現場で

Communications Biology volume 6、記事番号: 508 (2023) この記事を引用

702 アクセス

18 オルトメトリック

メトリクスの詳細

アデノ随伴ウイルス（AAV）は、生体内遺伝子導入のための強力なベクターであり、皮膚潰瘍などの AAV の局所治療への応用が期待されています。 遺伝子発現の局在化は、遺伝子治療の安全性と効率にとって重要です。 私たちは、担体としてポリ（エチレングリコール）（PEG）を使用して生体材料を設計することにより、遺伝子発現を局在化できるのではないかと仮説を立てました。 今回我々は、マウス皮膚潰瘍モデルを用いて、設計されたPEGキャリアの1つが、潰瘍表面の遺伝子発現を効果的に局所化し、遠方のオフターゲット効果を評価するための代表的な臓器である皮膚深層および肝臓でのオフターゲット効果を低減したことを示す。 。 溶解ダイナミクスにより、AAV 遺伝子導入の局在化が生じました。 設計された PEG キャリアは、AAV を使用した in vivo 遺伝子治療、特に局所発現に有用である可能性があります。

アデノ随伴ウイルス (AAV) は、in vivo 遺伝子導入のための強力なベクターです。 AAV は、リポタンパク質リパーゼ欠損症、脊髄性筋萎縮症、網膜ジストロフィー、血友病などの症状を治療するための補充療法として臨床的に使用されています1。 最近、AAV の応用可能性は、局所的な疾患を含むように拡張されました 2。

製造方法の改善の結果、臨床試験で使用される AAV の平均用量は増加しています。 これにより、より高い用量の使用が可能になり、より強い表現型が得られます。 ただし、AAV ベクターのほとんどは最終的に肝臓に到達し、肝臓やその他の場所で毒性を引き起こす可能性があります 3。 したがって、遺伝子発現の特異性を制御すること、つまりオフターゲット効果を最小限に抑えることは、AVV を使用した治療法の開発において非常に重要です。 現在まで、特異性は、AAV カプシド組織/細胞指向性 4、組織特異的プロモーターの使用 5、6、および投与経路 3 の選択と操作によって制御されてきました。

褥瘡、糖尿病性潰瘍、または末梢血管不全に起因する創傷などの治癒しない創傷は、高齢化が進む社会において懸念されており、AAV ベースの in vivo 遺伝子導入は有用な治療法であると期待されています 7,8。 最近、我々は、AAVを介した創傷常在間葉細胞の上皮細胞への再プログラミングのin vivo誘導により、潰瘍表面からの新規上皮化が可能になることを実証した。 これらの結果は、革新的な治療法の将来の開発のための原理の最初の証明を構成しました9、10。

皮膚潰瘍の表面での AAV を介した遺伝子導入の安全性を向上させることができる臨床的に適用可能な方法の探索において、我々は、ポリ（エチレン グリコール）を使用して、潰瘍の表面で AAV を制御放出するための材料 11 の開発を調査しました。 PEG）をキャリアとして使用します。 PEG は、その生体不活性な性質により生体材料に広く使用されており、薬物やウイルスを小胞やヒドロゲルにカプセル化または固定化することでキャリアとして機能します 12、13。 所望の部位に最小限の侵襲で投与できる注射可能なヒドロゲルシステムは、高粘度のマトリックスから低粘度の液体に変化できるため、制御されたウイルス送達としてますます注目を集めています14,15。 しかし、低粘度の液体ヒドロゲルの注射は、カプセル化されたウイルスの拡散、つまり注射部位からの急激な放出を引き起こす可能性があり、局所的なウイルス感染の治療を損なう可能性があります。

我々は、適切な分解性を備えた PEG 担体にカプセル化された AAV が皮膚潰瘍の表面で局所的に放出されるのではないかと仮説を立てました。 我々は、局所的または遠隔のオフターゲット効果を低減しながら、潰瘍表面への遺伝子導入の特異性を高める、動的に架橋されたポリマーネットワークからなるPEGキャリア（以下、PEGスライムと呼ぶ）を設計した。 高粘度のPEGスライムの使用は、高度に局所的な遺伝子導入のための新しい方法を実証します。

異なる架橋と細孔サイズを持つ AAV の可能なキャリアとして 3 種類の PEG マトリックスを準備しました。 すべての PEG は同様のプロトコルによって形成されました。 つまり、相互に架橋可能な四官能性PEGを溶解し、等量の同じ濃度のPEG前駆体を混合します（図1a）。 （1）PEGヒドロゲル16（図1b）：人工細胞外マトリックスとして機能する合成ヒドロゲルは、プロピルアミン末端テトラアームPEG（テトラ-PEG-PA）とスクシンイミジルグルタル酸末端テトラアームPEG（テトラ-PEG-GS) はアミド結合を介しており、テトラ-PEG-GS のエステル結合によりヒドロゲルは加水分解可能になります。 (2) PEG スポンジ 17 (図 1c): 前駆体溶液に硫酸カリウムを添加することによって相分離構造が達成された多孔質 PEG ハイドロゲル。 （3）PEGスライム18（図1d）：D（+）-グルコノ-1,5-ラクトン末端テトラアームPEG（テトラ-PEG-GDL）と4-カルボキシ-3-を混合して調製した粘弾性ポリマー液体フルオロフェニルボロン酸末端テトラアーム PEG (テトラ-PEG-FPBA) は、環状エステル結合を介して可逆的で変動する架橋を形成します。

a PEG担体を使用した皮膚潰瘍表面へのAAV投与のin situプロセスを示す概略図。 相互に架橋可能な基で官能化され、AAV を含む PB に溶解された Tetra-PEG を等量で混合すると、AAV をカプセル化する PEG キャリアが形成されました。 調製したPEG担体をマウスの背中の皮膚潰瘍表面に投与すると、PEG担体の溶解によりAAVが拡散した。 b – d PEG キャリアの調製。 テトラ-PEG-PAおよびテトラ-PEG-GSを使用して調製されたPEGヒドロゲル(b)、相分離構造を作成するためにPB中の硫酸カリウムが添加されたことを除き、PEGヒドロゲルと同じ前駆体を使用して調製されたPEGスポンジ(c)。 PEG スライム (d) は、テトラ-PEG-GDL とテトラ-PEG-FPBA から調製され、動的架橋システムが得られました。 e PEGヒドロゲル、PEGスポンジ、およびPEGスライムの写真。握られたときの粘弾性挙動を示しています。 スケールバーは 5 mm を表します。 f PEGヒドロゲル(紫色の三角形)、PEGスポンジ(オレンジ色の菱形)、およびPEGスライム(青色の四角形)の時間(t)の関数としてのヤング率(E)。 E(t) は 0 秒の E によって正規化されました [E(0)]。 g 調製したままの状態のPEG担体の写真および共焦点レーザー走査型顕微鏡画像。 スケールバーは 100 μm を表します。

