効率的な3Dライト - 南通組織消耗品有限公司

Communications Biology volume 6、記事番号: 170 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

細胞解像度と広い視野 (FOV) の両方を備えた 3D で人体組織サンプルを画像化できる機能により、基礎的および臨床的研究が向上します。ここでは、FFPE-MASH プロトコルで処理した、〜5 cm3 サイズのホルマリン固定ヒト脳と最大〜7 cm3 サイズのホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）前立腺がんサンプルのライトシートイメージングの実現可能性を実証します。我々は、cm3 スケールの透明組織の高速 3D 高解像度取得が可能なライトシート顕微鏡プロトタイプ、透明組織デュアルビュー選択的平面照明顕微鏡 (ct-dSPIM) を紹介します。組織サンプル全体の高速 3D 概要、または大きな ROI の高解像度概要をさまざまな速度で取得するために、モザイクスキャンを使用しました: (a) モザイク 16 (16.4 μm 等方性解像度、~1.7 h/cm3)、(b) モザイク 4 (4.1 μm 等方性) (c) モザイク 0.5 (0.5 μm 近等方性解像度、~15.8 h/cm3)。ヒトの脳領域 V1 と V2 の境界付近の皮質層とニューロンを視覚化することができ、厚い前立腺がんサンプルにおけるグリーソンスコアのグレーディングに適した画像品質を実証できました。我々は、ct-dSPIMイメージングが、MASHで調製された大規模ヒト組織サンプル全体を3Dで定量的に評価するための優れた技術であり、将来の臨床的可能性が大きいことを示します。

大規模な微細構造の可視化には明らかな利点があるにもかかわらず、基礎研究や臨床病理学における組織サンプルのほとんどは、スライドガラスに載せた紙のように薄い組織切片（約 5 ～ 100 μm の範囲）で従来の光学顕微鏡を使用して検査されています。これにより、3D 器官構造が破壊され、小さな視野 (FoV) にわたって限られた 2D 情報のみが提供されます。したがって、十分な解像度を備えた新しい高速、大容量の 3D マルチスケール顕微鏡アプローチに向けて、大幅な進歩が必要です。これにより、大きな組織サンプル全体（サイズは mm から cm まで）全体にわたる重要な詳細と概要の特徴の検出が可能になります。

人間の脳の複雑な 3D 構造は本質的にマルチスケールであり、非常に小さな構造が長距離にわたって存在し、脳領域全体にまで及んでいます1。たとえば、層状皮質細胞構造は、顕微鏡スケールでは細胞の密度、サイズ、形態によって定義されますが、その層は皮質領域全体に広がっているため、層化はセンチメートルスケールで発生します。さまざまな層、さらには脳領域全体にわたる細胞計数などの定量的特性評価を可能にするには、細胞の高解像度イメージングだけでなく、大規模な FoV 概要スキャンの両方を実行する必要があります。この種のデータは、生物学に基づいた現実的な神経モデリングなどに不可欠です2。したがって、層状細胞構造の研究には、高解像度イメージングと大きな視野の両方が必要です。

前立腺がんでは、腫瘍は多病巣性と、拡張ボリューム全体にわたる 3D の多様な組織形態学的パターンを持つ不均一な形態を特徴としています 3,4。現在まで、前立腺がんの確定診断には、グリーソンスコアグレード 3 に基づいた生検の組織病理学的検証が必要です。これは、観察者間のばらつきが示すように困難であり、その結果、患者の治療が過小または過剰になる可能性があります4。さらに、「積極的な監視」の基準は、腫瘍の広がりとグリーソングレード5の定量化によって決定されます。前立腺生検コアの完全な連続切片作成が行われることはほとんどないため、前立腺腺癌の小さな病巣が複数ある場合には、それらがパラフィンブロック内の異なるレベルで存在するため、グレードが低く評価される可能性があります5。さらに、組織ブロックの不完全な切片作成により偽陰性生検が発生する可能性があります。たとえば、Paulk et al. 最初の H&E 切片には存在しなかった、パラフィンブロックのより深い切片における前立腺癌の発生を示しています 5。現在の実践では、組織の可視化を高めるためにパラフィンブロック全体を定期的に切断することは、3 ～ 4 レベルのみを切断する標準的な手順と比較して、作業負荷と価格が高いため不可能である可能性があります。

近年、ライトシート蛍光顕微鏡（LSFM）は、光学的組織透明化と併用して、メソスケールからマイクロスケールの解像度でげっ歯類やヒトの組織を3D視覚化および検査するために使用されています6、7、8、9、10、11。さまざまな研究室が、CLARITY6,8、iDISCO9,10、CUBIC12 などの光学的透明化プロトコルを開発しており、これらは主に、脳の構造と病理学の両方を理解するために、マウスの脳を透明にするために適用されています7。しかし、特に、大規模なアーカイブ（すなわち、アルデヒド固定剤で固定された）ヒト成人脳サンプルに、透明化組織ライトシートイメージングを適用することは、サンプルサイズと、透明化、標識化およびイメージングの適用の困難さのため、大きな課題であった。大量のミエリンに富んだ組織全体にわたって13。

これまでの研究では、ヒトの脳 7、12、13、14、15、16 とヒト前立腺がん生検 17 の両方の除去、標識化、および LSFM イメージングの成功が実証されています。ただし、1 mm313 ～ 1 cm312 の人間の脳サンプルと厚さ 1.5 cm の組織スラブ 14 は正常に除去およびラベル付けされましたが、実際の LSFM で画像化されたサンプルサイズは 1 mm3、厚さ 15 または 500 μm の組織スラブ 13 に制限されており、報告されている最大体積は ~ 10.5mm×14.1mm×3mm16．趙ら。光学的に透明化され標識されたこれまで最大の人間の脳サンプル (7.5 × 5 × 0.4 cm) を共焦点顕微鏡で画像化しました。ただし、ライトシート顕微鏡のセットアップでは、画像取得の速度と拡張性が大幅に向上します。 Glaser らによって記載および実施されたような最近の前立腺研究 17。主に 1 ～ 2.5 mm の針生検に焦点を当てています。人間の脳および前立腺がんサンプル (およびその他の種類のサンプル) に適用される最も顕著な LSFM セットアップの概要を、サンプル量と分解能を含めて表 1 に示します。 Liu 研究室 17 とシュロフ研究室 18 は両方とも、透明な組織イメージング用のマルチ液浸対物レンズをオープントップ LSFM とデュアル倒立選択面照明顕微鏡 (diSPIM) にそれぞれ取り付けています。人間の前立腺とマウスの脳のサンプル。これは、LSFM 技術と透明化プロトコルが急速に進化していることを示していますが、横サイズが数センチメートル、体積が数 cm3 の大規模な人間の前立腺および人間の脳サンプルの高速 3D 透明化組織イメージングは、これまでのところ手の届かないところにあります。

この研究では、数立方センチメートルの人間の脳および前立腺がん（軸方向ホールマウント切片）組織サンプルを光学的に透明化し、ラベル付けし、画像化することを実証します。以前、我々は、アーカイブ成人ヒト脳組織の厚さ5 mmまでのスラブに効果的であることが示されたスケーラブルなクリアリングおよびラベル付けアプローチであるMASH（ヒト皮質のマルチスケール建築的染色）を紹介しました。ここでは、人間の脳サンプルを MASH 除去およびラベル付けして処理しました。さらに、当社は FFPE-MASH を導入し、FFPE ヒト前立腺サンプルの処理に初めて成功しました。次に、透明組織デュアルビュー選択的平面照明顕微鏡 (ct-dSPIM) を導入して、効率的な大型透明組織 LSFM 3D イメージングを実行します。これは、画像化ボリュームにおいて既存の透明 LSFM 人間の脳および前立腺サンプルの研究をはるかに上回ります。

当社の新しいアプローチにより、高速かつ調整可能な速度と解像度のトレードオフで、大容量の 3D イメージング、視覚化、定量化が可能になります。この方法の実現可能性を示すために、人間の脳と前立腺の LSFM イメージングについて説明します。当社では、ct-dSPIM を使用して、最大約 50 × 35 × 3 mm (>5 cm3) の人間の脳 (後頭葉) と最大約 40 倍のヒト前立腺がん切除サンプル (前立腺切除後の軸方向のホールマウント切片) を画像化します。 35 × 5 mm (約 7 cm3)。 ct-dSPIM イメージングにより、現在の方法と研究の拡張が可能になり、数 mm の厚さの軸方向のホールマウント前立腺切片の検査が可能になります。 ct-dSPIM イメージングをより大きな前立腺がんサンプルに適用すると、良性組織と腫瘍性組織の両方の形態に対する新しい 3D 洞察が可能になります。腫瘍に関するこの追加の 3D 知識は、ブロック全体の組織の視覚化を強化し、前立腺腺癌の構造のより良い理解につながり、前立腺癌の診断を改善する可能性があります。

