCLys1ベクターがlys1-K24変異を有するlys1遺伝子座に組み込まれると、機能的なlys1遺伝子が生成され、形質転換体はリジン原栄養性であると予想される（図4a）。

この研究で開発されたベクター。 pCLys1 (a) および pCArg3 (b) の構造。選択マーカーは、プロモーターと、lys1 (pCLys1) または arg3 (pCArg3) のいずれかの ORF の一部で構成されます。どちらのベクターも、異種遺伝子発現用に nmt1 プロモーターと ADH1 ターミネーターを備えています。マルチクローニングサイトには、NheI、XhoI、SmaI、BamHI、および AscI の認識配列が含まれています。矢印は、プラスミドの線状化のための NotI 部位を示します。回路図は縮尺通りではありません。

ゲノムへのベクターの統合をまとめた概念図。 pCLys1 (a) および pCArg3 (b) の染色体への組み込みが示されています。アスタリスクは、lys1-K24 対立遺伝子の変異点を示します。斜線のボックスは、arg3 の ORF 内に挿入された 262 bp フラグメントを示します。ベクターバックボーンの長さは正確な縮尺ではありません。

また、同様のプロセスを通じて arg3 遺伝子座に組み込むための pCArg3 ベクターも構築しました (図 3b)。 lys1 の場合と同様に、pCArg3 ベクターにクローン化された部分 arg3 フラグメントは、機能しないことが予想されました。クローン化されたフラグメントの末端が、arg3 sgRNA #1 形質転換によって得られた対立遺伝子の変異点の上流にまだあったためです。

次に、新しく開発したベクターが予想どおりに標的遺伝子座に組み込まれるかどうかを調べました（図4a、b）。 lys1-K24 または arg3-R25 対立遺伝子を有する株をそれぞれ pCLys1 または pCArg3 で形質転換すると、原栄養性形質転換体が得られます。酵母細胞の形質転換の前に、これらのプラスミドを NotI で線状化しました。対照として、プラスミドを栄養要求性変異体に直接導入して、組み込みに線形化が必要かどうかを調べました。

プラスミドまたはその消化断片を栄養要求性変異体に導入した後、lys1-K24およびarg3-R25の両方の消化断片で形質転換した株からのみ大きなコロニーが現れました（図5a）。未消化のプラスミドで形質転換した菌株からは小さなコロニーが出現したが、拡大はしなかった。この研究で開発したベクターを使用して特定の遺伝子を発現できるかどうかを確認するために、代表として緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするORFをpCLys1およびpCArg3にクローニングしました。これらのプラスミドを染色体に組み込み、アミノ酸要求性を持たない形質転換体をいくつかピックアップしました。 EMM2プレート上に形質転換体を画線した後にGFP蛍光をチェックしたところ、核内にわずかに蓄積しながら細胞全体に分散したシグナルが観察されました。これは、分裂酵母における遊離GFPタンパク質の局在と一致しています（図5b）22。消化された断片が標的遺伝子座にうまく組み込まれたことを確認するために、コロニー PCR によって原栄養性形質転換体のゲノム構造を調べました。この分析により、pCLys1-GFPまたはpCArg3-GFPに由来するすべてのフラグメントが、GFP蛍光が検出された場合にのみ予想どおり各標的遺伝子座に組み込まれることが実証されました（図5c）。