合成プロトコールの類似性にもかかわらず、これらの PEG キャリアは異なる特性と構造を持っていました。 機械的特性の違いは、圧縮下で肉眼的に観察されました。PEG ハイドロゲルとスポンジは完全に弾性変形を示しましたが、PEG スライムは時間の経過とともに元の形状が徐々に失われていきました。 肉眼的に観察すると、球形に調製されたPEGスライムは、ピンセットで掴んだとき、掴んだ直後のヒドロゲルと同様に、その形状を維持することができた。 しかし、掴んだスライムはその後ピンセットから粘度の高い液体として落ち、最終的にはテーブル上で平らな形状になりました（図1e）。 次に、その差は、キャリアに圧縮を加えた後のヤング率 [E(t)] の時間依存性を観察する応力緩和試験によって定量化されました。 時間の経過とともに、E(t)値はPEGスライムでは大幅に減少し、水の抽出によりPEGスポンジではわずかに減少しましたが、PEGヒドロゲルでは一定でした（図1f）。 光退色後の蛍光回復（FRAP）測定（補足図1）は、PEGスライムの蛍光強度が回復したことを示し、応力緩和がGDLとFPBAの間の動的共有結合に由来することを示しました。 PEG スライムの蛍光強度は光退色後約 60 秒で完全に回復しましたが、PEG ハイドロゲルの蛍光強度は変化しませんでした。 これにより、PEG スライムの構成分子の並進運動とこれらの分子間の動的架橋が確認されました。 赤色蛍光標識されたPEG前駆体（PEG前駆体の末端部分は前述のように赤色蛍光色素で部分的に修飾されています17）を使用して調製されたPEGキャリアの顕微鏡観察は、キャリア間の構造の違いを示しました。 PEGスポンジには、孔径10μm程度の黒い空洞が画像中に点在する海島構造が観察された。 PEGヒドロゲルとスライムでは、特徴的な構造は観察されず、ネットワークサイズがnmのオーダーであることを示唆しています（図1g）。 無機塩の添加により相分離が誘発され、PEG の溶解度が低下し、不透明なヒドロゲルが得られました。 ゲル化プロセス中に、PEG 前駆体が互いに結合して分子量が増加し、これにより相分離が促進されます 17。 塩濃度は、元の前駆体溶液ではなく、ゲル化中に相分離を引き起こすように選択されました 17。

PEG担体の物理的特性の違いを詳細に調べるために、in vitro比較分析を実行しました。 溶解速度論の理解を容易にするために、実験モデルが設計されました。 赤色蛍光標識PEG担体を、8.0μmの孔径を有する培養インサート上に調製した（すなわち、より小さな物質が通過できる）（図2a）。 PEG スライムの詳細な評価のために、標準的な PEG スライムと比較してより速く溶解するように設計された PEG スライム (PEG ソフトスライムと呼ばれます) を準備しました。 所定の時間間隔でインサートを通過した溶出サンプルの蛍光強度を測定することによって計算された溶解率は、各足場ごとに徐々に増加し、24時間での溶解率（Dサンプル）は、Dヒドロゲル = 19％、Dスポンジ = 16％でした。 、Dslime = 86%、Dsoft-slime = 90% (図 2b)。 さらに、AAVと同様の直径を有するモデル材料として直径30 nmの蛍光シリカナノ粒子をカプセル化し、PEG担体からの蛍光シリカナノ粒子の放出プロファイルを調査した。 各担体に封入された粒子の放出挙動は溶解挙動と同様の傾向を示し、24 時間後の放出率 (Rsample) は、Rヒドロゲル = 38%、Rスポンジ = 33%、Rスライム = 75%、および Rsoft-スライム = 92%。これは、ナノ粒子の放出がキャリアの溶解によって支配されていることを示しています (図 2b)。 溶解速度対放出速度のプロット（図２ｃ）は、ＰＥＧスライムについては直線であった。 この強い相関関係は、粒子の放出がPEGスライムの溶解によって支配されることを実証した。 この結果は、PEG スライムが擬似固体であり、粒子の拡散が非常に制限されているが、積荷は液体の形態から溶液に溶出できることを示しました。

a in vitro 溶解評価を示す概略図。 写真はインサートの上面図です。 スケールバーは 5 mm を表します。 b aで調製したPEGヒドロゲル（紫色の三角）、PEGスポンジ（オレンジ色の菱形）、PEGスライム（青色の四角）、およびPEGソフトスライム（赤色の丸）の溶解（白抜きの記号）および放出（黒塗りの記号）速度の時間評価。培養インサートを培養プレート上に置きます。 c 溶解速度と放出速度の関係。

注目すべきことに、PEG スライムの放出速度は 7 時間ほぼ一定でした。 つまり、理想的なゼロ次放出速度が達成されました。 この結果は、粒子の放出を決定する溶出が膜を通してのみ発生するため、ゼロ次として近似されたためです。 対照的に、PEGヒドロゲルおよびスポンジからの粒子の放出は、高放出速度領域と相関しなかった。 この結果は、これらのキャリアが固体であり、粒子が主に拡散によって放出されたためです。

創傷の治療には、潰瘍の表面に高度に特異的な遺伝子導入法が好まれます。 皮膚潰瘍の治療のための AAV による遺伝子導入に対する PEG キャリアの効果を調べるために、大きな皮膚潰瘍の中心部分を模擬した分離された皮膚潰瘍が使用されました 10。 マウスの背中から皮膚を外科的に切除して潰瘍を形成し、深筋膜に縫合したシリコンチャンバーを使用して周囲の皮膚から生じた傷を隔離しました19、20（補足図2a）。 チャンバーを用いて創傷を周囲の皮膚から隔離することで、上皮化や創傷の収縮など、周囲の皮膚の干渉を受けることなく潰瘍表面の現象を研究することができます。 GFPNLS-AAVDJ [核局在シグナル (NLS) を持つ緑色蛍光タンパク質 (GFP) をコードする皮膚潰瘍の細胞に最適化された AAV の一種 10] を PEG キャリアと混合し、潰瘍に接種しました。 パーセンタイルではなく陽性細胞の数を採用したのは、辺縁が定義されていない不均一な種類の細胞からなる皮膚潰瘍組織の組織学的分析には前者の方が適切であると考えたためです。 PBS中でウイルスのさまざまな力価をテストし（補足図2b）、蛍光顕微鏡で潰瘍表面を経時的に（13日目まで）（補足図2c）観察し、1010遺伝子コピーの投与後72時間の潰瘍を観察しました（補足図2c）。ウイルスの GC) を定量分析用に選択しました (図 3a)。 蛍光実体鏡による潰瘍表面の観察により、PEGハイドロゲルまたはPEGスポンジよりも、PEGスライム、PEGソフトスライム、またはリン酸緩衝食塩水（PBS）にカプセル化されたAAVで処置された動物においてGFPNLS陽性細胞がより頻繁に観察されることが示された。 (図3b、c)。

a PEGキャリアにカプセル化されたGFPNLS-AAVDJ（AAV-DJ血清型、マウスあたり1×1010 GC）を、マウスの背中に取り付けられた直径1 cmのシリコンチャンバー内に作成された未処理の表面に投与します。 b 実体顕微鏡下で観察された、投与から 72 時間後のマウス背中の皮膚潰瘍上の代表的な GFP 陽性細胞。 バー = 2 mm。 c AAVを含む各キャリアの投与から72時間後の、表面に発現したGFP陽性細胞の数。 重ねられたドット プロットは、データの分布を示します。 他のPEGキャリアと比較して、PEGスライムまたはソフトスライムでは、有意に多くの表層GFP陽性細胞が観察されました。 PEG スライムまたはソフトスライムと PBS の間に有意差は検出されませんでした。 * < 0.05、** < 0.01 (n = 3)。 d PEGスライムおよびPBS製剤の投与72時間後のAAV-GFPNLS感染を示す代表的なスライス。 AAV-GFPNLSをPBSとともに投与した場合には、深層に多くのGFP陽性細胞が観察されたのに対し、PEGスライムを投与した場合には、ほとんどのGFP陽性細胞が表層に観察された。 点線は表層と深層の間のマージンを示します。 バー = 500 μm。 e 各動物の表層（皮下組織より上）および深層（筋肉組織まで）のGFP陽性細胞の数。 重ねられたドット プロットは、データの分布を示します。 PEGスライムは深部組織感染を大幅に防止しましたが、表層のGFP陽性細胞の数には製剤間で有意な差がなかったことに注意してください。 * < 0.05 (n = 5)。