モザイク4およびモザイク16を使用して、MASHで準備された人間の脳（図1〜5）と軸方向のホールマウント前立腺セクション（図6、7、補足図1、2）でマルチスケール3Dイメージングを大きなFoVで実行しました。特定の関心領域に対する中程度の FoV と高解像度。人間の脳サンプルのモザイク 16 (図 1、2、4) により、組織ブロック全体の比較的高速 (約 8 ～ 16 時間、約 1.7 cm3/h、16.4 μm 等方性、表 2) の概要スキャンが可能になりました。大きさは横5cm×3cm、厚さ3mm程度です。人間の脳サンプルの小さな ROI はモザイク 4 で画像化されました (図 3、4)。そしてモザイク0.5。 (図5)。これらの結果を順番に紹介し、議論します。

サンプルは約 1 回採取されました。後頭極の前方 6 mm (後方から前方方向の 3 番目の厚さ 3 mm のセクション)。左から右へ: ホルマリン固定、未染色サンプル、および MASH-NR 染色サンプル (後方および前方から)。透明なサンプルを背面から撮影したもの（形状は、前面と背面の両方に透明なサンプルの特徴を示しています。グリッド：最小の正方形 1 × 1 mm、太字の正方形 10 × 10 mm）。 Mosaic 16 取得による 16.4 µm の等方性解像度でのスライス全体の 3D 再構成 (スケールバー: 1 cm): 高密度に染色された細胞が豊富な層は、低倍率/大きな FOV の概要 (白い矢印) でも認識できます。 V1/V2 の境界は、概要と拡大された ROI の黒い矢印で示されます。 b 同じ後頭葉の連続した前部スライス。後頭極の前方 9 mm、パネルは (a) で説明したとおりです。

16.4 μm 等方性データの 3D レンダリングと直交面。厚さ 3 mm のサンプル全体の 50 µm MIP (XY: 緑、XZ: 赤、YZ: 青) の直交図。スケールバー: XZ、YZ、ボリュームレンダリングではそれぞれ 5 mm、XY 平面では 2.5 mm。

人間の一次視覚野付近の ROI をモザイク 4 で取得した 3D レンダリング (左上)。 50 μm MIP の直交ビュー (XY: 青、XZ: 緑、YZ: 赤) は、向きに関係なく皮質層を示します (白い矢印)。 XZ ビューのギザギザのエッジは、収集のエッジが組織の内側にある場合のデスキューによって発生します。 MIP の拡大 ROI (XY: イエロー、XZ: マゼンタ、YZ: シアン) は、等方的にサンプリングされた解像度とサンプル深部の画像とラベルの品質を定性的に示します。スケールバー: ボリュームレンダリング、XY、YZ 平面 3 mm。 XZ: 1.5 mm; 拡大ROIはそれぞれ0.5 mmです。

後頭葉スライス全体 (後頭極から前方向に向かって 3 番目の 3 mm の厚さのセクション) から取得したデータを 16.4 μm の解像度で示します (16.4 μm の体積、左側)。 2 つの脳回が解像度 4.1 μm (青) で、ピクセルサイズ 0.725 μm × 0.5127 μm × 0.5127 μm の異方性解像度で 0.5 μm の体積 (赤) で画像化されました。拡大されたインサートは、それぞれ 4.1 µm の体積 (マゼンタ) と 0.5 µm の体積 (オレンジ) で達成可能な有効解像度を示しています。 4.1 μm の体積には、ミニカラム (マゼンタで強調表示) を示すメゾスコピック構造が示されていますが、非常に密集した角細胞視覚野では、この解像度でより小さな個々の細胞を細胞クラスターから区別するのは困難な場合があります。 0.5 μm の体積により、頂端樹状突起と基底樹状突起の近位部分 (白い矢印) を含む単一細胞の識別が可能になります。スケールバー: 5 mm (16.4 μm 体積)、3 mm (4.1 μm 体積) および 0.25 mm (4.1 μm 体積、拡大パネル)、1 mm (0.5 μm 体積) および 0.075 mm (0.5 μm 体積、拡大パネル)。

a セルカウントに使用されるデータセットのボリュームレンダリング。 b ボリューム全体に対する手動レイヤーセグメンテーションの結果。色は次のとおりです。層 I はシアン、層 II は明るい赤、層 IIIa はオレンジ、層 IIIb は緑、層 IV マゼンタ、層 V は青、層 VI は濃い赤、白質は黄色です。ボリュームのセグメント化されていない部分の組織は損傷しており、層のセグメント化が不可能であったため、分析から除外されました。フィルタリングされたデータ (c) と自動的にセグメント化されたオブジェクト (d) の単一平面 (再スライスされたイメージボリュームの XY 平面)。セグメント化されたセルはランダムな色で表示されます。 e セル密度の推定値は、画像ボリューム全体にわたるレイヤーセグメントごとのセグメント化されたすべてのセルの総数から導出されます (同じレイヤーの複数の接続されていないセグメントの場合、カウントはプールされました)。 (b) に示されている色。一番左側のすべての画像のスケールバーは 500 μm、拡大された 2 つのパネルのスケールバーは 75 μm です。

左側には、処理パイプライン中のさまざまな段階のサンプルが示されています: 脱パラフィンおよび漂白後 (a、e)、染色後 (b、f)、および RI マッチング後 (つまり、透明、c、g)。右側には、Mosaic 16 データセットからの MIP が約 100 メートルにわたって表示されています。 50 μm は反転グレースケール (d、h) で表示されます。赤い丸は癌領域を示します（病理学者によって特定されたもの）。略語: AFS 前線維筋間質、CZ 中央ゾーン、U (前立腺) 尿道、PZ 周辺ゾーン、TZ 移行ゾーン。スケールバー: 3 mm。

図8e〜hのサンプルをここでは2Dで示します（a、赤いボックス内に示されているyz方向の完全な表面にわたる1つの層。緑（xz）と青（xy）で示される完全なサンプル厚さにわたる2つの直交セクションを含みます） ) ボックス。破線のボックスは腫瘍 (病理学者によって特定されたもの) を示します。このサンプルの腫瘍領域 (a の赤い破線のボックス) も、3D ボリュームレンダリングとして b に示されています。スケールバー: a、3 mm、b、1赤いグリッドの正方形 1 mm。

人間の脳の後頭葉の厚いスライス (図 1) を約 100 mm で採取しました。後頭極の 6 mm 前（後から前方向の 3 番目の 3 mm の厚さのセクション。図 1a および補足ビデオ 1 を参照）および同じ後頭葉の連続した前スライス（極の前約 9 mm 前）（図 1b）および補足ビデオ 2)。未処理のスライス (左端のパネル) の暗い変色は、死後に後頭部の血管に血液が蓄積したことが原因である可能性があります。染色されたスライスは、V1 のゲンナリの縞模様を示しています (図 1、矢印で示されています)。 MASH で精製されたサンプルの形態は、脱水、脱脂、屈折率 (RI) のマッチング後もよく保存されており、灰白質と白質の両方が非常に透明になります。 MASH 除去サンプルで観察された組織の収縮は比較的小さく、測定表面積の平均減少は 12% でした (補足図 3)。図1aの黒いアーティファクトは、3Dプリントされたイメージングチャンバー内でサンプルを固定するために使用されるホットグルーをイメージングする際の光散乱に由来します。これは、画像ボリュームの最も深い記録層が組織を超えてその下の接着剤にまで及ぶときに発生します。

マルチスケール ct-dSPIM イメージングには、図 1 に示す後頭葉サンプルを使用しました。まず、完全なサンプルの概要モザイク 16 スキャンを実行しました (図 1、2、4 および補足ビデオ 3 を参照)。図 1 は、等方性解像度 16.4 µm の Mosaic 16 データボリュームを使用した両方のスライスの 3D 再構成を示しています。スキャン方向は、長いイメージングスタックまたはストライプ (それぞれの深さと幅が 0.74 × 0.74 mm、長さが数センチメートル) の方向として認識でき、残りの 2 方向に並べて 3D サンプルを完全にカバーします。いくつかの皮質層は細胞密度の違いによって区別でき（図 1、白い矢印）、このメゾスコピック解像度では V1/V2 境界が層パターンの明らかな変化として見えます（図 1、黒い矢印）。

図 2 では、得られたボリュームカバレッジをよりわかりやすく視覚化するために、ボリュームレンダリングと直交最大強度投影 (MIP) が示されています。さまざまな軸（画像ビューアでラベル付けされているように、補足図4を参照）は、それぞれ緑（XZ）、赤（YZ）、青（XY）で示されます。 XY ビューには、ボリュームの Z 方向 (取得中のステージの X 軸に対応) における長い取得スタックのタイリングが表示されます。直交ビューでは、厚さ 3 mm のサンプル全体にわたるラベルの浸透と品質も強調表示されます。