異種遺伝子発現用に新しく開発されたベクターの紹介。 (a) 本研究で開発した線状プラスミドの導入後に出現した形質転換体。 AM595 (h-leu1-32 lys1-K24) 株と AM597 (h-leu1-32 arg3-R25) 株を、NotI 前処理ありまたはなしで pCLys1 または pCArg3 で形質転換し、リジンとアルギニンを欠く SD 選択培地にプレーティングしました。 (b) pCLys1とpCArg3を用いて導入したGFPの発現。 lys1-K24 または arg3-R25 株への線状化 pCLys1-GFP および pCArg3-GFP の導入後に出現した形質転換体を検出し、GFP 蛍光を蛍光顕微鏡下でモニタリングしました。 (c) PCR による染色体組み込みの確認。 pCLys1-GFPまたはpCArg3-GFPの染色体への組み込みは、矢印で示されたプライマーを使用するPCRによって分析されました。形質転換体#1および#2はGFPの蛍光が観察される株であったが、形質転換体#3は蛍光を示さなかった。 EcoT14Iで消化したラムダDNAをサイズマーカーとして使用しました。 (d) 細胞内での 3 つのタンパク質の同時発現。 uvi15-CFP、gpi16-YFP、gar2-mCherryをそれぞれ発現するpCLys1、pCArg3、pDUALで形質転換した細胞を蛍光顕微鏡で観察しました。スケールバーは 10 μm を示します。

最後に、今回開発したベクターと先に開発した pDUAL ベクターを組み合わせて 3 つの遺伝子を同時に発現できるかどうかを検討しました。それらの発現を検出するために、CFP、YFP、および mCherry の 3 つの蛍光タンパク質を使用しました。我々は、局在データアーカイブから明確な細胞内局在を示すいくつかのタンパク質を同定しました15。細胞先端と隔壁に局在する核小体タンパク質Gar2、ERタンパク質Gpi16、Uvi15を選択し、それぞれCFP（pCLys1）、YFP（pDUAL）、mCherry（pCArg3）の上流にそれらのORFをクローニングしました。これらの融合遺伝子は、nmt1 プロモーターの制御下で発現されました。これらのプラスミドをarg3-R25、lys1-K24、leu1-32対立遺伝子を持つ株の染色体に順次組み込み、アミノ酸要求性を示さない形質転換体をいくつかピックアップした。また、3 つのプラスミド断片すべてで細胞を形質転換することも試みました。しかし、この条件では形質転換体を得ることができませんでした。さらに、3 つのプラスミドのうち 2 つを使用した場合でも、得られた形質転換体の数はほとんど無視できるほどでした。 EMM2プレート上で形質転換体を培養してnmt1プロモーターを活性化した後、蛍光を確認したところ、すべての融合タンパク質からの明確なシグナルが観察されました（図5d）。予想通り、Uvi15 は細胞先端または隔壁への一定の局在を示しましたが、Gpi16 は ER 様の膜状構造で視覚化されました。核小体タンパク質 Gar2 の強いシグナルが核内の特定の区画で観察されました。したがって、我々は、新しく開発された組み込みベクターを使用して、3 つの異なる導入遺伝子の導入と発現が可能であることを実証しました。

我々は、lys1 または arg3 遺伝子座のいずれかからの遺伝子の異種発現に使用できる 2 セットの分裂酵母宿主ベクターシステムを開発しました。これらのベクターを使用して、開発したベクターが標的遺伝子座に適切に組み込まれ、原栄養性形質転換体が生成されることを実証しました。さらに、ベクターにクローニングされた GFP が染色体組み込み後に予想どおりに発現されることを実証しました。このタイプの組み込みにより、統合フラグメントの両側に重複配列が生成され 1、以前に指摘したように、統合フラグメントの欠失につながるさらなる組換えのための相同領域として機能する可能性があります 3。この問題を克服するために、二重交差組換えを利用して反復ゲノム領域を生成しない組み込みベクターが開発されました3。このような安定した代替物は長期研究に適していますが、形質転換効率が比較的低くなります。一方、シングルクロスオーバー組み込みベクターは、従来のプラスミド導入によって得られるものと同様の高い形質転換効率を示し、さらなる組換えを引き起こすリスクはわずかですら許容します。このような性質から、シングルクロスオーバーベクターは、プラスミドライブラリーを用いたスクリーニングなど、高い形質転換効率が要求される定性的・定量的実験に適していると考えられます。実際、本研究で開発したベクターおよびpDUALから得られた形質転換体は、対応するアミノ酸を欠く培地で維持することができ、形質転換体に容易に選択圧をかけることができます。