PEGヒドロゲルおよびPEGスポンジのカプセル化は皮膚潰瘍表面での遺伝子導入効率を低下させましたが、PEGスライムのカプセル化はPBSで観察されたように元の導入効率を保持しました。 PEG スライムは、皮膚潰瘍の表層における遺伝子導入特異性に重点を置いたさらなる組織学的評価に使用されました。 PEGスライム、PEGソフトスライム、およびPBSを配合したGFPNLS-AAVDJで治療した潰瘍を調製し、表層（肉芽および脂肪組織）および深層（筋膜および筋肉）におけるGFPNLS陽性細胞の数を組織学的に分析した（図） .3dおよび補足図2a)。 立体視評価の結果と一致して、PEG スライム、PEG ソフトスライム、または PBS で処理した動物の表層の陽性細胞の数に有意差は見つかりませんでした。 対照的に、深層の GFPNLS 陽性細胞の数は、PEG スライム処理動物では PBS 処理マウスと比較して有意に減少し、その減少の程度は PEG スライム処理動物の方が PEG マウスと比較して大きかった。ソフトスライムで処理したマウス（図3e）。 遺伝子導入の多重度という観点から遺伝子導入効率の違いをさらに調べるために、2 つの異なる蛍光色の AAV (GFPNLS-AAVDJ および mCherryNLS-AAVDJ) の混合物を潰瘍の表面に投与し、重複遺伝子の頻度を調べました。変換が測定されました（補足図3a）。 重複した遺伝子導入の数はPBSとPEGスライム間で一致しており、遺伝子導入の多重度の点でPEGスライムとPBSで処理したマウスに有意な差がないことをさらに示しています（補足図3b）。 PEG スライムキャリアの使用により、他のキャリアと比較して遺伝子導入の局所的な層特異的効率が向上したため、このキャリアの遠隔オフターゲット効果をさらに調査しました。

AAV 細胞の指向性は血清型によって異なるため、遠隔オフターゲットとしての各臓器の重要性は血清型によって異なります。 以前、我々はルシフェラーゼ-AAVDJ の注射後のさまざまな臓器組織における AAVDJ の分布を評価し、ルシフェラーゼの発現が主に肝臓に限定されていることがわかりました 10。 PEG スライムのカプセル化の考えられる影響を調査するために、皮膚チャンバー内の PEG スライム キャリア (PBS) に含まれる AAVDJ ベクターを潰瘍に接種してから 28 日後に、肝臓におけるオフターゲット GFPNLS 発現を評価しました。 少数の GFPNLS 陽性細胞が、立体視鏡を使用して肝臓の表面に観察されました (図 4a)。 肝臓におけるAAV力価のqPCRを用いた定量的比較は、ゲノムコピーがPBSと比較してPEGスライムキャリアの使用により有意に減少することを示した(図4b)。 したがって、PEG スライムキャリアの使用は、遠方のオフターゲット効果を低減する可能性があります。

PEGスライムにカプセル化された、またはPBSで希釈されたGFPNLS-AAVDJ（AAV-DJ血清型、マウス1匹あたり5×1010 GC）を、マウスの背中に作成された未処理の表面に投与しました。 4 週間後、qPCR 評価を含む定量分析のために肝臓を採取しました。 統計分析するには GFP 陽性細胞が不十分でした。 黒矢印は、実体視鏡を使用して肝臓内で観察された GFP 陽性細胞を示します。 黒と白のバー = 5 mm、赤のバー = 500 μm。 b AAV 感染率を評価するために、採取した各肝臓の 6 つの葉からゲノム DNA を抽出しました。 AAV力価はスライム群で有意に減少した。 (n = 7) * <0.05。

一連の in vivo 実験を通じて、PEG スライムは表面特異的な AAV 遺伝子導入に有用なキャリアである一方、PEG スポンジおよび PEG ハイドロゲルキャリアは PBS と比較して遺伝子導入効率を低下させることが判明しました。 我々は、これらの違いは、上記のインビトロ評価で決定されたPEGスライムの放出プロファイルに関連していると考えています。 PEGスライムに特有の考えられる機構的特性を解明するために、蛍光標識されたAAV21、22、23を追跡しましたが、バックグラウンドシグナルに比べて蛍光シグナルが弱いため、信頼性の高い検出が困難であることがわかりました（補足図4a〜c）。 代わりに、皮膚潰瘍の表面におけるシリカナノ粒子の挙動が研究されました。 最初の試験では、PBS 中の緑色蛍光シリカ ナノ粒子 (AAVs24 と同様の直径 30 nm) を接種しました。 ナノ粒子は最初は表層に局在し、時間の経過とともに脂肪組織や筋肉組織などの深層に拡散しました。 重要なことに、24時間の時点で潰瘍表面に残っていた粒子はわずか数個だけでした（補足図5）。 したがって、PEGの溶解およびシリカナノ粒子の放出に対するPEG担体の影響の以下の定量分析のための実験時間枠として24時間を使用した。

緑色蛍光シリカナノ粒子をPEG担体またはPBSと混合し、潰瘍に接種しました（図5a）。 PEG担体を使用すると、PBSと比較して、24時間の時点でより多くのシリカナノ粒子が表層に残存した。 この効果は、PEGヒドロゲルおよびPEGスポンジよりもPEGスライムおよびPEGソフトスライムの方が大きかった（図5b、c）。 PEGスライムキャリアを使用したシリカナノ粒子の表面特異的分布の長期化は、表面特異的AAV遺伝子導入と関連している可能性があります。

a PEG担体にカプセル化された蛍光シリカナノ粒子を、マウスの背中に作られた生の表面に投与する。 PEGハイドロゲルとスポンジ担体をチャンバーに注入しましたが、スライムは注入できなかったのでPEGスライムを挿入しました。 投与２４時間後に、セットされたシリコンチャンバーの屋根を開けて観察した。 b 投与24時間後のPEG担体からの粒子拡散の比較。 ステレオスコープとスライスからの代表的な画像。 PEGスライムを投与した粒子は潰瘍表面に集中していましたが、PBSを投与した場合は粒子が筋肉内に拡散したことに注意してください。 バー = 1 mm。 c 表層内の蛍光シリカナノ粒子の数。 重ねられたドット プロットは、データの分布を示します。 PEGスライムとソフトスライムでは、表層の蛍光ナノ粒子の数が大幅に増加しました。 (n = 3) * <0.05、** <0.01、*** <0.001。

PEGスライムでは、表層におけるシリカナノ粒子の数が増加したが、表層におけるAAV媒介遺伝子導入は増加しなかった。 我々は、この不一致は時間の経過とともに PEG 内の AAV が減衰することに起因する可能性があると考えました。

AAV の遺伝子導入能力に対する体温および溶媒溶液での保存時間の考えられる影響を決定するために、37 °C で 0、3、6、12、18、および 24 時間保存した AAV の遺伝子導入能力をテストしました。またはマウス血清なしでの in vitro (図 6a)。 AAV を血清の非存在下で 37 °C で 3 ～ 18 時間維持すると、AAV の遺伝子導入能力は徐々に減少し、元の能力の 10 分の 1 になりました。 対照的に、AAVを血清とともに24時間保存した場合、AAVの遺伝子導入能力は維持されました（図6b）。 PEG と PBS を配合した PEG スライム内の AAV の遺伝子導入能力は時間の経過とともに減少する可能性がありますが、AAV が PEG スライムから放出されるとこの減少は弱まる可能性があります。 時間の経過とともに、PEG 内の AAV の崩壊が、表層におけるシリカナノ粒子の挙動と遺伝子導入効率の不一致に寄与する可能性があります。

a マウス血清の有無にかかわらず、37℃で0、3、6、12、18、および24時間維持したGFPNLS-AAVDJの遺伝子導入効率を、マウス脂肪由来間質細胞（mASC）でin vitroでテストしました。 b GFPNL-AAV の遺伝子導入能力は、血清の非存在下で 37 °C で保存した後、徐々に減少しましたが、血清を使用して 24 時間保存した後でも一貫していました。 重ねられたドット プロットは、データの分布を示します。 (n = 4)。