モザイク 16 の概要を取得した後、V1/V2 境界に近い ROI で、より高解像度の 4.1 μm 等方解像度モザイク 4 スキャンが実行されました (図 3、4)。 50 μm MIP の直交図はそれぞれ緑 (XY)、赤 (XZ)、青 (YZ) のパネルで示され、向きに関係なく皮質層の違いを示します (図 3、矢印)。高倍率の挿入図 (XY: イエロー、XZ: マゼンタ、YZ: シアン) は MIP の ROI であり、定性的にほぼ等方性の解像度 (4.1 μm で等方的にサンプリングされますが、~8 μm の厚さのライトシートにより光学的に異方性) と高い解像度を示しています。サンプルの奥深くまで画像とラベルの品質を維持します (図 3)。この解像度では、小柱などのメソアーキテクトニックな皮質の特徴がよく見えるようになり（図 4 マゼンタのパネル）、モザイク 16 データでは見えない薄い皮質層も区別できます。後頭皮質の粒度にもかかわらず、より高い解像度により、最大の個々の細胞のいくつかを区別することも可能になります（図3、4、拡大パネル）。

定量的 3D 組織学に対する容積測定脳イメージングの可能性を実証するために、高解像度 0.5 μm (補足。ビデオ 4) 容積で自動細胞計数を実行しました (図 5; ボクセルサイズ: 0.725 μm × 0.5127 μm × 0.5127 μm)。目的は、さまざまな皮質層にわたる細胞密度を定量的に比較することでした。傾きを補正し、ステッチし、再スライスしたデータセットのボリューム全体 (図 5a) を、手動で異なる皮質層にセグメント化しました (図 5b)。層の分割は、損傷した組織を含むデータセットの 1 つの領域では満足に実行できませんでした。したがって、この領域は分析から除外されました（図 5b の色の付いていない部分）。その後、データは自動パイプラインで処理され、生の画像がフィルタリングされ、細胞体がセグメント化されました（図 5c、d）。 125μm3より大きく、対応する層セグメント内に完全に含まれるすべての細胞セグメントの数を使用して、各層の細胞密度推定値を導き出しました（図5e）。セル数は、複数の接続されていないセグメントを持つレイヤーに対してプールされました。予想通り、レイヤー I はセル密度が最も低く、1 mm3 あたりセグメント化されたオブジェクトが 60,000 個をわずかに超えていますが、このレイヤーの密度は予想よりも高くなります。層 II は、(予想通り) 層 I または IIIa よりも高い細胞密度を示しますが、層分割中の定性的な印象から予想されるよりも低い密度を示します。驚くべきことに、層 IIIb、V、および VI は層 II または IIIa よりも高い細胞密度を持っていました。目に見えて最も密度の高い層である層 IV も、データセット内で最も高い細胞密度を示し、1 mm3 あたり約 100,000 個のセグメント化されたオブジェクトがありました。これらの観測結果のいくつかは、部分体積効果によって少なくとも部分的に説明される可能性があります。自動セグメンテーションの結果を検証するために、同じデータセットに対して手動で細胞計数を実行しました。採用された自動セルセグメンテーション法では、手動カウントと比較して、平均36％のオーバーカウントが行われました（補足図5を参照）。この問題は、細胞を表すには小さすぎると考えられるセグメント (<125 µm3) を除外することで部分的には軽減されましたが、完全には軽減されませんでした。これらの小さな構造をフィルタリングした後、2 番目の自動化された結果は平均 17% オーバーカウントされました。自動セグメンテーションでは、細胞質全体または細胞質核と核小体の間に目に見える強度の差がある場合、自動セグメンテーションでは特に大きな細胞が複数の小さなオブジェクトにセグメンテーションされることが多いことが観察されました。

当社は、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) ヒト軸方向ホールマウント前立腺切片用に FFPE-MASH を開発しました。 MASH-NR ラベルを使用した MASH プロトコルが、さまざまな患者からの大きな前立腺がんサンプルに初めて適用されることに成功しました (アキシャルホールマウントセクション、図 6、7、補足図 1、2、補足ビデオ 5)。。したがって、我々は、脳以外のヒト臓器組織だけでなく、FFPE材料にもMASHを適用する実現可能性を実証する。さらに、MASH-NR で除去され標識された大規模な前立腺がんサンプルに対する高速 (1.7 時間/1cm3) モザイク 16 ct-dSPIM イメージングの実現可能性を示すことができました。大きなメゾスコピックの概要により、前立腺組織の形態の解剖学的説明と、組織病理学によって前立腺腺癌であることが確認された腫瘍性領域の可能性（図6d、h;赤丸で示す）の表示が可能になります。対応するヘマトキシリン・エオシン切片の顕微鏡評価により、腫瘍が篩状腺と融合した腫瘍腺からなり、高悪性度の前立腺腺癌と一致することが示された。前立腺のさまざまな層ゾーンおよび区画は、モザイク 16 ボリューム (図 6d、h)、すなわち線維筋間質 (AFS)、中心ゾーン (CZ)、周辺ゾーン (PZ)、移行ゾーンに分類できます。ゾーン（TZ）と尿道（U）。さらに、より高解像度のモザイク 4 スキャンにより、組織サンプル全体の腫瘍形態の検出が可能になり、病理学者は、アキシャルホールマウント（前立腺切除術）セクションのグリーソンスコアが 3 と 4 の両方であることを示唆しました（補足図 2）。

前立腺の軸方向ホールマウント切片を撮像した ct-dSPIM の 3D 視覚化（図 7、補足図 2）により、サンプルの厚さ全体にわたる直交断面で示される前立腺尿道のクロスカットの検出が可能になります。 (図 7a、緑と青のボックス、破線の挿入部分は腫瘍領域を示します)。図 7 に示す 3D ボリュームには、病理学者によって確認された、表面図の赤い破線で示される癌領域も示されています。腫瘍領域は、図 7a の直交断面図にも緑と青の破線で示されています。図 7b は、a の赤い破線のボックスに示されている腫瘍領域の 3D 拡大図を示しています。

今回我々は、大規模ヒト組織サンプルの透明な組織ライトシートイメージングのための新しいct-dSPIMプロトタイプと、ヒトの脳と前立腺軸方向ホールマウント切片（前立腺切除後）の両方へのアプリケーションを紹介します。我々は、MASH で調製された 19 アーカイブヒト後頭葉 (図 1 ～ 5) と前立腺切除術 (前立腺切除術、図 6、7) の両方を用いた ct-dSPIM イメージングの効率と実現可能性を実証することができました。 MASH-NR 標識を備えた FFPE-MASH プロトコル 19 は、図 19、20 に示すように、大きなホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 前立腺がんサンプルに初めて適用することに成功しました。図６および図７、ならびに補足図も参照されたい。これは、人間の脳以外の他の組織タイプに対する MASH の適用可能性を示すだけでなく、ホルマリン固定サンプルに加えて FFPE サンプルにも同様に重要であることを示しています。以前、我々は、使用するまで 4% PFA に保存されていたホルマリン固定されたアーカイブ人間の脳サンプルに MASH プロトコルを適用しました。 FFPE 組織は数十年にわたり研究や臨床応用で一般的に使用されてきたため、FFPE 材料に MASH プロトコルを使用すると、他の分野での応用が増える可能性があります。これは、臨床現場への潜在的な影響が大きいことを意味します。 FFPE 組織に対する MASH の修飾における最も重要なステップは、キシレン中での最初の脱パラフィンです。これは、厚いサンプル中のパラフィンが完全に溶解するのに十分な長さでなければなりません。したがって、事前の固定やパラフィン処理を行わずに新鮮なサンプルにこの技術を適用すると、このステップが省略される可能性があり、MASH 組織の処理時間が大幅に短縮されます。

等方性解像度 16.4 µm の Mosaic 16 取得の概要を補完するものとして、特定の関心領域内でより高い解像度のスキャンを取得しました。モザイク 16 は組織ブロック全体の概要を提供しますが、モザイク 4 (等方性解像度 4.1 μm) およびモザイク 0.5 (解像度 1 μm 近く) では、同じ組織の部分のより詳細な評価が可能です。このマルチスケールのデータ取得スキームを組み合わせることで、脳内の層、ミニカラム、細胞体などのさまざまなメゾスコピックな特徴の識別が可能になります（図 4）。これにより、大きなヒト組織サンプルの包括的かつ詳細な分析が可能になります。