CRISPR/Cas9 システムの利用に関連する大きな懸念の 1 つは、意図した標的以外のゲノム位置への意図しない突然変異の導入を伴うオフターゲット効果の可能性です。私たちの研究では、おそらくオフターゲット効果の結果として、標的のマーカー遺伝子を保持しているいくつかの栄養要求性株に遭遇しました。さらに、我々は、arg3 ORF へのサケ DNA フラグメントの予期せぬ組み込みを観察しました。 CRISPR/Cas9 システムを使用する場合、宿主生物のゲノムへの外因性 DNA の不注意な組み込みは、さらなる潜在的な問題を表します。これまでの研究では、分裂酵母のゲノムへのサケ DNA 断片の挿入が報告されており 20、同様の現象が他の生物でも記録されている 23、24。したがって、CRISPR/Cas9 はゲノム編集の大きな可能性を秘めているものの、その可能性を慎重に検討することが不可欠である。 -ターゲット効果と意図しない挿入。 arg3-R25 対立遺伝子を取得するプロセスは予想外でしたが、arg3 ORF の 5' 領域での外来 DNA の挿入は、この実験系にとって非常に有利です。これは、挿入により、挿入点の下流の組換え領域に選択圧力がかかるためであり、アルギニン栄養要求性を受ける適切な組み込み体を取得するのに理想的です（図4b）。したがって、我々は、pCArg3 シリーズベクターを使用して arg3 を標的とするのに最も適した対立遺伝子として arg3-R25 を選択しました。

分裂酵母の研究では、主に leu1+ と ura4+ が選択マーカーとして使用されてきました 1。宿主で最も一般的に使用される leu1 対立遺伝子は leu1-32 で、leu1 ORF4 にミスセンス変異があります。一方、宿主株で使用される最も一般的な ura4 マーカーは、完全欠失 ura4-D1818 です。したがって、ura4-D18 は単一クロスオーバー組み換えには使用できません。他の選択マーカー遺伝子を使用するベクターは徐々に開発されていますが、導入遺伝子の染色体組み込みの選択肢はまだ限られています。この研究で開発されたベクターは、これまでに報告されたマーカーのほとんどと組み合わせて、染色体からの異種遺伝子発現のための貴重な選択肢として機能します。これに関連して、これらのベクターは、複数の導入遺伝子の発現を必要とする実験に大きく貢献します。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

ポリメラーゼ連鎖反応

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シングルガイドRNA

緑色蛍光タンパク質

シアン蛍光タンパク質

黄色蛍光タンパク質

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この研究は、JSPS 科研費補助金番号 15K14925 および 22K05361 の一部によって支援されました。

理化学研究所環境資源科学研究センターケミカルゲノミクス研究グループ〒351-0198 埼玉県和光市広沢2-1

Akihisa Matsuyama, Atsushi Hashimoto & Minoru Yoshida

〒113-8657 東京大学大学院農学生命科学研究科生命工学専攻微生物学研究室

Akihisa Matsuyama, Shinichi Nishimura & Minoru Yoshida

東京大学革新微生物学共同研究部門、〒113-8657 東京

Shinichi Nishimura & Minoru Yoshida

広島大学大学院統合生命科学研究科、〒739-8528 東広島市

Shinichi Nishimura

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この研究は AM と MY によって概念化されました。すべての実験は AM によって行われ、AHAM が原案を作成しました。 SN と MY が原稿を編集しました。著者全員が原稿をレビューしました。

松山彰久さんへの対応です。

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転載と許可

松山明、橋本明、西村晋他分裂酵母における染色体組み込みのためのベクターと株のセット。 Sci Rep 13、9295 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36267-1

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受信日: 2023 年 2 月 3 日

受理日: 2023 年 5 月 31 日

公開日: 2023 年 6 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36267-1

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