本研究では、生体内皮膚潰瘍モデルを使用して、さまざまな PEG キャリアを評価しました。 PEG スライムは、調査した他のキャリアと比較して、深層筋層と肝臓の両方で遺伝子発現が大幅に減少し、潰瘍表面に遺伝子発現を局在化することに成功しました。

AAV の詳細な動態を調査するために、蛍光標識が使用されました。 しかし、バックグラウンドシグナルに比べて蛍光シグナルが弱いため、信頼性の高い追跡は困難でした。 あるいは、各粒子が強い蛍光を示し、皮膚潰瘍組織サンプル内で確実に追跡できるため、シリカナノ粒子を採用しました。 AAV とシリカナノ粒子が同じ挙動を示さない可能性は、現在の研究の根本的な限界です。

in vivo 遺伝子導入効率は、異なる PEG 担体間で異なりました。 この違いは、架橋形態の違いによる溶解メカニズムに起因すると考えられます。 PEGヒドロゲルとスポンジでは、すべての分子が不可逆結合によって結合されていました。 したがって、これらの担体は固体に特有の特性を持っていました。 in vitro 特性評価では、一定のひずみ下で有限の弾性率を示すことが示されました (図 1f)。 PEGの溶解速度と粒子放出速度のin vitro評価では、ヒドロゲルとスポンジを使用した場合、他の担体と比較して両方の速度が大幅に低下することが示され、ナノ粒子がネットワーク内に捕捉されたことが示唆されました（図2b）。 。

一般に、PEG ハイドロゲルやスポンジなどの固体高分子材料は、表面から徐々に分解するのではなく、均一に分解すると考えられており、これはバルク分解と呼ばれます 25、26、27。 言い換えれば、加水分解により時間の経過とともに鎖の切断が均一に起こります。 最終的に、ネットワーク接続が特定のレベルを下回ると、PEG ヒドロゲルとスポンジは固体から液体に移行します。 したがって、PEGハイドロゲルとスポンジは、分解されながらAAV粒子が捕捉された組織に浸透するため、他の担体と比較して粒子放出が少ないと考えられます（図7a）。 ナノ粒子の物理的動きを評価するための蛍光粒子実験では、PEGスライムと比較して、ヒドロゲルとスポンジの両方で潰瘍の表層の粒子数が減少することが示されました（図5b、c）。

AAVをカプセル化するPEGヒドロゲルまたはスポンジ担体は、末端にスクシンイミジルグルタル酸（テトラ-PEG-GS）およびプロピルアミン（テトラ-PEG-PA）基を有するテトラ-PEGのゲル化前駆体を混合することによって調製され、これらは縮合によって相互に架橋されてアミドを形成するリンケージ、つまり不可逆的な結合です。 もともとテトラ PEG-GA に導入されたエステル基は、PEG 分子の間に導入され、最終的には加水分解されてヒドロゲルまたはスポンジが分解されます。 分解プロセスは、表面から徐々に進行するのではなく、バルク分解と呼ばれるこれらの担体中で均一に進行します。 キャリアが分解されると、カプセル化された AAV が表層または深層に拡散し、周囲の細胞に感染します。 b PEGスライムは、ジオールまたはボロン酸末端テトラPEG（テトラPEG-GDLおよびテトラPEG FPBA）の水溶液を混合することによって調製されました。これらは環状エステル反応によって相互に架橋され、可逆的な配位結合を形成しました絆。 可逆的な架橋により、PEG マトリックスに高度な粘弾性特性が与えられ、マトリックスが液体になります。 この PEG 液体は、皮膚潰瘍をカバーするために形状を変えることができ、皮膚層を通って拡散することなく AAV をカプセル化します。 PEG スライムは、分解されるのではなく、スライムと皮膚潰瘍の間の界面から表層に拡散します。 PEGスライムは表層に浸透する可能性があるため、PEGスライムは膨潤して希釈され、周囲の細胞への感染を引き起こし、その結果、肝臓における遠く離れたオフターゲット遺伝子の発現が減少します。 c PBS とともに投与された AAV は急速に拡散した。 遺伝子導入能力は、AAV が深層に到達するまで損傷を受けません。 したがって、AAV は表層と深層の両方に効果的に感染します。

エンドサイトーシスによる感染を成功させるには、AAV 粒子が細胞と直接接触する必要があります6。 したがって、AAV粒子がPEGネットワ​​ークにトラップされた場合、細胞との直接接触がないため、AAV感染は抑制されました。 言い換えれば、放出されていないAAV粒子は感染性を持たないため、PEGヒドロゲルまたはスポンジを使用したAAV投与後に潰瘍表面でのGFP発現が減少しました。

対照的に、PEGスライムでは分子は可逆結合を介して接続されており、その結果、分子の結合と解離の間の平衡が生じました（補足図1）。 スライムの弾性率は時間の経過とともに減少し、ゼロに達しました（図1f）。これは、スライムが熱力学的観点からは液体であることを示しています。 したがって、潰瘍表面に塗布されたPEGスライムは液体として拡散し、潰瘍表面から深部組織に浸透する可能性があります。 PEG スライムと PBS は、キャリアと AAV の拡散の点で同等であると考えられました。

PEG スライムは PBS とは異なる顕著な特徴を示しました。 スライムの溶解速度と放出速度はどちらも PBS を使用した場合よりも低く (図 2b)、時間の経過に伴う溶解速度と放出速度はほぼ同じでした (図 2c)。 これらの発見は、スライム中の PEG の局所的な解離と同時に粒子が放出されたことを示しています。 PEGスライムに含まれるナノ粒子は、適用後潰瘍表面に限定され（図5b）、間質から深部組織への浸透を制限しました。これは、スライムがPBSよりも長く潰瘍表面に留まったためである可能性があります。 言い換えれば、固体状のPEGヒドロゲルやスポンジとは異なり、液体状のPEGスライム中の粒子は並進的に拡散し27、AAV感染は主にPEGスライムが存在する潰瘍表面で発生した（図7b）。

PEGスライムは、粘弾性が低いPEGソフトスライムよりもウイルス感染中により局在化し、PEGスライムを使用した深部感染が主に減少しました（図3e）。 局所的なオフターゲット深層感染は限られていたため、肝臓におけるオフターゲット発現も減少しました。

以前の報告では、担体を使用したウイルスベクターによる遺伝子治療は、担体からのウイルスベクター放出速度の抑制をもたらしました。 たとえば、ヒドロゲルとその類似体を備えたレンチウイルスは、in vitro 27 および in vivo 28 での局所活性の延長をもたらしました。 フィブリンとともに運ばれるアデノウイルスは生物活性が増加し、in situ での半減期が延長されました 29。 そして、ゼラチンを含む AAV では、生理活性物質の局所濃度が増加しました 30。

PEG担体の有無にかかわらず、皮膚潰瘍表面上のシリカナノ粒子の挙動は、他のタイプの薬物および生体分子の送達におけるPEG担体の潜在的な有用性を示した。 皮下投与された物質の時間依存性の拡散、生体内分布、クリアランスに伴う用量依存性などの他の挙動の解明は、今後の研究で行われる必要がある。