モザイク 16 およびモザイク 4 データセットの等方性サンプリングは、スライスステップ長と横方向サンプリング分解能の √2 の関係に基づいており、軸方向分解能、つまり理論上のライトシートの厚さ約 8 µm によって光学的に制限されます。モザイクスキャンの全体的な取得速度は最大ステージスキャン速度によってのみ制限され、現在の範囲は、モザイク 16 の 1.7 時間/~1 cm3 から、モザイク 4 の 5 時間/~1 cm3、モザイク 0.5 の 15.8 時間/~1 cm3 です。。モザイク 16 オーバービュースキャンにより、5 mm の前立腺切除組織スラブ全体または 3 mm のヒト後頭葉組織スラブ全体の大量の高速視覚化が可能になりました。ここでは、2 時間 23 分 (モザイク 0.5)、3 時間 45 分 (モザイク 4)、および最大 8 時間 26 分の 5 cm3 の大きなオクローブサンプル全体 (モザイク 16; モザイク 16;図1～5）。図 6 に示すように、1 つの前立腺サンプルの 1 つの表面層モザイク 16 スキャンを取得する時間は 50 分でした。

将来的には、この方法により解像度の現在の制限が押し上げられる可能性があります。理論的には、有効光学解像度 ~1 µm のデュアルビュー ct-dSPIM イメージングを実行することが可能であり、主に細胞培養で実証されています。ごく最近、デュアルビューイメージングとその後のデコンボリューション処理の強力な高速化によるデュアルビューデコンボリューション処理を適用した、透明な組織でのデモンストレーションが出現しました18,20。ただし、画像形成プロセスに基づく深層学習を通じてデコンボリューションが実装されている最新の開発20でも、処理時間は 3 桁小さいボリューム (1.4 時間) の場合でも数時間 (2 ～ 3 時間) 程度です。 × 2.3 × 0.5 mm3)、これは、ここで紹介されている非常に大きなサンプルの処理には、最新の最新の方法でも何千時間もかかることを意味します。さらに、デュアルビュー取得では現在の取得時間が 2 倍になり、解像度の向上にかかる総時間コストが大幅になり、非常に大きな組織サンプルや将来の前立腺の臨床応用という関連状況では非現実的になります。さらに、この研究の目的では、（光学的に制限された可能な限り最高の解像度ではなく）十分な解像度で効率的かつスケーラブルな大規模 FoV イメージングを目的としており、費用対効果の分析と合計時間の観点からの実現可能性により、現在デュアルビューイメージングが行われています。不利。私たちの現在の研究には、0.725 μm × 0.5127 μm × 0.5127 μm の（サンプリングされた）解像度を持つ人間の脳（後頭葉）のサブボリュームの ct-dSPIM モザイクイメージングデータが含まれています。実際の光学分解能は低くなりますが (NA 0.4 の対物レンズで 8.0 μm × 0.8 μm × 0.8 μm 程度)、これらの単一ビューデータは妥当なデータレートで取得でき、単一細胞の検出などの意図された目的には十分です。人間の脳サンプルのセグメンテーションと定量的な細胞数。前立腺がんサンプルでは、16〜0.5μmの範囲のサンプリング解像度により、臨床調査に十分な画質で効率的な3D腫瘍イメージングが可能になります（図8、9、補足図4、5）。将来の研究については、機会（例えば、細胞内構造またはニューロン軸索または樹状構造の細胞内分解能）と、現在の取り組みをより高い近等方性分解能と組み合わせる可能性があると考えています。このような取り組みでは、デュアルビューのデコンボリューションアプローチとシングルビューのアキシャルスキャンアプローチの両方が、大規模なサンプルの脳および前立腺のイメージングに対して考慮に値するでしょう21、22。

ct-dSPIM セットアップで日常的に使用される、より大きなイメージングチャンバーの 3D レンダリング。チャンバーの容積は 0.9 リットル (20 cm × 15 cm × 3 cm) です。チャンバーは上面図 (上)、斜視図 (中央)、および側面図 (下) で示されています。 b PP に SLS で印刷されたチャンバープロトタイプ。 c Somos®WaterShed XC 11122 で SLA を印刷したチャンバーのプロトタイプ。サンプルはスライドガラスの上に取り付けられ、チャンバーから RIMS が漏れるのを防ぐためにシリコンで密閉されています。

a 放射されたレーザー光はコリメートされ、電子調整可能 (ETL) レンズ (C60-TUNELENS-100、ASI) を通過してライトシート「スキャナー」 (MM-SCAN-1.2、ASI) に入ります。 ETLf により、サンプルにおけるビームウエストの軸方向の位置を電子的に制御できます。凡例は次のページに続きます。スキャナには 2D MEMS ミラーが含まれており、カメラ画像ごとに 1 回サンプル全体にガウスビームを走査して、「仮想」または「デジタル」ライトシートを形成します。 MEMS ミラーのもう一方の軸は、検出対物レンズの焦点面と一致するライトシートを調整するために使用されます。 b 結像経路は 2 つの可能な光経路 (経路 A と B) です。各パスでは、スキャナが片側にあり、イメージングピエゾとカメラが反対側にあります。図に示すように、光はダイクロイックミラーや発光フィルターなどのさまざまなコンポーネントを通過します (励起経路: 青色の点線、発光経路: 緑色の実線)。フィルタリングされた蛍光は、チューブレンズ (C60-TUBE-B、ASI; f = 200 mm) によって 2048 × 2048 ピクセルの sCMOS カメラ (ORCA-Flash4.0 V3、浜松ホトニクス) 上に集束されます。

この論文で示したボリュメトリックイメージングの有望な側面の 1 つは、人間の皮質の大部分を高い空間解像度でイメージングできるという事実であり、これにより広範な視野にわたって細胞構造を調査できるようになります。将来的には、導出された細胞数は 2D 切片からの外挿ではないため、原理的には立体的な偏りなく、さまざまな領域や層の細胞密度を定量化できる可能性があります。ただし、現時点では、立体学的に導出された細胞密度の推定値は十分に確立されているため、依然としてゴールドスタンダードと考えるべきです。したがって、3D セグメンテーションとカウントの結果が文献の立体データとどのように関連しているかは興味深いことです。残念ながら、人間の二次視覚野における細胞密度の推定値はまれです。等方性分別装置 23 などの立体学的手法で計算された推定値は、通常、脳組織 1 グラムあたりの細胞数で示され、体積推定値に変換するのは簡単ではありません。

Leuba と Garey24 は、V2 領域の平均細胞数が 1 mm2 の皮質領域の下で 14,7600、つまり 63,700 細胞/mm3 であることを発見しました。すべての層にわたるデータセットの総細胞密度は 81,903 細胞/mm3 でした。私たちのサンプルのサイズの観察された変化は比較的小さいため、私たちのデータにおけるこれらのより高い細胞数は、除去によって引き起こされる組織の収縮から生じる可能性は低いと考えられます（補足図3を参照）。これは、30%14 または最大 50%25 というはるかに高い組織収縮を示す他の溶媒ベースの組織除去方法と比較した場合に特に当てはまります。自動細胞セグメンテーションで観察された平均 17% の過剰カウントを考慮すると (補足図 5)、補正された細胞数 67,980 細胞/mm3 は、Leuba と Garey に比較的近い値です。個々の層に焦点を当てると、層 IV の細胞密度は一般に、97,529 細胞/mm3 (当社のデータ) 対 10,7316 細胞/mm3 で、Leuba および Garey とよく一致しています。ニューロン数と報告されたニューロン/グリア比を追加し、これら 2 つの集団を追加しました。これは、領域全体の全細胞集団密度のみが提供されますが、層固有のテーブルには提供されないためです。残念なことに、Leuba と Garey はすべての層の密度をリストしていないが、粒内層 II と III、および粒内層 V と VI を一緒に報告している。彼らは、顆粒上細胞密度が 63,558 細胞/mm3 であると報告しています。これは、IIIa 層で発見された細胞数 (66,884 細胞/mm3) と同様です。ただし、層 II (71,599 細胞/mm3) と層 IIIb (82,712 細胞/mm3) は両方ともより高い細胞数を示し、したがって、顆粒上細胞密度の合計も 77,807 細胞/mm3 と高くなります。前述したように、IIIb 層で観察された非常に高い細胞密度は、その層の密度が低く、よりまばらで大きな錐体ニューロンがあるように見えることを考えると、驚くべきことでした。この不一致の説明としては、不完全な手動レイヤーセグメンテーションから生じる、非常に高密度の隣接レイヤー IV による部分体積効果が考えられます。もう1つの可能性のある寄与要因は、細胞質容積に対して強度の違いを示す場合に、大きなニューロンを複数のセグメントに分割する自動細胞セグメンテーションの観察された傾向である可能性があります（補足図5を参照）。大きなセルを複数のセグメントにセグメント化するこの傾向により、125 µm3 未満のセグメントが除外された後、自動セルセグメント化の平均で約 17% の過剰カウントが発生しました。この過剰カウントを考慮すると、顆粒上細胞数の合計 64,580 細胞/mm3 は、Leuba と Garey にかなり近い値になります。 V 層の高密度 (88,781 セル/mm3) も同様に予想外であったため、これらの要因の両方が、V 層のデータで観察されたより大きな細胞密度を説明する可能性があります。部分体積効果は、層 VI の同様の高密度 (81,904 細胞/mm3) を説明できませんでしたが、大きな細胞体の分割が依然として過剰カウントにつながる可能性があります。したがって、我々の結合した顆粒内細胞密度は、Leuba と Garey によって報告されたものよりも大幅に大きくなります (86,579 細胞/mm3 対 53,658 細胞/mm3)。自動セグメンテーションの過剰カウントを考慮したとしても、観察された顆粒内細胞密度は Leuba および Garey の細胞密度 (71,861 細胞/mm3) よりも高くなるでしょう。セグメンテーションの品質が向上すると、これらの不一致の少なくとも一部が軽減され、この領域のセル推定値が立体学的推定値に近づく可能性があります。趙ら。クリアされた人間の脳の体積データに対して深層学習ベースのセグメンテーションを使用します14。この論文の著者らは、異なる領域を調査していないにもかかわらず、Leuba および Garey またはここで報告された研究よりもはるかに高い密度 (16,2000 ～ 21,6000 細胞/mm3) を報告していることに注意する必要があります。