PEGスライムは表層に投与されるAAV粒子の絶対量を増加させる可能性がありますが、この増加は時間の経過とともにPEG内のAAVの崩壊によってキャンセルされ、それにより深層の陽性細胞の数と陽性細胞の総数が減少します。 。 結果として、本研究で開発されたテトラ PEG 担体は局所活性を大幅に改善しませんでした。 遺伝子導入は皮膚の表層に局在しており、オフターゲット効果は大幅に減少しました。

我々は、創傷に存在する間葉細胞の直接的な再プログラミングを介して拡張可能な上皮組織を生成する新しい技術について説明しました。これにより、通常の治癒中に観察される空間的制約なしに、創傷のすべての領域が再上皮化することが可能になります9,10。 再プログラミング因子の導入は、非上皮細胞から上皮細胞への直接的な再プログラミングを潜在的に誘導し、したがって皮膚潰瘍の表層以外の部位での異所性上皮組織の形成を誘導する可能性がある。 さらに、導入遺伝子が遠隔臓器に誘発する可能性のある潜在的な有害反応を最小限に抑えることが望ましい。

私たちの最初の概念実証研究では、限られた数の小動物で副作用は検出されませんでした。 しかしながら、臨床応用に向けた更なる発展のためには、あらゆる手段が講じられるべきである。 今回の発見は、皮膚潰瘍に対する遺伝子治療の開発だけでなく、局所的で非常に強力な効果が期待されるあらゆるタイプの治療開発にとっても洞察力を与える可能性があると我々は考えている。

現在の研究の他の限界は、ヒトとマウスの皮膚構造の違いにあります31。 主な違いには、真皮や皮下脂肪組織などの層状構成要素の厚さ、マウスには汗腺がないこと、マウスの背中の皮膚には肉層として知られる薄い筋肉層が存在することが含まれます。 実験はシリコンチャンバー内の皮膚潰瘍を用いて行われたため、これらの違いは現在の研究の結果に実質的な影響を及ぼさない可能性があります。 それにも関わらず、臨床応用の際には結果を慎重に解釈する必要があります。 もう 1 つの制限は実験モデルにあります。 密閉チャンバー内での液体 AAV の投与は、開いた創傷表面に溶液を直接塗布する臨床現場での実際の投与とは完全に異なります。 AAV のキャリアとして粘弾性液体を使用すると、AAV の脱落を減らすのに有利である可能性があります 32 が、実験的に決定することはできませんでした。

粘弾性の高い液体であるPEGスライムをAAVのキャリアとして使用すると、他のキャリアやPBSコントロールと比較して、皮膚潰瘍の表層に局所的に遺伝子発現が起こり、オフターゲット効果が減少しました。 本研究で開発されたPEG担体を使用した放出制御は、将来の局所遺伝子治療への道を切り開きます。

テトラ-PEG-PA およびテトラ-PEG-GS (Mw = 20 kg mol-1) (日本油脂株式会社、日本) をさらに精製せずに使用しました。 第一級アミンで官能化されたポリ（エチレングリコール）（Mw = 20 kg mol-1）（テトラ-PEG-NH2）（SINOPEG、中国）をさらに精製せずに使用しました。 硫酸カリウム（K2SO4）、超脱水メタノール、超脱水ジメチルスルホキシド、GDL、FPBA、トリエチルアミン（TEA）、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリドn水和物（DMT-MM）、および4％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液（PFA）（富士フイルム和光純薬株式会社、日本）をさらに精製することなく使用した。 Alexa FluorTM 594 NHS エステル (スクシンイミジル エステル) (Alexa-NHS) およびダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) (Thermo Fisher Scientific、米国) をさらに精製せずに使用しました。 リン酸緩衝液（ｐＨ７．４；ＰＢ）を２００ｍＭの濃度で調製した。 RC15-AC (Sartorius、ドイツ)、ARVO™ X3 (PerkinElmer、米国)、および LSM 800 (ZEISS、ドイツ) がそれぞれ 0.22 μm フィルター、マイクロプレート リーダー、および共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) として使用されました。すべての実験。 研究全体を通して、水として Milli-Q 水が使用されました。

テトラ-PEG-GDL およびテトラ-PEG-FPBA は、以前の報告に従って、関連する分子をテトラ-PEG-NH2 に結合することによって合成されました 18。 テトラ-PEG-GDL、テトラ-PEG-NH2 (1000 mg、0.05 mmol)、GDL (89 mg、0.5 mmol、10当量のテトラ-PEG-NH2)、およびTEA (50 mg、0.5 mmol、10当量)の場合テトラ−ＰＥＧ−ＮＨ２）を３０ｍｌの超脱水メタノールに溶解した。 混合物を撹拌し、35℃で3日間インキュベートした。 次に、混合溶液を、Spectra/Por® 透析膜 (MWCO: 6000 ～ 8000 Da、Spectrum Laboratories、ギリシャ) を使用して、過剰のメタノールおよび水に対してそれぞれ 24 時間透析しました。 この溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥することによりテトラ－ＰＥＧ－ＧＤＬを得た（収量：９００ｍｇ）。 得られたポリマーは、溶媒としてＤ２Ｏを使用する１Ｈ−ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＤＰＸ−４００ＭＨｚ、米国）によって特性評価された。

テトラ-PEG-FPBA、テトラ-PEG-NH2 (1000 mg、0.05 mmol)、FPBA (91 mg、0.5 mmol、10当量のテトラ-PEG-NH2)、およびDMT-MM (138 mg、 ０．５ｍｍｏｌ、１０当量のテトラ−ＰＥＧ−ＮＨ２）を３０ｍｌの超脱水メタノールに溶解した。 混合物を撹拌し、35℃で3日間インキュベートした。 混合液を透析膜を用いて過剰の10mM HCl水溶液、10mM NaOH水溶液、リン酸緩衝液（pH7.4、10mM）、100mM NaCl水溶液、蒸留水に対してそれぞれ24時間透析した。 この溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥することによりテトラ－ＰＥＧ－ＧＤＬを得た（収量：９００ｍｇ）。 得られたポリマーは、溶媒としてＤ ２ Ｏを使用する １ Ｈ－ＮＭＲによって特性評価された。

PEGハイドロゲル、PEGスポンジ、PEGスライムは、相互に架橋可能なテトラPEGを溶解し、同量のテトラPEGを混合することによって調製した。 これらの PEG キャリアは、以下の前駆体を使用して架橋されました。 （１）ＰＥＧヒドロゲル：テトラ−ＰＥＧ−ＰＡおよびテトラ−ＰＥＧ−ＧＳを別々にＰＢに溶解して、ＰＥＧ（ＣＰＥＧ）の濃度＝６０ｇ ｌ−１を得た。 （２）ＰＥＧスポンジ：テトラ−ＰＥＧ−ＰＡおよびテトラ−ＰＥＧ−ＧＳを、２５０ｍＭ Ｋ２ＳＯ４を含むＰＢに別々に溶解して、ＣＰＥＧ＝６０ｇ ｌ−１を得た。 （3）PEGスライム：テトラPEG-GDLとテトラPEG-FPBAを別々にPBに溶解し、CPEG = 60 g l−1を得ました。

赤色蛍光標識されたテトラ-PEG-PAおよびテトラ-PEG-GDLは、PEG足場の内部構造を視覚化するために調製されました。 テトラ-PEG-PAの場合、1000 mgのテトラ-PEG-PAを20 mlの蒸留水に溶解し、室温で10分間撹拌した。 別に、１ｍｇのＡｌｅｘａ－ＮＨＳを１ｍｌの超脱水ジメチルスルホキシドに溶解し、１６μｌ（０．０１当量のテトラ－ＰＥＧ－ＰＡ）をテトラ－ＰＥＧ－ＰＡ溶液に添加した。 混合溶液を室温で 3 時間インキュベートした後、過剰の蒸留水に対して 3 時間透析して未反応分子を除去し、凍結乾燥して、部分的に赤色蛍光で標識されたテトラ-PEG-PA を薄赤色の粉末として得ました（収量：950mg）。 赤色蛍光標識したテトラ PEG-PA およびテトラ PEG-GS を K2SO4 = 0 および 300 mM の濃度で PB に溶解し、CPEG = 60 g l-1 を得ました。 これら 2 つの前駆体を同量で混合し、円筒形のシリコン型 (直径: 5 mm、高さ: 1 mm) に注ぎ、25 °C で 24 時間インキュベートしました。 得られたサンプルをCLSMを用いて観察した。

テトラ-PEG-GDLの合成では、GDLとテトラ-PEG-NH2との反応前に、1000mgのテトラ-PEG-NH2を20mlの超脱水メタノールに溶解した。 次いで、１６マイクロリットル（０．０１当量のテトラ－ＰＥＧ－ＮＨ ２ ）のＡｌｅｘａ－ＮＨＳを溶液に添加し、溶液を室温で２４時間インキュベートした。 続いて、テトラ－ＰＥＧ－ＧＤＬの調製について記載した方法に従って、ＧＤＬおよびＴＥＡを混合溶液に添加した。 次に、赤色蛍光標識されたテトラ-PEG-GDL およびテトラ-PEG-FPBA を PB に溶解して、CPEG = 60 g l-1 を得ました。 これら 2 つの前駆体を同量で混合し、円筒形のシリコン型に注ぎ、25 °C で 24 時間インキュベートした後、CLSM を使用して観察しました。

PEGヒドロゲルおよびPEGスライム用の赤色蛍光標識PEG前駆体を円筒形シリコンモールド（直径：5mm、高さ：1mm）に注ぎ、25℃で24時間インキュベートしました。 CLSM下で、インキュベートしたPEGキャリアを20μmの円で1秒間漂白し、蛍光強度の回復が観察されました。

マウスの背中の表面にある皮膚潰瘍を使用した in vivo モデル システムは、12 ウェル細胞培養インサート (孔径 8.0 μm) (Becton, Dickinson and Company, USA) を使用して設計されました。 -ウェル培養プレートを使用し、このシステムを使用して溶解速度論または放出挙動を評価しました。 溶解速度論のために、PEG分子の末端の部分的に赤色蛍光で標識されたPEG足場100μlをインサート上に調製し、25℃で24時間インキュベートした。 次に、1000 μl と 2500 μl の DPBS をそれぞれインサートとウェルプレートに加えました。 室温、暗所でウェルプレートから 2500 μl のサンプルを採取し、各時点での透過物質の濃度を評価しました。 溶液をサンプリングした後、同量の新鮮な DPBS をウェルプレートに加えて体積を維持しました。 透過したサンプルの濃度は、マイクロプレートリーダーを使用して蛍光強度（λex = 580 nm、λem = 590 nm）を測定することによって決定されました。 溶解率は、赤色蛍光で標識されたテトラ PEG の総量と比較したパーセンテージとして評価されました。

モデルウイルスの放出挙動を調査するために、シリカナノ粒子の溶液（1 mg ml-1、sicastar®-green F、直径 30 nm、Micromod Partikeltechnologies、ドイツ）をテトラ-PEG-GDL の各前駆体溶液に懸濁しました。 PEGスライムの場合はテトラ-PEG-PA、PEGヒドロゲルまたはスポンジの場合は0.1 mg ml-1の濃度およびCPEG = 60 g l-1。 混合溶液をPEG前駆体に添加して、ナノ粒子を含むPEG担体を調製した。 ナノ粒子の放出挙動は、蛍光強度 (λex = 460 nm、λem = 480 nm) の測定を除き、PEG キャリアの溶解に関して記載された方法に従って評価されました。

PEG スポンジの応力緩和試験は、圧縮装置 Rheogel-E4000 (UBM、日本) を使用して、円柱状サンプル (直径: 15 mm、高さ: 7 mm) に対して 25 °C で実施されました。 小さなひずみ (ε = 0.5) を加えた後、時間の関数として応力の減衰が観察されました。 ヤング率 [E(t)] の緩和は、応力を加えられたひずみで割ったものとして計算されました。 ＰＥＧヒドロゲルおよびＰＥＧスライムについては、直径２５ｍｍの平行プレート固定具を備えた応力制御レオメーター（ＭＣＲ３０１；アントンパール社、オーストリア、グラーツ）を使用して動的粘弾性測定を行った。 貯蔵弾性率 (G') および損失弾性率 (G'') の角周波数 (0.1 ～ 100 rad s-1) 依存性は 25 °C で測定されました。 振動せん断ひずみ振幅は、すべての試験において線形粘弾性の範囲内であることが確認されました。 等容積変形 (E = 3G) を仮定して、G' および G'' データを E(t) に変換しました。

AAV を生成するには、AAVDJ、pAAV-GFPNLS、pAAV-mCherryNLS、pAAV-DNP63A、および pAD5 のプラスミドを調製し、塩化セシウム法 10 を使用して、培養サブコンフルエント 293AAV にトランスフェクトしました。 GFPNLS および mCherryNLS プラスミドには、核局在シグナル (NLS) 配列およびウッドチャック肝炎転写後調節エレメント配列が含まれていました。 遺伝子コピー数は、qPCR を使用して定量化されました。 使用したプライマー配列は次のとおりです: AAV-ITR (Fw: GGAACCCCTAGTAGTGATGGAGTT; Rv: CGGCCTCAGTGAGCGA)。

AAV ウイルスを PBS で希釈し、5 μl 中に 5 × 1010 の遺伝子コピー (GC) を作成しました。 調製した AAV 溶液約 5 μl を、PEG スライムの場合は tetra-PEG-GDL 45 μl、PEG ハイドロゲルまたはスポンジの場合は tetra-PEG-PA を CPEG = 60 g l−1 となるように混合し、50 μl の AAV 溶液に添加しました。 CPEG = 60 g l-1を得るために、AAVを含むPEG担体を調製するための60 g l-1のPEG前駆体。 PEGスライムは混合するとすぐに固まるため、潰瘍基部に合わせた大きさの底面1×1cmの粒子顆粒を形成しました。 対照として、5×1010 GCのAAVウイルスを含む5μlのPBSを95μlのPBSと混合した。

生後 4 週間の雌 C57BL/6 マウスを、Nippon Bio-Supp (日本) から購入しました。 すべての動物実験は東京大学動物研究委員会によって承認されました。 シリコン製のチャンバーは 3D プリンターで合成されました20。 簡単に説明すると、3D プリンターを使用して、幅 5 mm のフランジを備えたキャップ型のシリコン チャンバーの型を作成し、2 つの液体を混合してシリコンをチャンバーに注入しました。 合成されたシリコンチャンバーはオートクレーブで滅菌されました。

取り付け方法は、皮膚潰瘍の毛髪再構築アッセイについて以前に報告した方法に基づいていました20。 肩甲骨間領域は、チャンバー固定の安定性が高く、経時的に潰瘍表面を維持する効果があるため、チャンバー取り付け部位として選択されました。 イソフルランによる全身麻酔下で、チャンバーの取り付け部位を完全に剃りました。 皮膚および皮下組織の円形領域(直径1cm)を肉層の下で外科的に除去した。 チャンバーを挿入し、5-0 Ethilon® (Johnson and Johnson、USA) を使用して、つばとその上の皮膚を 4 か所で縫合しました。