これらのアプローチ全体での細胞数の変化を説明できる可能性のある側面の 1 つは、組織学的処理中に導入される収縮の量でもあります。この研究で使用された組織除去アプローチは Zhao らとは異なるため、 26 に示されており、比較的小さな収縮（Zhao et al. で報告されている 30% と比較して 12%。補足図 3 を参照）を生成することが知られているため、これがこの矛盾の少なくとも一部を説明できる可能性があります。非常に洗練された細胞セグメンテーションパイプラインを適用した最近発表された別の研究 27 では、ニューロン密度が 14,000 ～ 24,000 ニューロン/mm3 (Leuba および Garey のニューロン/グリア比を適用すると約 28,000 ～ 47,500 細胞/mm3 を意味します) という、再び大きく異なる結果が得られました。この研究で使用される除去アプローチは、組織を拡張する水性組織除去プロトコルです。これにより、推定値が低くなったことが説明できる可能性があります。さらに、神経細胞集団を識別するために、分子量の小さいより一般的な有機色素ではなく、抗体標識に依存していることも、観察された差異の一部を説明している可能性があります。最後に、Leuba と Garey によって導入された立体的な 2D 法では、切片上の 2D 細胞数を大量の組織に外挿するときに系統的な過小カウントが発生する可能性もあります。

従来の前立腺がんの組織病理学的診断、特に多巣性腫瘍の診断は困難です3。さらに、コア生検全体の評価、またはサンプル全体の切除には最大 10 日かかりますが、これは非効率で非常に費用がかかり、標準治療の臨床現場ではほとんど行われません。したがって、地元の病院の腫瘍学者や病理学者と協力して、前立腺のモザイク ct-dSPIM イメージングを行うことで、将来の癌診断に新たな道が開かれる可能性があります。

最近の研究では、自家製のオープントップ LSFM システムを使用して、厚さ 1 ～ 2.5 mm のヒト前立腺コア針生検を検査するための LSFM の有用性が実証されました。代わりに、ここでは、厚さ 5 mm の完全な軸方向ホールマウント前立腺切片を、モザイク 16 および 4 ct-dSPIM スキャンの両方で約 1 秒以内に検査しました。 1〜5 時間で、時間効率が良く、生検全体の比較的迅速な概要評価が可能になります（図 6、7、補足図 1、2、補足ビデオ 5）。さらに、これにより、非常に多数のアーカイブ前立腺がんサンプル (1 日あたり最大 8 サンプル) の遡及的検査が可能になります。大容量 3D イメージングにより、より深い層や領域、および厚い前立腺切除サンプル全体にわたる腫瘍の視覚化が可能になります。これにより、良性だけでなく癌性の前立腺組織構造についても新たな洞察が得られる可能性があります。現在までのところ、3D 前立腺構造に関する現在の情報は限られており、MRI 検査に基づいているため、腺形成、内腔、上皮層を含む臓器全体の詳細かつ高解像度の分析は不可能です。しかし、現在の組織病理学的実践において最も頻繁に使用される手法は、古典的な明視野顕微鏡法と厚さ 5 μm の組織切片の 3 ～ 4 レベルの組み合わせであり、2D 組織情報が得られます。これらは主に組織ブロックの深いレベルに存在するため、これは腫瘍の過小評価または多巣性癌の場合の偽陰性診断につながる可能性があります。したがって、病理学者や腫瘍学者にとって、厚さ 5 mm の患者の前立腺サンプルを使用して、詳細な前立腺腫瘍構造についての新しい 2D および 3D 高解像度の大容量洞察を得ることが非常に価値があります（図 6、7、補足図 1、2）。 ; 補足ビデオ 5)。これらのより厚い前立腺がんサンプルの定量的ライトシートイメージング (前立腺切除術) により、診断の精度を向上させることができます。この研究の結果は、きれいな組織のct-dSPIMイメージングの私たちの方法で腫瘍を検出することが可能であり、腫瘍過程の検出や正常な良性前立腺組織の区別を含むグリーソンスコアのグレーディング（補足図2）も可能であることを示しています。腺癌から。モザイク 16 (図 6、7) とモザイク 4 スキャン (補足図 1、2、補足ビデオ 5) の両方により、異なる患者の軸方向ホールマウント前立腺切片の腫瘍を検出できました。

さらに、ct-dSPIM でのモザイク取得により、大規模な前立腺サンプルの高速 3D 検査が可能になるため、約 1 秒間の高スループットのイメージングパイプラインの開発が可能です。一度に 1 つのサンプルのみを画像化した場合、10 日間で 20 のサンプル。前立腺の標準的な処理には、少なくとも 24 時間の固定、その後のグロシングおよび真空浸潤組織プロセッサーでの処理 (少なくとも 24 時間) が含まれます。したがって、このステップは、提案された MASH および ct-dSPIM アプローチを新鮮な切除標本に適用することによって省略される可能性があります。これは臨床実践に多大な影響を及ぼし、診断ワークフローを加速する可能性があります。イメージングコンテナのサイズを考慮すると (図 8 を参照)、複数のサンプルを ct-dSPIM に並行して収容できるため、イメージングがさらに効率化される可能性があります。これにより、知識が迅速に収集され、腫瘍の変動と局在化の統計と定量化に十分なデータを提供しながら、疾患のさまざまな段階のさまざまな患者サンプルに対して実行可能になります。

要約すると、私たちの方法は、ヒト前立腺がん切除サンプルの画像処理を改善する可能性があります。従来の方法では時間とリソースの点で不可能であった、サンプル全体の詳細な新しい 3D 視覚化を提供します。また、前立腺画像処理の高速化にもつながる可能性があり、これは臨床診療の効率化にメリットをもたらすだけでなく、（アーカイブ組織）研究の新たな機会にもつながる可能性があります。さらに、特に多発巣癌において、より正確な診断を提供できる可能性があります。

我々は、ct-dSPIM システム上で大規模モザイクイメージングを実証し、非常に広いヒトサンプル範囲に対して他の既存のライトシート顕微鏡の限界を克服できることを示しました 16,28。 ct-dSPIM は、最近公開された他のセットアップとは異なり、対物レンズが上からイメージング液体に直接浸される斜めの幾何学形状を使用しています 17,28。以前のシステムでは、対物レンズはサンプルの下に配置されていたため、チャンバーのガラス底を通してイメージングを行う必要がありました。ガラスや追加のレンズを通した画像化によって作動距離 (WD) が実質的に失われるため、サンプルサイズはこの形状によってさらに制限される可能性があります。他のシステムは、より標準的な（つまり、斜めではなく直立した）ライトシート形状を使用し、非常に大きなサンプルを画像化するためにライトシート自体を生成する新しい方法を使用します11。これらのシステムでは、最も透明なサンプルであってもある程度の光散乱が発生し、組織の深部の画質が低下するため、横方向の範囲は最終的に制限されます。これは、ct-dSPIM のような斜めのセットアップを使用することで回避でき、サンプルの横方向のサイズは顕微鏡ステージの移動範囲によってのみ制限されます。

円筒レンズ (デジタル走査レーザーライトシートではなく) スキャナーやステージタイリング軌道調整 (蛇行軌道など) などのさらなるハードウェアの変更により、イメージング速度がさらに 2 ～ 4 倍向上する可能性があります。これにより、死後の健康な脳組織と病気の脳組織の研究において全く新しい規模が開かれることになる。より高い NA や倍率の対物レンズ、軸方向に走査されるライトシートアプローチなど、ct-dSPIM セットアップのその他のハードウェア変更により、視野や撮像時間を犠牲にしてイメージングの解像度を向上できる可能性があります。同じサンプルサイズの画像。これらの将来の開発により、脳のより広い部分のさまざまな構造やマーカーを画像化できる可能性があり、健康な人間と病理学的な人間の神経解剖学的構造についての新しい洞察が得られる可能性があります。