PEGヒドロゲルおよびPEGスポンジ製剤は、シリコンチャンバーの上部近くに作られた小さな切開を通して、液体が硬化する前に液体成分を皮膚潰瘍表面に直接滴下することによって投与された。 混合物投与後、腹臥位で5分間吸入麻酔を継続し、潰瘍表面の治癒を確認した後、麻酔薬の吸入を終了した。 対照群であるAAVを含むPBSも同様に、チャンバー内の皮膚潰瘍表面に液体を直接滴下して投与した。 ＰＥＧスライムは、鉗子で直接掴むことができないほど十分に硬かったため、他の物質とは異なる方法で投与された。 シリコンチャンバーを周囲の 3/4 開け、スライムを潰瘍表面に直接塗布しました。 投与後、潰瘍表面の乾燥を避けるために、チャンバー開口部の中心を5-0ナイロンのシングルステッチで縫合し、密閉を維持した。

吸入麻酔後にマウスを頚椎脱臼により安楽死させ、チャンバーを開け、処理直後にチャンバーの背面を実体顕微鏡（Axio Zoom®、Carl Zeiss、USA）を使用して観察した。 次に、シリコンチャンバーを含む皮膚組織を、背中の正中線筋層を含む胸壁のすぐ上まで慎重に採取し、4% PFA で一晩固定し、30% スクロース中に一晩静置しました。 固定された潰瘍表面を含むサンプルを最適切断温度コンパウンド (OCT Compound®、サクラファインテック、日本) に包埋し、凍結標本を作成しました。 クライオスタットを使用して切片を 12 µm のスライスとして調製し、PBS で 2 回洗浄し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) 封入剤 (DAPI を含む Fluoromount-G®、Thermo Fisher Scientific、米国) で固定し、蛍光を観察した。 ヘマトキシリン・エオシン (HE) 染色は一般的な手法 10 で実行されました。

Axiozoom Z-stack モードの実体顕微鏡で撮影した画像から、感染細胞の境界が最も明確に認識できるスライスを使用しました。 各標本について、焦点のある 5 つの領域 (20 μm 四方) がランダムに選択されました。 フレーム内のセルの数を目視で数え、平均値を計算しました。 おおよその数は潰瘍表面の面積に応じて計算されました。 各サンプルについて、ほぼ均等に分布した 3 つの位置から得られた 3 つのセクションが抽出されました。 隣接する切片の HE 染色の結果を使用して、脂肪組織層と筋肉層の上下に分けて、蛍光粒子または陽性細胞の数を倍率 40 倍の視野で視覚的にカウントしました。

肝臓におけるオフターゲット効果についての AAV 力価を分析するために、6 つの葉からサンプルを収集し、市販のキット (DNeasy® Blood & Sample Kit、QIAGEN、ドイツ) を使用してゲノム DNA を抽出しました。 AAV ゲノムのコピー数は、StepOne Plus リアルタイム PCR システム (Thermo Fisher Scientific、米国) での qPCR を使用して、100 ng のゲノム DNA で測定されました。 プライマーは、AAV-ITR に特異的なウイルスゲノム配列 (Fw: GGAACCCCTAGTAGTGATGGAGTT; Rv: CGGCCTCAGTGAGCGA) およびマウス タイチン遺伝子 (Fw: CTCCATCACTAGGGGTTCCT; Rv: TTCAGTCATGCTGCTAGCGC) を使用しました。 AAV ゲノムのコピー数は、二倍体核あたりの絶対値として表されました。 すべてのゲノム DNA サンプルを 3 回分析しました。

DNP63A-AAVDJ (1 × 1012 GC) は、市販のタンパク質標識キット (Alexa Fluor® 568 Protein Labeling Kit、Thermo Fisher Scientific、USA) を製造元の指示に従って使用して標識しました3。

安楽死させた生後 3 ～ 5 週目のマウスから鼠径部 - 腰椎の皮下脂肪体を採取しました。 脂肪組織を酵素的に消化し 10、間質血管画分を遠心分離によって単離し、マウス検体ごとに 1 つのウェルを使用してゼラチンでコーティングした 6 ウェルプレートに接種し、DMEM (4.5 g l-1 グルコースを含む) からなる完全 DMEM 増殖培地で維持しました。 、110 mg l−1 ピルビン酸ナトリウム、および 4 mM L-グルタミン）、10% (v/v) 熱不活化ウシ胎児血清、1:100 (v/v) MEM 非必須アミノ酸溶液 (Gibco) を添加、および 1:100 (v/v) GlutaMAX サプリメント (Gibco)。

P3 初代 mASC を、200 μl の完全 DMEM 増殖培地に 5 × 104 個の細胞が入った状態で、細胞培養プレート上にセットされたスライド ガラス上に滴下しました。 37℃で1時間インキュベートした後、細胞培養の通常の用量まで培地をプレートに加えました。 24時間のインキュベーション後、MOI 2000 (細胞あたりのGC)の標識AAVをプレート上に配置した。 4℃で1時間インキュベートした後、カバーガラスに付着した細胞を徹底的に収集し、DAPI染色剤でマウントして共焦点顕微鏡で評価しました。

標識されたAAV（マウスあたり1×1010 GC）およびシリカナノ粒子（最終用量; 20倍希釈）を100μlのPBS中で混合し、チャンバー内のマウス潰瘍に投与した。 組織学的観察のために潰瘍を 24 時間後に収集しました。

P3 初代 mASC を 24 ウェル プレート (底面積 1.9 cm2) に各ウェルに 1 × 104 細胞ずつ播種しました。 24 時間のインキュベーション後、細胞に GFPNLS-AAVDJ を投与しました。 GFPNLS-AAVDJ をマウス血清 (分離ゲル付き BD Microtainer® 血清チューブで精製) の存在下または非存在下で 37 °C で所定の期間 (0 ～ 24 時間) インキュベートし、その後 mASC に投与しました。 AAV投与の24時間後に培地を更新した。 GFP 陽性細胞は、感染から 72 時間後に 4 つのウェルで計数されました。

Excel ソフトウェア (Microsoft、米国) を使用して統計的有意性を評価しました。 2 つのグループ間の有意性を決定するために、対応のない両側スチューデント t 検定を適用しました。 p ≤ 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。 データ分布は正常であると仮定されました。 サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでしたが、サンプルサイズは以前の出版物で報告されたものと同様でした10。 データの収集と分析は盲目的に実行されたわけではありません。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

図内のグラフおよびチャートのソース データは補足データとして入手でき、残りの情報は合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。 資料は、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。

Mingozzi, F. & High, KA AAV を使用した遺伝性疾患の治療的 in vivo 遺伝子導入: 進歩と課題。 ナット。 ジュネ牧師。 12、341–55 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang, D.、Tai, PWL & Gao, G. 遺伝子治療送達のプラットフォームとしてのアデノ随伴ウイルス ベクター。 ナット。 Rev.DrugDiscov. 18、358–378 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DA クズミンら。 AAV 遺伝子治療の臨床状況。 ナット。 Rev.DrugDiscov. 20、173–174 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kotterman, MA & Schaffer, DV 臨床遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスのエンジニアリング。 ナット。 ジュネ牧師。 15、445–451 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, C. & Samulski, RJ 遺伝子治療用のアデノ随伴ウイルス ベクターのエンジニアリング。 ナット。 ジュネ牧師。 21、255–272 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Naso, MF、Tomkowicz, B.、Perry, WL 3rd & Strohl, WR 遺伝子治療用ベクターとしてのアデノ随伴ウイルス (AAV)。 BioDrugs 31、317–334 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ガレアーノ、M. et al. アデノ随伴ウイルスベクターを介したヒト血管内皮増殖因子遺伝子導入は、遺伝的に糖尿病のマウスにおける血管新生と創傷治癒を刺激します。 Diabetologia 46、546–555 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jazwa, A. et al. 血管内皮増殖因子 A と線維芽細胞増殖因子 4 の遺伝子導入を組み合わせると、糖尿病マウスの創傷治癒が改善します。 ジュネット。 ワクチンその。 8、6 (2010)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

栗田 M.、イズピスア ベルモンテ JC、鈴木 K.、岡崎 M. 皮膚潰瘍治療のための新規上皮化法の開発。 Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． 科学。 95、8–12 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

栗田正人ほか創傷常駐細胞の生体内再プログラミングにより、皮膚上皮組織が生成されます。 ネイチャー 561、243–247 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, CC & Anseth, KS 再生医療における生体分子の制御放出のための PEG ハイドロゲル。 薬局。 解像度 26、631–643 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

スローター、BV、クルシッド、SS、フィッシャー、OZ、カデムホセイニ、A. & ペッパス、NA 再生医療におけるヒドロゲル。 上級メーター。 21、3307–3329 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cucchiarini, M. & Madry, H. 標的関節軟骨修復のための遺伝子ベクターの生体材料誘導送達。 ナット。 リウマトール牧師。 15、18–29 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

Zhu, T. et al. 無縫合硬膜閉鎖に対するテトラ PEG ハイドロゲル シーラントの高い有効性。 バイオアクト。 メーター。 8、12–19 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

バーディル、JR 他糖尿病性足潰瘍治療用の局所用ゲルベースの生体材料。 アクタバイオメーター。 138、73–91 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

酒井 哲 ほか四面体状マクロモノマーから理想的に均質なネットワーク構造を有する高強度ヒドロゲルを設計および作製する。 高分子 41、5379–5384 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

石川 伸、吉川 裕、鎌田 博、鄭 U.-I & 酒井、T. 生細胞をカプセル化できる相分離構造を備えた注射可能なヒドロゲルの簡単な調製。 ACS アプリケーションメーター。 インターフェイス 14、35444 ～ 35453 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

片島 哲 ほか適切に制御された構造を備えた過渡ネットワークにおける結合寿命と粘弾性緩和の実験的比較。 ACS マクロレット。 11、753–759 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lichti, U.、Anders, J. & Yuspa, SH インビトロ分析および免疫不全マウスへの移植のため、新生児マウスからの初代ケラチノサイト、毛包集団および真皮細胞、および成体マウスからのケラチノサイトの単離および短期培養。 ナット。 プロトック。 3、799–810 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Du、Z.ら。 シリコーンスキンチャンバーの製造用に最適化された 3D プリントテンプレートデザイン。 Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． 科学。 105、55–57 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bartlett、JS、Samulski、RJ & McCown、TJ 脳におけるアデノ随伴ウイルス 2 型の選択的かつ迅速な取り込み。 ハム。 ジーン・サー。 9、1181–6 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Keiser, NW、Yan, Z.、Zhang, Y.、Lei-Butters, DC & Engelhardt, JF AAV1、2、および 5 のウイルス侵入、細胞内輸送、および核移入の固有の特性が、HeLa 細胞における形質導入効率を定義します。 ハム。 ジーン・サー。 22、1433–44 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Venkatesan, JK、Falentin-Daudré, C.、Leroux, A.、Migonney, V. & Cucchiarini, M. ポリ (スチレンスルホン酸ナトリウム) グラフト化ポリ (ɛ-カプロラクトン) フィルムからの生体材料ガイドによる組換えアデノ随伴ウイルス送達ヒトの骨髄穿刺液をターゲットにします。 組織工学パート A 26、450–459 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

カリフォルニア州マグワイアほか。 新規遺伝子送達システムとしての微小胞関連 AAV ベクター。 モル。 それで。 20、960–971 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

酒井 T. ポリマーゲルの物理学 (Wiley-VCH Verlag、2020)。

フィック、AV 液体拡散について。 ロンド。 エディンブ。 ダブリンのフィロス。 マグ。 J.Sci. 10、30–39 (1855)。

記事 Google Scholar

Shin, S.、Tuinstra, HM、Salvay, DM & Shea, LD 局所遺伝子導入のためのレンチウイルスのホスファチジルセリン固定化。 バイオマテリアル 31、4353–4359 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thomas, AM、Palma, JL & Shea, LD 急性および慢性脊髄損傷に対するスポンジ媒介レンチウイルス送達。 J. コントロール リリース 204、1–10 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schek, RM、Hollister, SJ & Krebsbach, PH 局所遺伝子治療のための生体適合性ハイドロゲルを使用したアデノウイルスの送達と保護。 モル。 それで。 9、130–138 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リー、HHら。 フィブリン足場からの生理活性アデノ随伴ウイルスの放出: フィブリン接着剤濃度の影響。 組織工学パート A 17、1969 ～ 1978 年 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zomer, HD & Trentin, AG ヒトとマウスの皮膚創傷治癒：トランスレーショナルリサーチにおける課題。 Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． 科学。 90、3–12 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Le Guiner, C.、Moullier, P. & Arruda、VR 生体内分布と AAV ベクターの排出。 方法 Ｍｏｌ． バイオル。 807、339–59 (2011)。

論文 PubMed Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

この研究は、JSPS 科研費助成番号 JP20H03847 (MK 宛) の支援を受けました。 日本学術振興会 科研費 挑戦的研究（先駆的）（JP20K20609）（MK宛）; JSPS 科研費 基盤研究(A) (JP21H04688) (TS 宛); 科学研究費補助金 革新的研究領域 (JP20H05733) (TS 宛); 日本学術振興会特別研究員向け科学研究費補助金 (21J10828) (MK 宛); 日本学術振興会特別研究員向け科学研究費補助金 (JP20J01344) (SI 宛); 若手研究者向け科学研究費補助金 (JP20K15338) (TK 宛); 科学技術振興機構 (JST) CREST、助成番号 JPMJCR1992 (TS 宛)。 および AMED の助成番号 JP21zf0127002 (MO、TS、および MK 宛)。 Edanz (https://jp.edanz.com/ac) の Victoria Muir 博士がこの原稿の草稿を編集しました。

These authors contributed equally: Motoi Kato, Shohei Ishikawa.

東京都文京区本郷7-3-1 東京大学大学院医学系研究科形成外科学教室

Motoi Kato, Qi Shen, Zening Du, Takao Numahata, Mutsumi Okazaki & Masakazu Kurita

東京都文京区本郷7-3-1 東京大学工学部生命工学科

Shohei Ishikawa, Takuya Katashima & Takamasa Sakai

東京都文京区本郷7-3-1 東京大学大学院医学系研究科 疾患生物学・統合医学研究センター

Mitsuru Naito

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

TS と M. クリタが研究を設計しました。 加藤正氏とSI氏が実験を設計した。 データ取得および/または分析は、M. Kata、SI、TK、および TN によって実行されました。AAV は、QS、ZD、TN、および M. Kurata によって作成されました。 ポリマーは TK と MNM 加藤、SI、TK、TS によって合成され、栗田氏が原稿を作成しました。 管理的、技術的、または監督的なタスクは、MO、TS、および栗田氏によって処理されました。

Correspondence to Takamasa Sakai or Masakazu Kurita.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Dan Wang、Navneet Mataru、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Huan Bao、Eve Rogers、Anam Akhtar。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

加藤正人、石川真司、沈Q他局所的なアデノ随伴ウイルス感染とオフターゲット効果の低減のための、in situ 形成可能な動的架橋ポリ (エチレングリコール) キャリアー。 Commun Biol 6、508 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04851-w

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 6 月 14 日

受理日: 2023 年 4 月 19 日

公開日: 2023 年 5 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04851-w

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。