さらに、脳血管構造の小分子標識や、ct-dSPIM による大規模サンプルイメージングにも適した抗体標識戦略など、さらなる標識オプションを確立することで、可能性がさらに広がる可能性があります。将来的には、組織処理 (MASH クリアリングとラベル付け) から ct-dSPIM モザイクイメージングとデータ分析までのパイプライン全体が、側頭葉全体や後頭葉全体など、脳および脳領域のより広い部分に拡張される可能性があります。厚さ5mmのスラブ。現在のセットアップでは横方向のサンプルサイズがはるかに大きくなる可能性があるため、このサイズのサンプル用の組織処理パイプラインが確立されていれば、脳全体のスライスを画像化することも可能です。

ct-dSPIMでの大規模収集のアプリケーションケースとしてMASHで調製されたヒトと前立腺の使用を実証しましたが、この技術は他のさまざまなヒトおよびヒト以外の哺乳類の組織にも拡張できる可能性があります。これにより、MASH と ct-dSPIM イメージングの組み合わせが、解剖学的および病理学的研究全般にとって強力なツールとなる可能性があります。

結論として、ct-dSPIM が非常に大きなヒト組織サンプルの効率的な定量的 3D ライトシートイメージングのための優れたツールであることを実証できました。我々は、cm3 スケールの光学的に透明化された死後の人間の脳 (後頭葉) および前立腺がんサンプル (軸方向ホールマウント前立腺切片) への ct-dSPIM イメージングの適用を示すことができました。迅速な概要とそれに続く特定された ROI の高解像度モザイクスキャンにより、後頭葉サンプルでのヒト脳細胞計数と、軸方向ホールマウント前立腺切片でのグリーソンスコアのグレーディングを実行できました。将来的には、ct-dSPIM イメージングは、より広範な基礎的および臨床的な大きな組織サンプルの研究に適用される可能性があります。

人間の後頭葉サンプルは、当科の献体プログラムの 3 人の人体ドナー (ドナー 1: 男性、98 歳、ドナー 2: 女性、101 歳、ドナー 3: 女性、90 歳、それぞれ既知の神経病理学的疾患なし) から採取されました。マーストリヒト大学 (UM) で解剖学および発生学の博士号を取得。ドナー 2 および 3 からの組織を収縮評価に使用しました (補足図 3)。組織提供者は、科学研究と教育のための人骨の使用に関するオランダの法律（「Wet op de Lijkbezorging」）で規制されている教育と研究の目的で遺体を提供することに、十分な情報と書面による同意を与えていた。したがって、ドナーがまだ健在であるときに提出された手書きの署名済み法典は、オランダ、マーストリヒトのUMの解剖発生学部門に保管されています。人間の脳は、まず大腿動脈を介した全身灌流によってその場で固定されました。 0.2 bar の圧力下で、体は 10 l の固定液 (1.8 vol % ホルムアルデヒド、20% エタノール、8.4% グリセリン水溶液) で 1.5 ～ 2 時間以内に灌流されました。その後、遺体は固定後、同じ液体に浸されて少なくとも 4 週間保存されました。その後、頭蓋冠の解剖によって脳サンプルを回収し、0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中の 4 % パラホルムアルデヒド中で 14 ～ 30 か月間保存しました。

すべての前立腺切除標本は、2007 年から 2015 年の間にマーストリヒト大学医療センター病理学部門 (MUMC+) のアーカイブから取得されました。この出版物では、3 つのサンプルが使用されました。この研究は、オランダのマーストリヒト大学医療センターの医療倫理審査委員会によって承認されました（2020–1537）。すべての標本は、個人データと組織を用いた観察研究に関するオランダの行動規範 (2004)29 のプロトコルに従って収集および研究されました。検体は診断目的で受け取られ、国内および国際的な推奨に基づく内部標準操作手順に従って処理されました。前立腺標本の軸方向全体の厚さは 3 ～ 5 mm の範囲です。つまり、サンプルは最初に 4% 緩衝ホルマリンで 24 時間固定され、さらに真空浸透プロセッサ Tissue Tek VIP6 (Sakura Finetek USA, Inc、米国カリフォルニア州トーランス) で処理され、標本は浸漬して脱水されました。純粋な水を含まないアルコールに達するまで、濃度を増加させた一連のエタノール溶液。このステップに続いて、キシレン溶液中で組織を除去し、その結果、標本がパラフィンに浸潤した。最後に、HistoCore Arcadia Embedding Center (Leica Microsystems BV、アムステルダム、オランダ) の通常の病理診断手順に従って、標本をパラフィンに包埋しました。

以前の出版物19で説明したように、MASH-NRプロトコルを使用して、すべてのサンプルを透明にし、ニュートラルレッドでラベル付けしました。標準的な前立腺臨床プロトコルではホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) サンプルが生成されたため、FFPE 前立腺サンプルを処理するために修正された MASH プロトコル (FFPE-MASH-NR) が使用されました。 FFPE-MASH-NR プロトコルでは、標準的な MASH 除去の前に前立腺サンプルを脱パラフィンする必要がありました。この目的のために、サンプルはサンプルサイズに応じてキシレン中で 3 ～ 7 日間インキュベートされました (各サンプルには約 200 ml のキシレン容量が使用されました)。パラフィンブロックは、インキュベーション前に可能な限り手動でトリミングされました。その後、サンプルをキシレン 100 ml、100%、70%、50% エタノール (EtOH) で 2 回、最後に PBS でそれぞれ 1 時間再水和しました。再水和したサンプルは、使用するまで 4% 緩衝 PFA 溶液中に保管しました。 FFPE-MASH によるサンプルの透明化と標識は、脳サンプルについて以下に説明するのと同じ手順に従いました。これらすべてのステップ中、前立腺サンプルは個別のガラス容器に保管され、少なくとも 50 ml のそれぞれの溶液中でインキュベートされました。容器は常にシェーカー内に保管した。

以前の出版物19で説明したように、MASH-NRプロトコルを使用して、すべてのサンプルを透明にし、ニュートラルレッドでラベル付けしました。つまり、サンプルは、室温 (RT) で 20、40、60、80、および 100% メタノール (MeOH) の水性混合物 (v/v) でそれぞれ 1 時間、および 4 ℃で 100 % MeOH で 1 時間脱水されました。 ℃。その後、サンプルを、新しく調製した 5 % H2O2 MeOH 溶液 (4 °C) で一晩漂白しました。次にサンプルを 80%、60%、40%、20% MeOH でそれぞれ 1 時間再水和し、リン酸緩衝食塩水 + 0.2 % (v/v) Triton X-100 pH 7.4 で透過処理しました。続いて、濾過したばかりの５０％二亜硫酸カリウム（ｗ／ｖ）水溶液中で１時間インキュベートし、５回素早くすすぎ、続いて蒸留水で１時間洗浄した。細胞構築の標識は、pH 4 のリン酸-クエン酸緩衝液 (別名 McIlvain 緩衝液)30 中の 0.001% ニュートラルレッド溶液中で 5 日間実施しました。インキュベーション時間の半分後にサンプルを裏返しました。標識後、サンプルをMcIlvain緩衝液pH 4で2×1時間洗浄し、20%、40%、60%、80%、2×100% MeOHでそれぞれ1時間脱水した。脱脂は、６６％ジクロロメタン（ＤＣＭ）／３３％ＭｅＯＨ中で一晩実行され、続いて１００％ＤＣＭで２×１時間実行された。最後に、サンプルを屈折率整合溶液 (RIMS) として桂皮酸エチル (ECi) とともにインキュベートしました。すべてのステップは室温で実行されました。

後頭葉全体の複数の冠状スライスのインキュベーションには、脱脂中に使用される有機溶媒との適合性を提供するために、ポリエチレンまたはポリテトラフルオロエチレン製のスペーサーを備えた直径 8 cm のガラス瓶を使用しました。プラスチックのスペーサーが組織に痕跡を残さないようにするために、濾紙片を組織の上下に置きました。ガラス瓶は上記の各ステップで完全に満たされ（体積約 200 ml）、処理全体の間、溶液はマグネチックスターラーで常に撹拌されました。

MASHによって引き起こされる組織収縮を評価するために、3人の異なるドナーからの合計13枚の脳スライスの表面積を測定しました（サンプル「Occlobe16」 n = 4、図3〜7に示すように同じドナーからの組織。サンプル「Occlob10」 n = 6、サンプル「Hemi6」 n = 3、後頭葉の前の冠状スライス）。「Occlobe10」スライス (n = 6) は、独立したプロジェクトのために画像化された別の葉から採取されました。「Hemi6」スライス (n = 3) は、マーストリヒト大学の解剖学および発生学部から提供された、事前に切片化された材料から採取されました。これらは手動で約 1 メートルの冠状脳切片を切断します。 MASH 処理の前に、厚さ 1 cm をさらにスライスして厚さ 5 mm のサンプルにしました。スケーリングされたデジタル画像は、クリアリング前とクリアリング手順の終了時、RI マッチング後に撮影されました。組織スライスの周囲はフィジーで手動でセグメント化され、透明化の前後の領域が測定されました（補足図3）。

ct-dSPIM イメージングでは、大型のカスタマイズされた (20 × 15 × 3 cm、体積約 900 mL) イメージングチャンバー (図 8) を ECi 耐性の流域材料 (Somos®WaterShed XC 11122) またはポリプロピレン (PP) で 3D プリントしました。）。プリンティングは、流域プリントについては SKM Rapid Modeling bv (オランダ、ヘルモンド) のステレオリソグラフィー (SLA) によって実行されるか、PP チャンバーについては Materialsize NV (ベルギー、ルーベン) による選択的レーザー焼結 (SLS) によって行われました。チャンバーのイメージング領域には、光の反射を減らすために底部として 178 × 127 × 1.2 mm のガラススライド (Ted Pella Inc.、米国レディング) が装備され、純粋なシリコンシーラントで接着されました。すべてのサンプルは、ホットグルー (Rapid AB、Hestra、スウェーデン) を使用して、3D プリントされたイメージングチャンバー内のスライドガラスに貼り付けられました。次に、イメージングチャンバーを少なくとも 500 ml の ECi 溶液 (RI 1.56) で満たしましたが、サンプルサイズに応じてさらに多くの量が満たされました。

ct-dSPIM 顕微鏡は、厚さが最大 5 mm、横方向のサイズが XY ステージの移動とイメージング時間制限によってのみ制限される、非常に大きな透明な組織サンプルの 3D イメージングを目的としています。これは diSPIM (デュアルビュー倒立選択的平面照明顕微鏡) システム 31 から派生し、Applied Scientific Instrumentation Inc. (ASI、ユージーン、米国) と共同開発されました。 ct-dSPIM システムの光学図を図 9 に示します。レーザー光源 (コヒーレントオビス、レーザーライン 552 nm LS 40 mW レーザーシステム: ファイバーピグテール: FC) は、数値口径（NA）は0.12。放射されたレーザー光はコリメートされ、電子調整可能 (ETL) レンズ (C 60-TUNELENS-100、ASI) を通過してライトシート「スキャナー」 (MM-SCAN-1.2、ASI) に入ります。調整可能なレンズにより、サンプルでのビームウエストの軸方向の位置を電子的に制御できます。スキャナには 2D マイクロ電子機械ミラー (MEMS) が含まれており、カメラ画像ごとに 1 回サンプル全体にガウスビームを走査して、「仮想」または「デジタル」ライトシートを形成します。 MEMS ミラーのもう一方の軸は、検出対物レンズの焦点面と一致するように l を調整するために使用されます。走査ビームは、マルチイマージョン照明対物レンズ (#54-10-12、特殊光学/応用科学機器 (ASI)) の後焦点面に中継されます。

蛍光は同一のマルチ液浸検出対物レンズ (#54-10-12、特殊光学/ASI) によって収集され、横方向の解像度は約 1 μm になります (イメージングソリューションの RI に応じて)。この対物レンズは、1.33 ～ 1.56 の屈折率 (RI) 範囲と 12 mm の作動距離 (WD) に対応しています。開口数 (NA) と有効焦点距離 (EFL) は両方とも屈折率によって変化しますが、ECi の場合、NA は約 0.43、EFL は 11.2 mm、倍率は 17.9 倍です。最大撮像深度は 5 mm で、2 つの対物レンズの物理的クリアランスによって制限されます。対物レンズは、2 つの対物レンズ (SPIM-DUAL-K2、ASI) を一致させるための手動微調整を含む機構によって保持されます。

励起パスと検出パスは、ポリクロイックミラー (ZT488/543/635rpc-UF2、Chroma) と 3 つの発光フィルター (ET519/26 m、ET576) を備えた電動フィルターホイール (FW) (FW-1000-8、ASI) 上で結合されます。 /31 m; ET655lp、Chroma)、3 色のイメージングが可能です。この作業では、非常に大量の効率的な単色イメージングを目的とし、ET576/31 m 発光フィルターを使用した中間カラーバンドのみを使用しました。フィルタリングされた蛍光は、チューブレンズ (C60-TUBE-B、ASI; f = 200 mm) によって 2048 × 2048 ピクセルの科学相補型金属酸化膜半導体 (sCMOS) カメラ (ORCA-Flash4.0 V3、浜松市) に集束されます。。チューブレンズは、カメラの 2048 ピクセルにわたって 0.74 mm の水平視野を備え、RI 1.56 で 0.3625 μm/ピクセルのナイキストサンプリングを提供します。

画像ストリップは、ステージスキャン（つまり、XYステージを使用してサンプルが固定ライトシートを通して移動される、補足図4）、電動XYステージ（MS-8000、スキャンに最適化）を使用した横/縦タイリングの組み合わせで収集されます。 ) および電動 Z アクチュエーター (フォーカシングトランスレーションプラットフォーム (FTP-2050)、ASI)。取得速度は、10 ms の露光時間で >108 ボクセル/秒です。ステージスキャンファームウェアは、各イメージストリップの再現可能な開始位置 (<1 μm) を保証する内部 (存続時間) TTL トリガーを発行します。 ASI タイガーコントローラー (TG-1000) コントローラーには、電動ステージ、MEMS ミラー、調整可能なレンズ、カメラとレーザートリガー用の制御電子機器が含まれています。初期段階のスキャントリガーに基づいて、各画像ストリップ中にこれらすべての要素をミリ秒未満の精度で同期します。

顕微鏡は、無料のオープンソース顕微鏡制御ソフトウェア 32 である µManager 1.4.22 によって制御されます。 µManager の ASI diSPIM プラグインは、顕微鏡の位置調整と、収集のセットアップと実行の両方に使用されます。ステージコントロールプラグインは、両方の ETL (V、左、W、右) で静的な ETL 調整を行うために使用されます。

一部のアプリケーションでは、単一のビューまたはスタックからの 3D 情報で十分です。ただし、ここで対象とする大規模なサンプルイメージングの場合、通常、x方向にスキャンされた長い画像スタックステージと組み合わせて、yzモザイク取得に沿って広範なタイリングが使用されます（補足図4）。デュアルビューシステムとしての ct-dSPIM には、2 つの対物レンズの役割を逆転させて、イメージング時間を 2 倍にして垂直方向から別のスタックを収集できるというさらなる利点があります。ただし、ここでは 1 μm を超える解像度の高速大容量イメージングに重点を置いているため、この研究ではデュアルビューイメージングモードは採用されていません。

MASH-NR 標識されたヒトの脳および前立腺組織サンプルは、1 mW (OBIS) の 552 nm レーザーラインと 10 ms の露出時間で画像化されました。両方のサンプルについて、立方センチメートルスケールの組織スライス全体の概要スキャンが、16.4 μm の等方性サンプリング解像度 (モザイク 16 取得と名付けられています) で実行されました。さらに、人間の脳サンプルについては、(a) 組織スライス全体の Mosaic 16 概要スキャン、(b) 選択された大きな FoV (約 15 × 17 × 3 mm) の収集から構成されるマルチスケールスキャンを実行しました。 4.1 µm の等方性サンプル解像度 (モザイク 4 と呼ばれる) と (c) 特定の関心領域の高解像度 (0.725 µm × 0.5127 µm × 0.5127 µm) で、より小さい FoV (約 5 × 10 × 3 mm) の取得 (モザイク 0.5 と呼ばれます）。イメージング速度は、どの Mosaic イメージングが導入されているかによって異なります。高速モザイク 16 オーバービュースキャンの場合、イメージング速度は 1.7 時間/1cm3 であり、より高解像度の ROI モザイク 4 およびモザイク 0.5 スキャンの場合、イメージング速度はそれぞれ 5 時間/1cm3 および 15.8 時間/1cm3 です (表 2)。

Mosaic 16 スキャンは 16.4 µm の等方性メソスコピックサンプリング解像度で組織ブロック全体の 3D データセットを提供しますが、Mosaic 4 と Mosaic 0.5 はそれぞれ 4.1 µm とほぼ 1 µm の等方性サンプリング解像度で関心領域を表示します。取得時のスライスステップは、モザイク 16 の場合は 11.60 μm、モザイク 4 の場合は 2.90 μm であり、これにより、√2 スケーリングによるデスキュー後の等方性サンプル解像度が得られます (補足図 4)。生のデータセットは、次のようにさらにダウンサンプリングされました。モザイク 16 の場合は面内 16 倍 (32 × 45 ピクセル)、モザイク 4 の場合は 4 倍 (128 × 186 ピクセル)、顕微鏡のステップサイズに一致させて等方性を生成します。デスキュー後の等方性 16.4 μm (モザイク 16) または 4.1 μm (モザイク 4) のデータセット。 Mosaic 0.5 では、スライスステップは 0.363 μm で、2 × 2 の面内ダウンサンプリングが実行されました。これらのパラメータを使用すると、Mosaic 16 スキャンは可能な限り最高の速度で取得され、ステージの最大スキャン速度によってのみ制限されます。モザイク 4 スキャンは、約 8 μm の軸方向光学分解能 (つまり、理論上のライトシートの厚さ) のナイキストサンプリングに近い値で取得され、モザイク 0.5 スキャンは、約 1 μm の横方向面内光学解像度のナイキストサンプリングに近い値で取得されます。解決。 ct-dSPIM で画像ボリュームを取得する場合、ステージスキャンを使用して画像面 (ライトシート) 内でサンプルを移動しますが、軸は直交 XYZ 座標に対応しません。代わりに、カメラの Z 軸はステージのスキャン方向に対して 45° の角度になります (補足図 4)。したがって、ステージスキャン画像取得では、非直交軸を持つ歪んだ平行六面体のスタック形状が得られ、直交軸系で見ると歪んでしまいます。デスキュー操作により、歪んだ平行六面体スタックが従来の直交軸を持つ長方形スタックに変換されます (補足図 1b)。この研究の図で使用される軸ラベルは、組織の3〜5 mmの厚さに沿ったx軸と画像スタックの走査方向に沿ったz軸を備えた画像ビューア軸ラベルです（補足図4c）。

ダウンサンプリングは、Fiji33 のスケーリング機能を使用して画像を最終ピクセルサイズにスケーリングすることによって実行されます。ダウンサンプリングにより、後頭葉スライス全体のモザイク 16 スキャンのデータセットのサイズが約 3 ～ 4 GB に削減されました。このダウンサンプリングされたデータは、FIJI PlugIn BigSticher34 でさらに処理されました。まず、「(de)skewing」オプションを使用してデータのスキューを補正し、それ以上のダウンサンプリングを行わずに、位相相関オプションを使用してステッチしました。次に、ステッチされたデータが 16 ビット tif ファイルとして再保存されました。場合によっては、視覚化のために、最終的な等方性の融合データセットを YZ 方向に沿って FIJI で再スライスして、サンプルの冠状ビューを提供しました。 Mosaic 16 スキャンと Mosaic 4 スキャンの全体的なダウンサンプリング時間は、32 RAM、Intel(R) Xeon(R) CPU E5-1650 v3 @ 3.50 GHz、および 10 HDD ストレージを搭載した PC ワークステーションで 12 時間かかります。さらに、Mosaic 0.5 の場合、ダウンサンプリングは必要ありません。 BigStitcher PlugIn を使用した合計ステッチ時間は、Mosaic 16 スキャンの場合は約 1 時間、Mosaic 4 スキャンの場合はそれぞれ約 2 時間かかります。 Mosaic 0.5 の場合、BigStitcher でのステッチ時間は約 3 日必要です。

ボリュームスタックの 3D 視覚化とセルカウントは、arivis Vision4D ソフトウェア (バージョン 3.4.0) を使用して実行されました。この目的のために、人間の脳領域 V2 での Mosaic 0.5 取得からの、すべての皮質層をカバーする単一スタックが使用されました。傾き補正、ステッチ、および再スライスされたスタックは、Vision4D の自動パイプラインで処理されました。生データは最初に形態フィルターオプションでフィルター処理され、細胞は「ブロブファインダー」セグメンテーション方法でセグメント化されました。層ごとの細胞数を得るために、皮質層と白質は、ボリューム全体にわたってポリゴン選択ツールを使用して手動でセグメント化されました。層IIIは、顕著な密度および細胞サイズの違いに基づいて、2つの副層IIIaおよびIIIbに分割された(例えば、層IIIbに現れる大きな錐体ニューロン)。次に、2 番目のパイプラインを適用して、手動でセグメント化されたレイヤーに基づいてコンパートメントを作成しました。これには、レイヤーセグメントの境界内に完全に含まれ、サイズが 125 µm3 を超えるセルセグメンテーションパイプラインからのセグメント化されたオブジェクトのみが含まれます。これらの区分化されたセグメントから得られた特徴は、itemized.csv テーブルに抽出されました。

低解像度のモザイク 16 およびモザイク 4 データセットの等方解像度を視覚化するために、FIJI33 でデータを再スライスし、各軸の MIP を作成することで直交ビューが作成されました。ビデオは FIJI と Vision4D の両方で作成されました。図は biorender (https://www.biorender.com) で作成されました。

自動セルセグメンテーションパイプラインを検証するために、同じデータセットに対して手動セルカウントを実行しました。データボリュームは、カスタムメイドの Python スクリプトを使用して Vision4D 環境でスタックの深さ全体に広がる 100 × 100 µm のグリッドに分割されました。続いて、乱数発生器として MATLAB (R2015b、MathWorks Inc.) の「randi」関数を使用して、10 個の平面と平面ごとに 5 つの異なる ROI が擬似ランダムに選択されました。 ROI境界内に完全に含まれる細胞、または100×100μmボックスの左および/または下の境界と交差する細胞のみを考慮して、各ROI内の細胞を手動で数えました（補足図3A）。データ分布のヴァイオリンプロットは、Bechtold (2016; https://doi.org/10.5281/zenodo.4559847) によるスクリプトを使用して、手動でカウントされたセル、フィルターされていない「ブロブファインダー」セグメンテーション結果、および125μm3より大きいセグメントのみを含むフィルタリングされた結果（「フィルタリングされた細胞体」;補足図5b）。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

生の顕微鏡データは、ローカルの教員サーバーに保存されます。人間の脳の検証と収縮測定の数値ソースデータを補足データ 1 および 2 に示します。他のすべてのデータは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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データボリュームを 100 × 100 µm のグリッドに分割するための Vision4D 環境用のカスタム Python スクリプトをご提供いただいた Maurizio Abbate (Arivis AG) に感謝します。さらに、技術的なアドバイスと ct-dSPIM の光学レイアウトを図 9 に提供してくださった Jon Daniels 博士 (Applied Scientific Instrumentation) に感謝します。このプロジェクトは、オランダ科学財団 (NWO) の人材プログラム Veni AES 2020 助成金によって部分的に資金提供され、シュース博士に授与されました (ファイル番号: 18139)。 Roebroeck 教授は、ERC Starting Grant (MULTICONNECT、#639938) およびオランダ科学財団 (NWO) VIDI Grant (#14637) によって支援されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Anna Schueth、Sven Hildebrand。

マーストリヒト大学 (UM)、マーストリヒト、オランダ、心理・神経科学学部認知神経科学科

アンナ・シュース、スヴェン・ヒルデブランド、シュバーティ・セングプタ、アンネマリー・キースリング、マイケル・カパルボ、アラード・ローブロック

マーストリヒト大学医療センター（MUMC+）病理学部、マーストリヒト、オランダ

イリーナ・サマルスカ & アクセル・ツア・ハウゼン

マーストリヒト大学 (UM) 解剖学部、マーストリヒト、オランダ

アンドレアス・ヘルラー

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AS はすべてのライトシート顕微鏡実験を実施し、ct-dSPIM 顕微鏡をメンテナンスしながら実行し、プロトタイプの共同開発に取り組みました (米国オレゴン州オイゲンの Applied Scientific Instrumentation、ASI と共同)。 SH はサンプル前処理、光学的透明化を実行し、FFPE-MASH プロトコルを開発しました。 SH と AS は数値と分析を作成しました。 SS はイメージングチャンバーの 3D プリントを支援しました。 AK はラボ支援 (光学的クリアリングと画像取得) を提供しました。 AH は人間の脳組織と人体解剖学に関する専門知識を提供しました。 IS と AzH はこのプロジェクトの病理学者であり、前立腺がんに関する資料と前立腺がんに関する専門知識を提供し、患者の資料のグリーソンスコアによる等級付けを行いました。 AR は研究、ct-dSPIM 顕微鏡プロトタイプの共同開発を設計し、監督を行いました。 MCは共同監修を行いました。 AS、SH、AR、MC が論文を執筆しました。すべての著者が論文を読み、コメントし、編集しました。

Anna Schueth または Alard Roebroeck への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Ludovico Silvestri と他の匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Chao Zhou と Karli Montague-Cardoso。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Schueth, A.、Hildebrand, S.、Samarska, I. 他光学的に除去された非常に大規模な人間の脳および前立腺組織サンプルの効率的な 3D ライトシートイメージング。 Commun Biol 6、170 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04536-4

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受信日: 2022 年 7 月 26 日

受理日: 2023 年 1 月 26 日

公開日: 2023 年 2 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04536-4

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